Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Als chronische demyelinisierende Erkrankung des ZNS betrifft MS etwa 2,5 Millionen Menschen weltweit und es fehlt an kurativen Behandlungen¹. Es gilt auch als eine Autoimmunerkrankung, bei der Myelin-Antigen-spezifische T-Lymphozyten eine Entzündungsreaktion auslösen und zu Demyelination und Axonalverletzungen im ZNS²führen. Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) wurde weit verbreitet verwendet, um pathogene Mechanismen von MS als klassisches Autoimmun-Demyelination-Krankheitsmodell in CNS³zu untersuchen. Es gibt zwei Möglichkeiten, EAE zu induzieren: eine besteht darin, EAE aktiv durch Immunisierung von Tieren mit Myelinkomponenten zu induzieren, eine andere ist der Adoptivtransfer durch Übertragung enzephalitogener T-Zellen in Rezeptor^2,4,5. Die Anfälligkeit für EAE unterscheidet sich in verschiedenen Tierstämmen⁶. Bei C57BL/6-Mäusen induziert Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) 35–55-Herausforderung eine monophasische Erkrankung mit umfangreicher Demyelination und Entzündung im ZNS, die häufig in Experimenten mit gengezielten Mäusen verwendet wird⁷.

Die Erzeugung von Myelin-spezifischen reaktiven T-Zellen ist für das Auftreten und die Entwicklung von Krankheiten bei EAE erforderlich und ist ein immunologisches Zeichen von EAE und MS. Aktivierte autoreaktive T-Lymphozyten überqueren die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in das gesunde ZNS und initiieren EAE-Krankheit. Wenn MOG 35–55 Ag angetroffen wird, induzieren diese T-Lymphozyten Entzündungen und die Rekrutierung von Effektorzellen in das ZNS, was zu Demyelination und Axonzerstörung^8,9führt. Im EAE-Modell gibt es genügend Hinweise darauf, dass neuroantigenspezifische CD4⁺ T-Zellen Neuroinflammation und Pathologie^3,10initiieren und aufrecht erhalten können. Je nach den wichtigsten produzierten Zytokinen wurden CD4⁺ T-Lymphozyten in verschiedene Teilmengen eingeteilt: Th1 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interferon-γ), Th2 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interleukin 4) und Th17 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interleukin 17). Es wird angenommen, dass die Aktivierung von Th1- und Th17-Zellen zur Induktion, Wartung und Regulierung der entzündlichen Demyelination bei EAE und MS beiträgt, indem sie die Effektor-Zytokine IFN-γ und IL-17 sezernieren, die in der Lage sind, Makrophagen zu aktivieren und Neutrophile an den entzündlichen Stellen zu rekrutieren, um die Läsionen zu beschleunigen¹¹.

Da autoreaktive T-Zellen die BBB in das ZNS kreuzen und die Entwicklung von Krankheiten bei MS und EAE induzieren, ist es sehr wichtig, T-Zellen im ZNS zu analysieren. Es gibt jedoch nur sehr wenige etablierte Protokolle für die Isolierung von Lymphozyten aus dem ZNS¹². Daher wurde eine Methode entwickelt, die für die Isolierung mononukleantin Zellen aus dem Gehirn und die Analyse von T-Lymphozyten mit den Markern CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g und IL-17 für die Durchflusszytometrie optimiert ist. Die Methode verwendet MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra und Pertussis Toxin Working Solution (PTX), um ein aktives Immunisierungsmodell von EAE bei Mäusen zu induzieren. Anschließend werden mechanische Trenn- und Dichtegradientenzentrifugationsmethoden zur Isolierung von Mononuklezellen von ZNS eingesetzt. Schließlich wird eine optimierte Flusszytometrie-Gating-Strategie verwendet, um T-Lymphozyten und Teilmengen aus dem Gehirn zu identifizieren, indem mehrere Marker gefärbt werden.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Tierausschuss der School of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University, genehmigt.

1. Herstellung der Materialien

1. Verwenden Sie die MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK-Sequenz von MOG35–55, um das lyophilisierte Peptid aus kommerziellen Quellen zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Reinheit des Peptids >95% beträgt. 10 mg/ml MOG-Stammlösung in phosphatgepufferter Saline (PBS) vorbereiten und bei -20 °C lagern.
2. Bereiten Sie eine 4 mg/ml-Stammlösung von M. tuberculosis H37 Ra vor, indem Sie eine 100 mg Tube M. tuberculosis H37 Ra in 25 ml Complete Freund es Adjuvant (CFA) und Mischen. Lagern Sie die Lagerlösung bei -20 °C.
3. Bereiten Sie 1 ng/L Pertussis Toxin Working Solution (PTX) vor, indem Sie 50 g PTX in 50 ml PBS einteilen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bei -20 °C auf.
4. Speichern Sie alle Antikörper (z. B. FITC Anti-Maus-CD3, PE/Cy7 Anti-Maus-CD4, PerCP/Cy5.5 Anti-Maus-CD11b, Alexa Fluor700 Anti-Maus-CD45.2, PE Anti-Maus IL-17A und APC Anti-Maus IFN-γ) bei 4 °C.
5. Machen Sie den Flow Cytometry Staining (FCS) Buffer, indem Sie 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1% fetales Rinderserum (FBS) in 500 ml PBS hinzufügen.

2. Gehäuse von C57BL/6 Mäusen

1. Verwenden Sie weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8–12 Wochen.
2. C57BL/6J-Mäuse mindestens 7 Tage vor der Injektion ankliman.
3. Hausmäuse in einer Tieranlage unter pathogenfreien Bedingungen bei konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit in einem 12 h Licht/Dunkel-Zyklus und bieten freien Zugang zu Wasser und Standard-Pelletfutter.

3. Immunisierung von C57BL/6 Mäusen

1. Lassen Sie alle Lagerlösungen für 15 min bei Raumtemperatur (RT), um eine vollständige Rehydrierung zu gewährleisten.
2. Verdünnen Sie 300 l DER MOG-Peptid-Stammlösung mit 700 l PBS zur Herstellung einer 3 mg/ml Arbeitslösung.
3. 1 ml M. tuberculosis H37 Ra-Stammlösung und 1 ml MOG35-55-Peptide-Arbeitslösung in separate 10 ml Spritzen geben und dann einen Vier-Wege-Stopphahn verwenden, um mindestens 10 min zu emulgieren. Stellen Sie eine vollständige Emulgierung vor der Injektion sicher.
4. Anästhesisieren Sie Mäuse auf dem Höhepunkt der EAE mit einer intraperitonialen Injektion von 1% Natriumpentobarbital (50 mg/kg).
5. Mit einer 1 ml Spritze können Sie Mäuse mit 100 l einer MOG 35–55/CFA-Emulsion (300 g/200 l) an zwei Stellen subkutan injizieren, beide am Rücken in der Nähe des Halses. Subkutan einjizieren Sie Kontrollmäuse mit 200 L PBS.
6. Am selben Tag (Tag 0) und am Tag 2 nach der Immunisierung (PI) injizieren Intraperitoneal Mäuse mit 200 L von 1 ng/L PTX-Arbeitslösung. Intraperitoneal injizieren Kontrollmäuse mit 200 L PBS.
7. Übertragen Sie die Mäuse mit einem wärmenden Pad in ihren heimischen Käfig.
8. Untersuchen und benoten Sie alle Mäuse jeden Tag nach der Injektion in geblendeter Weise auf die in Tabelle 1^11,13gezeigten neurologischen Symptome. Euthanisieren Sie die Tiere, wenn die Werte schlechter als Grad 4 sind.
9. Zeichnen Sie die Gewichtsänderungen während des Krankheitsverlaufs auf. Dies ist eine wertvolle zusätzliche Maßnahme für die Krankheitsaktivität im EAE-Modell^11,13.
10. Fügen Sie den ersten Tag der klinischen Symptome für einzelne Mäuse hinzu und dividieren Sie durch die Anzahl der Mäuse in der Gruppe; das Ergebnis ist der Beginn. Fügen Sie den ersten Tag des maximalen EAE-Scores für einzelne Mäuse hinzu und dividieren Sie durch die Anzahl der Mäuse in der Gruppe; das Ergebnis ist der Höhepunkt.

4. Einzelzellige Suspensionspräparation aus dem Gehirn

1. Verdünnungsdichte Gradient mittel im 9:1 Verhältnis mit PBS in einem 15 ml konischen Rohr, um eine endgültige 100% Lösung zu erzielen.
2. Anästhesisieren Sie Mäuse auf dem Höhepunkt der EAE mit einer intraperitonialen Injektion von 1% Natriumpentobarbital (50 mg/kg) und perfuse intrakardinativ mit 20 ml steriler eiskalter PBS. Erreichen Sie dies, indem Sie mit einer 20 ml Spritze langsam und stetig PBS in den linken Herzschlitz injizieren und das rechte Atrium öffnen.
3. Schneiden Sie den Schädel vorsichtig von der Nase bis zum Hals, dann entfernen Sie das Gehirn aus der Schädelbox in 10 ml RPMI in 50 ml konische Röhren. Mischen Sie gut, um anhandigen roten Blutkörperchen zu entfernen. Entfernen Sie dann das Medium durch Aspiration und fügen Sie 10 ml RPMI hinzu.
4. Legen Sie das Gehirn und Medium in eine 100 mm Schale. Fein mit einer Rasierklinge hacken.
5. 6 ml von der Schale auf einen eiskalten 7 ml Sinterglas-Homogenisator mit einer sauberen Pipette übertragen. Vermeiden Sie es, große Mengen an Gewebe in der Pipette zu lassen. Ein kleiner Betrag ist unvermeidbar.
6. Schleifen Sie das Gehirn mit dem "lockeren" Kolben des Stößels zuerst, dann verwenden Sie den "dichten" Kolben, bis die Suspension homogen ist, und gießen Sie in ein vorgechilltes 15 ml kegelförmiges Rohr und halten Sie auf Eis.
7. Nachdem alle Proben homogenisiert sind, schätzen Sie das Volumen. Stellen Sie die Lautstärke mit RPMI auf 7 ml ein. Dann 3 ml eiskalte 100% Kellermembranmatrix in ein gekühltes 15 ml konisches Zentrifugenrohr geben und 7 ml des Gehirnhomogenats hinzufügen, um ein endgültiges 30%-Dichtegradientenmedium zu ergeben. Mischen Sie durch Inversion ein paar Mal. Wirbel nicht.
8. Um eine scharfe Schnittstelle zu gewährleisten, fügen Sie vorsichtig und langsam 1 ml 70% UnterlagedichteGradientenmedium in RPMI mit einer 3 ml Pipette hinzu.
9. Zentrifuge bei 800 x g für nur 20 min bei 4 °C. Stellen Sie die Beschleunigung auf 1 und die Verzögerung auf 0 ein. Nach der Zentrifugation, aspirieren fast die gesamte Top-Phase, vorsichtig sein, um das Myelin an der Spitze vollständig zu entfernen (Abbildung 1).
10. Entfernen Sie die Schnittstelle in ein neues 15 Zentrifugenrohr. Stellen Sie die Lautstärke mit RPMI auf 10 ml ein.
11. Zentrifuge bei 500 x g für 10 min. Nach der Zentrifugation den Überstand ansaugen. Setzen Sie das Pellet in einem FSC-Puffer (Flow Cytometry Staining) in Höhe von 200 l aus. Die Pellets sind dann bereit, für FACS zu färben.

5. Flusszytometrische Analyse einzelner Zellen aus dem Gehirn

1. Verwenden Sie ein Hämozytometer und ein Mikroskop, um die Zellen zu zählen. Fügen Sie 10 l der Zellen zu 10 l Trypanblau hinzu, mischen Sie sie gut, und legen Sie 10 l auf ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Berechnen Sie dann die Anzahl der lebenden Zellen pro Mikroliter unter einem invertierten Mikroskop (z. B. Olympus Inverted Microscope).
2. Aliquot etwa 2 x 10⁶ der Zellen in RPMI in einem einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte.
3. 500x Zellstimulationscocktail plus Proteintransporthemmer in die Brunnen geben.
4. Inkubieren Sie die Platte im Inkubator bei 37 °C für 4 h.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 100 l FCS Buffer wieder auf.
6. Die Zellen mit Anti-Maus-CD16/CD32-Fc-Block (1:33) 10 min bei 4 °C voranstellen, bevor Sie unspezifische Fc-vermittelte Wechselwirkungen blockieren.
7. Flecken Zelle Oberflächenmarker ohne Waschen. Fügen Sie Anti-Maus-CD45.2 (1:200), Anti-Maus-CD11b (1:200), Anti-Maus-CD3 (1:200) und Anti-Maus-CD4 (1:200) Antikörper hinzu.
   HINWEIS: Um positive und negative Tore zu bestimmen, sollten eine Fluoreszenz minus eins (FMO) für jede Farbe und ein Isotyp-Kontrollantikörper gebeizt werden.
8. Die Platte mindestens 30 min bei 4 °C oder auf Eis bebrüten. Vor Licht schützen.
9. Waschen Sie die Zellen, indem Sie FCS Buffer hinzufügen. Verwenden Sie 200 l/well für Mikrotiterplatten. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand.
10. Fügen Sie jedem Bohrkörper 200 L intrazellulären (IC) Fixierungspuffer hinzu, um die Zellen zu fixieren. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig in der Lösung resuspendiert sind.
11. Inkubieren Sie 30–60 min bei RT. Schützen Sie vor Licht.
12. Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 x g bei RT für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
13. Fügen Sie jedem Bohrplatz 200 l 1x Permeabilisationspuffer hinzu und zentrifugieren Sie die Proben bei RT für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
14. Setzen Sie das Pellet in Restvolumen wieder auf und stellen Sie das Volumen mit 1x Permeabilisationspuffer auf ca. 100 l ein.
15. Fügen Sie Anti-Maus-Antikörper IL-17A (1:200) und Anti-Maus-IFN-g (1:200) zum Nachweis intrazellulärer Antigene an Zellen hinzu.
16. Mindestens 30 min bei 4 °C inkubieren. Vor Licht schützen.
17. Fügen Sie jedem Bohrplatz 100 l 1x Permeabilisationspuffer hinzu und zentrifugieren Sie die Proben bei RT für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
18. Setzen Sie die gebeizten Zellen in 100 l Durchflusszytometrie-Färbungspuffer aus.
19. Analysieren durch Durchflusszytometrie.
    HINWEIS: Die Laser- und Kompensationseinstellungen am Durchflusszytometer werden angepasst, die Proben auf das Zytometer gelegt und alle Ereignisse gemäß den Empfehlungen des Herstellers aufgezeichnet.

6. Datenanalyse

1. Tor-Singlets mit FSC-A gegen FSC-H und SSC-A gegen SSC-H.
2. Gate-Live-Zellen mit FSC-A und SSC-A basierend auf der Größe.
3. Als Nächstes identifizieren Sie die Leukozyten, mit Ausnahme der Monozyten, indem Sie auf CD45⁺ CD11b^- Zellen.
4. Identifizieren Sie dann die CD4 T-Lymphozyten, indem Sie auf CD3+CD4+-Zellen gekreuzt werden.
5. Schließlich identifizieren Sie die Submengen Th1 und Th17, indem Sie IFN-γ+-Zellen und IL-17+-Zellen getrennt veranlassen, und bestimmen Sie die positiven und negativen Populationen mithilfe von Isotypkontrollen und FMO.

Nach der Immunisierung von C57BL/6-Mäusen wurden alle Mäuse täglich auf neurologische Symptome gewogen, untersucht und eingestuft. Der repräsentative klinische Verlauf des EAE sollte zu einer Krankheitskurve führen, wie in Abbildung 2A dargestellt, und zu einer Veränderung des Körpergewichts in der Maus, wie in Abbildung 2Bdargestellt. C57BL/6 Mäuse, die mit MOG35-55 immunisiert wurden, begannen in der Regel um tag 10–12 Krankheitssymptome zu entwickeln und erreichten den Höhepunkt der Krankheit um Tag 15–21 nach aktiver Immunisierung (Abbildung 2A). Die Gewichtsveränderung war ein wertvoller Indikator im EAE-Modell. Vor dem Auftreten der Krankheit nahm das Körpergewicht immunisierter Mäuse allmählich zu, dann verringerte sich in der Regel in Beziehung zu den zunehmenden Krankheitssymptomen. Auf dem Höhepunkt der EAE zeigten Mäuse auch das niedrigste Körpergewicht (Abbildung 2B). Dann erholte sich das Körpergewicht leicht, da die klinischen Symptome abnahmen. Allerdings erholten sich die Mäuse in der Regel nicht vollständig. C57BL/6-Mäuse entwickelten eine monophasische chronische Krankheitspathologie nach MOG35–55 Herausforderung (Abbildung 2A).

Der klinische Schweregrad von EAE ist direkt mit der autoreaktiven T-Zellaktivierung14verbunden. Neuroantigen-spezifische CD4+ T-Zellen sind in der Lage, Neuroinflammation und Pathologie in EAE3zu induzieren und zu erhalten. Die typischen Merkmale von CD4+T-Zellen in der Spitze des EAE sind in Abbildung 3dargestellt. Darüber hinaus wurde der Anteil der Th1- und Th17-Teilmengen an enzephalitogenen Zellen, die die wichtigsten pathogenen Zellen sind, die EAE vermitteln, durch Durchflusszytometrie analysiert. Nach der Trennung einer einzelzelligen Suspension vom Gehirn wurden die Zellen mit CD45-, CD11b-, CD3-, CD4-, IFN-γ- und IL-17-Antikörpern gefärbt, die durch T-Lymphozyten exprimiert werden. FSC-A vs. FSC-H und SSC-A vs. SSC-H wurden verwendet, um Singlets zu gaten (Abbildung 3A, B), dann FSC-A vs. SSC-A wurden verwendet, um lebende Zellen basierend auf Größe und Granularität zu gaten (Abbildung 3C). Danach wurden CD45+ CD11b- Zellen abgezäutt, um Leukozyten ohne Monozyten zu identifizieren (Abbildung 3D). Dann wurde das Tor auf CD3+CD4+ gesetzt, um CD4+ T Lymphozyten zu identifizieren (Abbildung 3E). Schließlich wurden IFN-γ und IL-17 verwendet, um Th1- und Th17-Teilmengen zu identifizieren und die funktionelle Wirkung nach Effektorzytokinen zu bewerten (Abbildung 3F). Nach der klinischen Schwere der Krankheit zeigten repräsentative Ergebnisse, dass IFN-γ-produzierende Th1- und IL-17-produzierende Th17-Zellen in den enzephalitogenen Zellen von EAE-Mäusen signifikant angestiegen sind.

Tabelle 1: Klinisches Bewertungssystem. C57BL/6-Mäuse wurden mit dem MOG35–55-Peptid immunisiert. Dann wurden neurologische Symptome aufgezeichnet. Ein 5-Punkte-Scoring-System wurde verwendet, um den Schweregrad von EAE zu bewerten.

Abbildung 1: Schematic des Percoll-Gradienten-Setups zur Isolierung mononukleantinzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentativer Kurs des EAE. EAE wurde bei C57BL/6-Mäusen durch Injektion von MOG35–55 induziert, wie im Protokoll beschrieben. Der klinische Score (A) und die Veränderung des Körpergewichts (B) wurden bei diesen Mäusen bestimmt. Die Daten werden als mittelwert± SEM dargestellt; n = 8 für jede Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse von Lymphozyten im Gehirn. Eine einzellige Suspension wurde in der Spitze der EAE aus dem Gehirn isoliert. Die Gating-Strategie von T-Lymphozyten wird gezeigt. Singlets wurden als FSC-A gegen FSC-H und SSC-A vs. SSC-H (A,B) abgegrenzt. Lebende Zellen wurden als FSC-A vs. SSC-A (C) abgegrenzt. Leukozyten ohne Monozyten wurden als CD45+ CD11b- (D) abgesperrt. CD4+ T Lymphozyten wurden als CD3+CD4+ (E) abgegrenzt. Th1 und Th17-Teilmengen wurden als IFN-γ+ und IL-17+ (F) abgesperrt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.