Methodenartikel

Flussmittelbasierter Assay zur Identifizierung von Autophagie-Modulatoren bei Osteoarthritis

DOI:

10.3791/61078

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8. Juli 2020

 ,  ,  ,  , 
1Grupo de Biología del Cartílago, Servicio de Reumatología, Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, 2Biofarma Research Group, Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Artikel wird die Überwachung des Autophagieflusses zur Identifizierung neuer Moleküle durch zellbasiertes Bildgebungsscreening beschrieben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autophagie ist ein zentraler Mechanismus zur Regulierung der Homöostase. Veränderungen der Autophagie tragen zu altersbedingten Krankheiten bei. Phänotypische Methoden zur Identifizierung von Regulatoren der Autophagie könnten für die Identifizierung neuartiger Therapeutika verwendet werden. Dieser Artikel beschreibt einen zellbasierten bildgebenden Screening-Workflow, der entwickelt wurde, um den autophagischen Fluss unter Verwendung von LC3 als Reporter des autophagischen Flusses (mCherry-EGFP-LC3B) in menschlichen Chondrozyten zu überwachen. Die Datenerfassung wird mit einem automatisierten High Content Imaging Screening System-Mikroskop durchgeführt. Es wurde ein algorithmusbasiertes automatisiertes Bildanalyseprotokoll entwickelt und validiert, um Moleküle zu identifizieren, die den autophagischen Fluss aktivieren. Es wird über kritische Schritte, Erläuterungen und Verbesserungen gegenüber den aktuellen Autophagie-Überwachungsprotokollen berichtet. Physiologisch relevante phänotypische Screening-Ansätze zur Bekämpfung von Kennzeichen des Alterns können effektivere Wirkstoffforschungsstrategien für altersbedingte Muskel-Skelett-Erkrankungen ermöglichen.

Einleitung

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Viele chronische Krankheiten sind mit den Kennzeichen des Alterns verbunden, einschließlich einer defekten Autophagie1. Osteoarthritis (OA) ist die häufigste Gelenkerkrankung und hat einen großen Einfluss auf die Einschränkung der alltäglichen Aktivitäten in der alternden Bevölkerung, aber es gibt bisher weder präventive Maßnahmen noch krankheitsmodifizierende Behandlungen2.

Gelenkalterung und Arthrose sind mit Kennzeichen verbunden, die das Fortschreiten der Knorpeldegeneration definieren, einschließlich defekter Autophagie und Seneszenz 3,4. Die gezielte Autophagie im Muskel-Skelett-Gewebe kann dazu beitragen, therapeutische Innovationen für rheumatologische Erkrankungen zu finden 5,6. Die pharmakologische Modulation der Autophagie ist ein vielversprechender, relevanter Mechanismus für die Intervention in präklinischen Krankheitsmodellen7. Bei OA wurde die Aktivierung der Autophagie eingesetzt, um Gelenkfunktionsstörungen zu verhindern8. Methoden zur Überwachung der Autophagie, die auf robusten, reproduzierbaren Protokollen basieren, die eine quantitative Analyse ermöglichen, können verwendet werden, um neuartige Wirkstoffe zu identifizieren und die pharmakologische Ausrichtung auf krankheitsrelevante Kennzeichen des Alterns zu erleichtern.

Der Autophagiefluss spiegelt die Abbauaktivität wider und ist ein relevantes Maß zur Identifizierung neuer Moleküle, die die Autophagie aktivieren9. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, die entwickelt wurde, um den autophagischen Fluss durch Messung der autophagischen Abbauaktivität unter Verwendung einer Autophagie-Reporterzelllinie in humanen Chondrozyten (TC28a2) zu bestimmen. Die transiente mCherry-EGFP-LC3-Expression ermöglicht die gleichzeitige Überwachung der Autolysosomenbildung und des Abbaus, indem sie die Unterschiede in der pH-Empfindlichkeit zwischen GFP- und mCherry LC3-Signalen in den Lysosomen lebender Zellen quantifiziert10.

Die Anpassung dieser durchflusszytometrischen Methode an ein stabiles Expressionsbildgebungsüberwachungssystem in lebenden Chondrozyten könnte die Identifizierung von Molekülen ermöglichen, die den autophagischen Fluss im Kontext der Knorpelbiologie aktivieren.

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Protokoll

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1. Erzeugung einer Autophagie-Reporterzelllinie aus immortalisierten menschlichen Chondrozyten

HINWEIS: Die Erzeugung einer Autophagie-Reporterzelllinie durch stabile Transfektion von pBABE-mCherry-GFP-LC3 durch Etablierung einer quantitativen Durchflusszytometrie-Auslesung wurde zuvor beschrieben11. Bei der retroviralen Transfektion wurden zwei Zelllinien verwendet: HEK 293-T17 während des Kotransfektionsprozesses und T/C28a2 im Infektionsschritt.

  1. Kotransfektionsprozess
    1. Bereiten Sie das Wachstumsmedium für HEK 293-T17-Zellen vor: 500 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), 10 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S). Lagern Sie das Wachstumsmedium bei 4 °C und erwärmen Sie es vor jedem Gebrauch auf 37 °C.
    2. 1 x 106 HEK 293-T17 Zellen pro Vertiefung in 100 mm Zellkulturplatten aussäen, bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren und sicherstellen, dass sie ~75 % Konfluenz haben, bevor der Cotransfektionsprozess beginnt.
    3. Entfernen Sie das Kulturmedium, spülen Sie es mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ab und fügen Sie 8 mL EMEM mit 2 % FBS und 1 % P/S hinzu.
    4. In ein konisches Röhrchen 10 μg, 3 μg und 7 μg pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV geben. G- bzw. pCL-Eco-Plasmide. Fügen Sie dann 200 μL 1x reduziertes Serummedium hinzu (Materialtabelle). Das Transfektionsreagenz (Table of Materials) wird als nicht-liposomale Mischung von Lipiden zugegeben, um ein Verhältnis von 1:3 zu erhalten (1 μg DNA : 3 μg Transfektionsreagenz; Endvolumen = 60 μl).
      HINWEIS: Für jede 10 cm große Zellplatte, die transfiziert werden soll, werden insgesamt 20 μg Mischung hergestellt.
    5. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Transfektionsmischung vorsichtig tropfenweise in die Verpackungszellen HEK 293-T17 überführen. Die Zellen werden mindestens 48 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bevor sie durch Fluoreszenzmikroskopie auf grüne und rote Proteinexpression überprüft werden.
      HINWEIS: Unter diesen Bedingungen sollten mehr als 75 % der Zellen positiv für Fluoreszenz sein. Stellen Sie sicher, dass die Transfektionseffizienz hoch ist (z. B. sind mehr als 75 % der Zellen positiv). Verwenden Sie hochwertige Plasmid-DNA (z. B. überwiegend supercoiled und frei von genomischer DNA, RNA und Proteinen; hochkonzentriert; frei von Endotoxinen und Salzen) sowie hochwertige Zellkulturen (z. B. homogene, Low-Passage, Monolayer, transfiziert in der exponentiellen Wachstumsphase, frei von Mykoplasmen).
  2. Bereiten Sie am selben Tag der Kotransfektion T/C28a2-Chondrozyten vor.
    1. Bereiten Sie das T/C28a2-Zellwachstumsmedium vor: 500 ml modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco, 10 % fötales Kälberserum (FCS) und 1 % P/S. Lagern Sie das Wachstumsmedium bei 4 °C und erwärmen Sie es vor jedem Gebrauch auf 37 °C.
    2. 2 x 105 T/C28a2 Chondrozyten in zwei 6-Well-Multiplatten säen und 48 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
  3. Retroviraler Infektionsprozess
    1. Aspirat-Kulturmedium aus retroviralen Verpackungszellen HEK 293-T17, die aus Schritt 1.1.5 gewonnen wurden. Spülen Sie 1x mit 4 mL HBSS und aspirieren Sie HBSS.
    2. Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu und warten Sie 2 Minuten bei 37 °C. Neutralisieren Sie Trypsin durch Zugabe von 6 ml HEK 293-T17-Kulturmedium und übertragen Sie Zellen und Medium in konische 15-ml-Röhrchen.
    3. Zellen bei 400 x g für 5 min zentrifugieren. Der Überstand wird durch eine 0,45 μm-Membran in einen Sterilfilter übertragen.
    4. Aspirieren Sie das T/C28a2-Chondrozyten-Kulturmedium aus den 6-Well-Multiplatten. Infizieren Sie T/C28a2-Zellen durch Zugabe von 2 ml Virussuspension (Schritt 1.3.3) pro Vertiefung in 6-Well-Multiplatten. Verwenden Sie eine Vertiefung zur Kontrolle (d. h. nicht transfizierte Zellen) und fügen Sie 2 ml T/C28a2-Zellwachstumsmedium anstelle der Virussuspension hinzu.
    5. 48 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
  4. Um den Selektionsprozess durchzuführen, verwenden Sie eine Antibiotika-Selektion an transfizierten Zellen, um nicht transfizierte Zellen zu eliminieren und eine homogene Zellpopulation zu erhalten.
    HINWEIS: Der retrovirale Vektor pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B bietet eine Antibiotikaresistenz von Säugetieren gegen Puromycin, was die Auswahl einer stabilen Zellkultur nach der viralen Transfektion ermöglicht. Kill-Kurven für die optimale Puromycinkonzentration von T/C28a2-Chondrozyten sollten im Voraus eingerichtet werden, um die geeigneten Bedingungen für die Auswahl der Zellklone zu schaffen, die das Transgen mit hohen Expressionsniveaus tragen.
    1. Bereiten Sie T/C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B stabiles Zelllinienwachstumsmedium vor: 500 ml DMEM, 10 % FCS, 1 % P/S und 2,5 μl/ml Puromycin. Medium bei 4 °C lagern und vor jedem Gebrauch auf 37 °C erwärmen.
    2. Wechseln Sie das Medium. Für jede 6-Well-Multiplatte das Kulturmedium aspirieren, 1x mit 2 mL HBSS spülen und aspirieren. 2 ml Medium zugeben und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren. Dies ist der Beginn des Auswahlverfahrens.
    3. Tauschen Sie das Medium alle 2 Tage aus und beobachten Sie abgestorbene Zellen und Puromycin-resistente Zellpopulationen. Vergleichen Sie die Ergebnisse mit den nicht transfizierten Kontrollzellen, die nicht resistent gegen Puromycin sind und absterben.
  5. Um mit der klonalen Selektion zu beginnen, stellen Sie sicher, dass die monoklonalen Populationen gewachsen sind. Für jede 6-Well-Multiplatte:
    1. Geben Sie 200 μl Medium pro Vertiefung in eine 96-Well-Multiplatte.
      HINWEIS: Jede einzelne Zelle, die aus der 6-Well-Multiplate ausgewählt wird, wird in einzelnen Wells der 96-Well-Multiplate plattiert.
    2. Verwenden Sie ein Mikroskop, um jede monoklonale Population in den 6-Well-Multiplatten zu identifizieren. Kolonien, die aus einzelnen Zellen gebildet werden, können beobachtet werden.
    3. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus 6-Well-Multiplatten, spülen Sie 1x mit 2 mL HBSS und aspirieren Sie HBSS.
    4. Fügen Sie jeder monoklonalen Population 10 μl Trypsin hinzu, um einzelne Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Multiplatten zu übertragen. 48 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
  6. Ersetzen Sie das Medium nach 48 Stunden durch 100 μl frisches Medium pro Vertiefung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sich durch die Ausdehnung einzelner Zellen Kolonien bilden.
  7. Sobald sich eine einzelne Zelle vertieft hat, wird jede monoklonale Population in einzelnen Vertiefungen von 24-Well-, 6-Well- und 100-mm-Zellkulturplatten plattiert.
  8. Generieren Sie eine stabile monoklonale Zelllinie mit einer Einzelzellsortiermethode.
    1. Aspirieren Sie Kulturmedium aus 100 mm Zellkulturplatten. 1x mit 8 mL HBSS spülen und aspirieren.
    2. 2 ml Trypsin auf jede Platte geben und 2 Minuten bei 37 °C inkubieren. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 8 ml Nährmedium hinzufügen.
    3. Die Zellen werden bei 252 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Geben Sie 4 ml HBSS zu jedem Zellpellet, resuspendieren Sie es vorsichtig und übertragen Sie es in Zytometrieröhrchen.
    4. Injizieren Sie jede Zellprobe in ein Durchflusszytometer (Table of Materials) mit Zellsortiertechnologie und trennen Sie die Zellen mit hoher grüner und roter Fluoreszenz.
    5. Übertragen Sie ausgewählte Zellen in konische 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie Zellen bei 252 x g für 5 Minuten. Geben Sie Zellpellet in einen T-25-Kolben mit 9 ml stabilem Zelllinien-Wachstumsmedium. Bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
      HINWEIS: Nach der Zellsortierung sollten drei monoklonale Populationen (Tabelle 1) erhalten werden.
  9. Entfernen Sie nach 24 Stunden das Medium und fügen Sie 8 ml frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang alle 2 Tage, bis die Zellen die Konfluenz erreichen.
    HINWEIS: Zur Untersuchung des autophagischen Flusses können zwei Kontrollen verwendet werden: Rapamycin als Signalreferenz für einen hohen autophagischen Fluss und Chloroquin als Signalreferenz für einen niedrigen autophagischen Fluss. Eine 10 mM Rapamycin-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) und eine 30 mM Chloroquin-Stammlösung in H2O herstellen und bei -20 °C lagern. Um die beste monoklonale Population durch Testen der Expression mCherry und GFP auszuwählen, können zwei Methoden verwendet werden: Durchflusszytometrie (Schritt 1.10) oder High-Content-Fluoreszenzbildanalyse (Schritt 1.11).
  10. Durchflusszytometrie
    1. 2,5 x 105 Zellen pro Well jeder monoklonalen Population in 12-Well-Platten mindestens 24 Stunden vor der Behandlung in 1 ml stabiles Zelllinienwachstumsmedium säen und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
    2. Entfernen Sie am Tag der Behandlung das Medium und fügen Sie 1 ml stabiles Zelllinienwachstumsmedium hinzu, das mit 2 % FCS pro Vertiefung ergänzt wird. Geben Sie 10 μM Rapamycin und 30 μM Chloroquin mit 2 % FCS in das stabile Zelllinien-Wachstumsmedium und inkubieren Sie es 16 h bei 37 °C und 5 % CO2.
    3. Entfernen Sie das Medium, spülen Sie es mit 1 ml HBSS pro Vertiefung und saugen Sie es an.
    4. 500 μl Trypsin in jede Vertiefung geben, 1 min bei 37 °C inkubieren und die Reaktion durch Zugabe von 500 μl Nährmedium neutralisieren. Zellen abkratzen und in konische Röhrchen überführen.
    5. Die Zellen werden bei 252 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand aspiriert. Spülen Sie die Zellpellets mit 500 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Bei 252 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    6. Geben Sie 500 μl PBS hinzu, übertragen Sie die Zellen in Zytometrieröhrchen und injizieren Sie jede Probe in das Zytometriegerät. Sammeln Sie für jede Bedingung 10.000 Ereignisse.
    7. Um die monoklonale Population mittels Durchflusszytometrie auszuwählen, verwenden Sie einen 488-nm-Laser zur Anregung von EGFP und einen 633-nm-Laser für mCherry. Legen Sie dann ein Verhältnis von mCherry- und EGFP-Fluoreszenz fest, um die Zellpopulation mit hohem und niedrigem autophagischem Fluss auszuwählen.
  11. High-Content-Fluoreszenzbildanalyse
    1. Keimen Sie 4 x 103 Zellen jeder monoklonalen Population pro Well in 384-Well-Platten (schwarze Wand/durchsichtiger Boden) in Wachstumsmedium, ergänzt mit 10 % FCS, 1 % P/S und 2,5 μL/ml Puromycin. Vor der Behandlung 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
    2. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 10 μM Rapamycin und 30 μM Chloroquin in 50 μl stabiles Zelllinienwachstumsmedium hinzu, das mit 2 % FCS pro Vertiefung ergänzt wird. 16 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
    3. Entfernen Sie das Medium, spülen Sie es mit 50 μl HBSS pro Vertiefung und saugen Sie es an. Die Zellen werden 10 min lang bei 37 °C mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert. PFA entfernen und mit 50 μl HBSS pro Vertiefung spülen.
    4. Zur Identifizierung der Zellkerne wird 10 min lang bei 37 °C mit Hoechst 33342 (2,5 μg/ml) gefärbt. Aspirieren Sie den Farbstoff Hoechst 33342, spülen Sie mit 50 μl HBSS pro Vertiefung und fügen Sie 50 μl PBS pro Vertiefung hinzu.
    5. Führen Sie die Datenerfassung und Analyse des autophagischen Flusses durch, der mit der HTS-Plattform erhalten wurde, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
      HINWEIS: Die Kriterien für die Auswahl der monoklonalen Population basieren darauf, ob der autophagische Fluss mit Rapamycin bzw. Chloroquin zu- oder abnahm (Tabelle 1). Klone mit hoher mCherry- und GFP-Expression eignen sich besser für die genaue Quantifizierung des Autophagieflusses bei der Fluoreszenzbildanalyse mit hohem Gehalt.

2. Bildbasierter autophagischer Flux-Assay in lebenden Chondrozyten

HINWEIS: Nachdem Sie einen Klon ausgewählt haben, starten Sie den Assay, um den autophagischen Fluss zu quantifizieren.

  1. Mit einer tragbaren elektronischen 384-Kanal-Pipette säen Sie 4 x 103 Zellen des ausgewählten Klons (Schritt 1.11) pro Vertiefung in 384-Well-Platten (schwarze Wand/durchsichtiger Boden) in 50 μl stabilem Zelllinien-Wachstumsmedium, ergänzt mit 10 % FCS, 1 % P/S und 2,5 μl/ml Puromycin pro Well. Vor der Behandlung 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
  2. Bereiten Sie am Tag des Experiments eine Intervallplatte für die Zugabe von Verbindungen vor.
    1. Geben Sie ein Volumen jeder Verbindung/Steuerung und eines stabilen Zelllinienwachstumsmediums unter Verwendung der akustischen Liquid-Handling-Technologie bzw. einer elektronischen 384-Kanal-Pipette in die Intervallplatte, um eine Intervallkonzentration zu erhalten.
      HINWEIS: Die Kontrollen in diesem Assay umfassten stabiles Zelllinienwachstumsmedium, das mit 2 % FCS, 30 μM Chloroquin und 10 μM Rapamycin ergänzt wurde. Die Intervallkonzentrationen hängen von der gewünschten Endkonzentration ab. Zum Beispiel wurden in diesem Assay Chloroquin und Rapamycin in 50 μl stabiles Zelllinien-Wachstumsmedium pro Vertiefung gegeben, um eine Intervallkonzentration von 300 μM bzw. 100 μM zu erhalten.
    2. Saugen Sie mit einem Mikroplatten-Waschroboter automatisiert Medium von der Zellplatte ab und fügen Sie 45 μl stabiles Zelllinien-Wachstumsmedium hinzu, das mit 2 % FCS pro Vertiefung ergänzt wird.
    3. Übertragen Sie dann 5 μl pro Vertiefung von der Intervallplatte auf die Assay-Platte, um mit einer anderen automatisierten Liquid-Handler-Workstation eine Endkonzentration zu erhalten.
  3. Bei 37 °C und 5 % CO2 16 h inkubieren. Saugen Sie das Medium mit einem Mikroplatten-Waschroboter an.
  4. Fixieren Sie die Zellen mit 50 μl 4 % PFA pro Vertiefung für 10 Minuten bei 37 °C. Mit 50 μl HBSS pro Vertiefung waschen.
  5. Die Zellkerne werden 10 min lang bei 37 °C mit Hoechst 33342 (2,5 μg/mL) eingefärbt. Hoechst 33342 aspirieren und mit 50 μl HBSS pro Vertiefung spülen.
  6. Fügen Sie 50 μl PBS pro Vertiefung hinzu. Die Platte ist nun bereit zum Ablesen, zur Datenerfassung und zur anschließenden Analyse.
    HINWEIS: Dieses Protokoll ist für das Hochdurchsatz-Screening (HTS) beschrieben. Wenn jedoch nur wenige Verbindungen verwendet werden, können diese manuell und ohne automatische Instrumente hinzugefügt werden. Minimale Manipulation von Zellen und Überstand mit kalibrierten Liquid-Handling-Instrumenten und/oder elektronischen Pipetten ermöglicht die erfolgreiche Vorbereitung von Zellkultur-Monolayern für die Quantifizierung des Autophagieflusses durch High-Content-Fluoreszenzbildanalyse.

3. Datenerfassung und Analyse des autophagischen Flusses

  1. Verwenden Sie für die Datenerfassung ein High-Content-Screening-System (HCS) und ein automatisiertes Mikroskop, das eine automatisierte Bildaufnahme und -analyse durch einen Bildverarbeitungsalgorithmus ermöglicht.
  2. Um ein Akquisitionsprotokoll zu entwickeln, wählen Sie mehrere Kanäle und Expositionszeiten aus (Tabelle 2), um die Zellkerne und die Bildung von Autophagosomen und Autolysosomen während autophagischer Flussereignisse zu identifizieren.
  3. Sammeln Sie für jedes Well Bilder von vier Feldern, die die Well-Oberfläche bedecken, und in vier Stapeln ab 8 μm, die durch einen Arbeitsabstand von 0,2 μm getrennt sind. Nehmen Sie die Bilder mit einem 60-fach-Objektiv für eine detaillierte Zellbildgebung auf.
  4. Analysieren Sie die Daten mit der Bildanalysesoftware, die vom HCS-Mikroskop bereitgestellt wird. Um einen robusten Analyseprotokollalgorithmus für die Überwachung des Autophagieflusses zu entwickeln, wählen Sie die am besten geeignete Methode für die automatisierte Zellbildsegmentierung und für die spezifische Detektion der Speckles, die der LC3-Aktivierung entsprechen. Führen Sie die abschließende Analysesequenz durch, indem Sie Methoden, Zellsegmentierungsschritte und Quantifizierungsanweisungen hinzufügen, wie unten beschrieben:
    1. Klicken Sie auf den Baustein Kerne suchen , und wählen Sie den Kernfarbstoffkanal Hoechst 33342 aus. Wählen Sie Methode aus, und wählen Sie die Ausgabepopulation Nuclei aus.
    2. Klicken Sie auf den Baustein Zytoplasma suchen und wählen Sie den zytoplasmatischen Farbstoffkanal Fluorescein aus. Methode auswählen | Individueller Schwellenwert.
    3. Klicken Sie auf den Baustein Zytoplasma suchen (2) und wählen Sie den RFP für den zytoplasmatischen Farbstoffkanal aus. Methode auswählen | Individueller Schwellenwert.
    4. Klicken Sie auf den Baustein Population, und wählen Sie die Kerne der Studienpopulation aus. Wählen Sie die Methode Allgemeine Filter (Randobjekte entfernen) und wählen Sie die Ausgabepopulation Nuclei Inside Borders.
    5. Klicken Sie auf den Baustein "Spots suchen " und wählen Sie den spezifischen Markerkanal Fluorescein aus. Wählen Sie die Studienpopulation Nuclei Inside borders und dann die Studienregion Cytoplasma aus. Wählen Sie Methode aus, und wählen Sie die Ausgabepopulation Spots Inside Borders aus.
    6. Klicken Sie auf den Baustein Find Spots (2) und wählen Sie die spezifische Ausschreibung des Markierungskanals aus. Wählen Sie die Studienpopulation Nuclei Inside borders und dann die Studienregion Cytoplasma (2) aus. Wählen Sie Methode aus, und wählen Sie die Ausgabepopulation Spots (2) Inside Borders aus.
    7. Klicken Sie auf den Baustein Intensitätseigenschaften berechnen und wählen Sie den spezifischen Markerkanal Fluorescein aus. Wählen Sie die Studienpopulation Nuclei Inside Borders aus, und wählen Sie die Untersuchungsregion Spot aus. Wählen Sie Methode und wählen Sie die Ausgabeeigenschaften : Intensität, Spot, Fluoreszein, Innengrenzen.
    8. Klicken Sie auf den Baustein "Intensitätseigenschaften berechnen " und wählen Sie die RFP für den jeweiligen Markerkanal aus. Wählen Sie die Studienpopulation Nuclei Inside Borders und dann die Untersuchungsregion Spot (2) aus. Wählen Sie Methode und wählen Sie die Ausgabeeigenschaften Intensität, Spot (2), RFP, Inside Borders.
    9. Klicken Sie auf den Baustein Ergebnisse definieren , wählen Sie Populationskerne innerhalb der Grenzen aus, wählen Sie Anzahl der Objekte der Kerne (Mittelwert), wählen Sie Relative Intensität Spots Fluorescein – Mittelwert pro Vertiefung und wählen Sie Relative Intensität Spots (2) – RFP – Mittelwert pro Vertiefung.
  5. Um den autophagischen Fluss zu quantifizieren, verwenden Sie die gleiche Methode, die zuvor für die Durchflusszytometrie-Analyse beschriebenwurde 11. Ermitteln Sie das mCherry/EGFP-Verhältnis der Spots mit relativer Intensität.
    HINWEIS: Zellen mit höherem Flussmittel sind weniger grün, was das mCherry/EGFP-Verhältnis in der Zelle erhöht. Die Identifizierung und genaue Quantifizierung einer signifikanten Anzahl der relevanten Signale, die von den Autophagie-Flussereignissen in den Zellen stammen, ist sehr wichtig, um statistisch signifikante Unterschiede zu etablieren.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der autophagische Fluss kann in Zellen durch pharmakologische Modulation oder durch zelluläre Stressreaktion überwacht werden. Inmortalisierte humane Chondrozyten (T/C28a2) wurden verwendet, um eine Autophagie-Reporterzelllinie zu entwickeln, die LC3 als Fluoreszenzreporter (mCherry-EGFP-LC3B) für die Autophagie verwendet. Abbildung 1 zeigt den schematischen Ablauf des Screening-Assays, beginnend mit der Entwicklung der Autophagie-Reporterzelllinie in humanen Chondrozyten (mCherry-EGFP-LC3-T...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Defekte Autophagie ist ein wichtiges Kennzeichen der altersbedingten Gelenkdegeneration, aber weder präventive noch krankheitsmodifizierende Behandlungen gegen Autophagie sind bisher für Knorpeldegeneration verfügbar2. Aufgrund ihrer Relevanz und ihrer klinischen Implikationen ist die Autophagie zu einem interessanten Ziel für die Wirkstoffforschung und -entwicklung geworden, obwohl sich Methoden zur direkten Überwachung von Veränderungen in diesem wichtigen Homöo...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde unterstützt vom Instituto de Salud Carlos III- Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanien, Plan Estatal 2013-2016 und Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), "Una manera de hacer Europa", PI14/01324 und PI17/02059, von der Innopharma Pharmacogenomics-Plattform, die für die Validierung von Zielen und die Entdeckung von Arzneimittelkandidaten in präklinischen Phasen, Ministerio de Economía y Competitividad, angewendet wird. Wir danken auch der Foundation for Research in Rheumatology (FOREUM) für ihre Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mm ZellkulturplatteCorning430167Zellkulturplatte
12-Well-MultiplatteCorning353043Zellkulturplatte
15 mL Konisches ZentrifugenröhrchenFalcon-Corning352095Konisches Zentrifugenröhrchen
24-Well-MultiplatteCorning351147Zellkulturplatte
25 cm2 ZellkulturflascheFalcon-Corning353014Zellkulturflasche
384-Well-Multiplate Cell CarrierPerkin Elmer6007550Zellkulturplatte
6-Well-MultiplateCorning351146Zellkulturplatte
96-Well-MultiplateCorning353077Zellkulturplatte
Akustische Liquid-Handling-TechnologieLabcyte−https://www.labcyte.com
ChloroquinSigma-AldrichC6628autophagischer Flussinhibitor
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOD2650Disolvent
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Lonza, Basel, SchweizBE-604FT/C28a2 Wachstumsmedium
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)ATCC30– 2003HEK 293-T17 Wachstumsmedium
FACScalibur ZytometerBecton Dickinson, CA−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Fötales Kälberserum (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOF9665HEK 293-T17 Serum
Fötales Kälberserum (FCS)Gibco von Life Technologies, CA26010– 074Serum
FuGenePromegaE2691Ein nicht-liposomales Gemisch von Lipiden als Plasmidverabreichungsmethode zur Erzeugung einer Autophagie-berichteten Zelllinie
Tragbare elektronische 384-Kanal-PipetteIntegra−https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Sigma-AldrichH6648Puffer
HEK 293-T17ATCCCRL-11268Nierenzelllinie. Zellen wurden verwendet, um die retrovirale Verpackung zu erleichtern
High-Content-Screening-SystemPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249für DNA-Färbung
Perkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Liquid Handler WorkstationPerkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
Mikroplatten-WaschroboterBiotek−https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1x)Thermo Fisher Scientific11058Transfektionsmedium
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich158127Fixierer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3BAddgene, Cambridge, MA22418Plasmid
pCL-EcoAddgene, Cambridge, MA12371Plasmid
Penicillin-Streptomycin (P/S)Sigma-AldrichP0781Antibiotikum
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)MP Biomedicals2810305Puffer
PuromycinSigma-Aldrich, St. Louis, MOP8833Antibiotikum
RapamycinCalbiochem, Deutschland5053210autophagischer Flussaktivator
Software CellQuestProBecton Dickinson−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Spritzenvorsatzfilter 0,45 μ mCorningCLS431220Sterilfilter
T/C28a2−−Zelllinie humaner Chondrozyten
TrypsinGibco von Life Technologies, CA15400054Trypsin verwendet mit T/C28a2 Zellen
TrypsinSigma-Aldrich, St. Louis, MOSM-2002-CTrypsin verwendet mit HEK 293-T17 Zellen
VSV. GAddgene, Cambridge, MA14888Plasmid
Bildanalysesoftware

Referenzen

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