Methodenartikel

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

DOI:

10.3791/61081

⸱

12. Juni 2020

 ,  , 
1Department of Biology, The University of Akron, 2Department of Geosciences, The University of Akron

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir verwendeten ein geologisches (Coring) Probenahmeprotokoll, um kortikale Knochenproben von einheitlicher Größe für SR-CT-Experimente aus dem vorderen Aspekt der menschlichen Femora zu beschaffen. Diese Methode ist minimal destruktiv, effizient, führt zu zylindrischen Proben, die bildgebende Artefakte aus unregelmäßigen Probenformen minimieren und die mikroarchitektonische Visualisierung und Analyse verbessern.

Zusammenfassung

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Knochen ist ein dynamisches und mechanisch aktives Gewebe, das sich im Laufe der menschlichen Lebensdauer in der Struktur verändert. Die Produkte des Knochenumbauprozesses wurden im Wesentlichen mit traditionellen zweidimensionalen Techniken untersucht. Jüngste Fortschritte in der Röntgenbildgebungstechnologie durch Desktop-Mikrocomputertomographie (CT) und Synchrotronstrahlung Mikrocomputertomographie (SR-CT) haben die Erfassung von hochauflösenden dreidimensionalen (3D) Scans eines größeren Sichtfeldes (FOV) als andere 3D-Bildgebungstechniken (z. B. SEM) ermöglicht, die ein vollständigeres Bild der mikroskopischen Strukturen innerhalb des menschlichen Kortikalknochens liefern. Die Probe sollte jedoch innerhalb des FOV genau zentriert sein, um das Auftreten von Streifenartefakten zu begrenzen, von denen bekannt ist, dass sie Datenanalysen beeinflussen. Frühere Studien haben die Beschaffung von unregelmäßig geformten geradlinigen Knochenblöcken berichtet, die aufgrund ungleichmäßiger Kanten oder Bildabschneide zu bildgebenden Artefakten führen. Wir haben ein geologisches Probenahmeprotokoll (Coring) angewendet, um konsistent ekortikale Knochenkernproben für SR-CT-Experimente aus dem vorderen Aspekt der menschlichen Femora zu beschaffen. Diese Coring-Methode ist effizient und minimal destruktiv für Gewebe. Es werden einheitliche zylindrische Proben erstellt, die bildgebende Artefakte von Der Art, die während der Rotation isometrisch ist, verringern und eine gleichmäßige Pfadlänge für Röntgenstrahlen während des Scannens bereitstellen. Die Bildverarbeitung von röntgentomographischen Daten von entkernten und unregelmäßig geformten Proben bestätigt das Potenzial der Technik, die Visualisierung und Analyse der kortikalen Knochenmikroarchitektur zu verbessern. Ein Ziel dieses Protokolls ist es, eine zuverlässige und wiederholbare Methode für die Extraktion von kortikalen Knochenkernen zu liefern, die für verschiedene Arten von hochauflösenden Knochenbildgebungsexperimenten anpassungsfähig ist. Ein übergeordnetes Ziel der Arbeit ist es, eine standardisierte kortikale Knochenbeschaffung für SR-CT zu schaffen, die erschwinglich, konsistent und unkompliziert ist. Dieses Verfahren kann von Forschern in verwandten Bereichen, die häufig harte Verbundwerkstoffe wie in der biologischen Anthropologie, Geowissenschaften oder Materialwissenschaften bewerten, weiter angepasst werden.

Einleitung

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Mit den jüngsten Fortschritten in der Bildgebungstechnologie ist es nun möglich, Röntgenbilddaten mit sehr hoher Auflösung zu erfassen. Desktop-Mikro-CT-Systeme sind aufgrund ihrer zerstörungsfreien Natur der aktuelle Standard für die Bildgebung von Cancellous-Knochen1. Bei der Abbildung der mikrostrukturellen Merkmale des kortikalen Knochens war die Verwendung von CT jedoch begrenzter. Aufgrund von Lösungseinschränkungen können Desktop-Systeme nicht die Auflösung erreichen, die erforderlich ist, um mikrostrukturelle Merkmale abzubilden, die kleiner sind als kortikale Poren, wie z. B. Osteozyten-Lücken. Für diese Anwendung ist SR-CT ideal aufgrund der höheren Auflösung dieser Systeme1. Experimente an der Canadian Light Source (CLS) an den Beamlines2 der BioMedical Imaging and Therapy (BMIT) haben beispielsweise Bilder mit Voxeln von bis zu 0,9 m erzeugt. Frühere Studien1,3,4,5 haben diese Auflösung verwendet, um Projektionen und nachfolgende dreidimensionale (3D) Renderungen von kortikalen Knochenproben von menschlichen langen Knochen ( Abbildung1) zu quantifizieren Osteozyten-Lückendichte4,6,7,8,9 und Variation in der lacunar Form und Größe3 über die menschliche Lebensdauer und zwischen den Geschlechtern. Weitere Studien haben das Vorhandensein von Osteon-Banding beim Menschen10gezeigt, ein Phänomen, das bisher als nur mit nichtmenschlichen Säugetieren in der forensischen anthropologischen Literatur in Verbindung gebracht wurde.

Um eine außergewöhnliche Auflösung zu erreichen, muss der Röntgenstrahl im Sichtfeld (FOV) fein fokussiert sein, was die maximale Probengröße oft auf wenige Millimeter Durchmesser begrenzt. Derzeit gibt es keine umfassenden, standardisierten Verfahren, die in der Literatur beschrieben sind und die Beschaffung von Knochenproben skizzieren, die diese Einschränkungen erfüllen. Das Zentrieren von Proben innerhalb des FOV ist entscheidend, um sicherzustellen, dass 1) die Probe zentriert bleibt, während sie sich während der Bildgebung um 180° dreht, und 2) Scan-Artefakte sind begrenzt, da es keine Bildkürzung gibt. Mit anderen Worten, keine Teile der Probe außerhalb des FOV stören den Strahl, der in seinen Brennpunkt innerhalb des FOV eintritt. In diesem Fall wird dem Rekonstruktionsalgorithmus ein Teil der Dämpfungsdaten entzogen, die für eine vollständig korrekte Rekonstruktion benötigt werden. Es ist ferner erwähnenswert, dass 360°-Scans (Vollrotation) die Auswirkungen der Strahlhärtung minimieren, aber Artefakte erhöhen, die durch Fehlausrichtung und Probenbewegungen während der Bildgebung verursacht werden. Während also ein 360°-Scan in der Regel sauberere Daten generiert, wird die Bildzeit verdoppelt, so dass ein Kompromiss zwischen experimentellen Kosten und Datenqualität angegangen werden muss.

Ein wichtiger und oft übersehener Aspekt von Knochenbildversuchen ist die genaue und reproduzierbare Probenvorbereitungstechnik, die vor dem Scannen durchgeführt wird. In Studien, die die SR-CT-Methoden in ihre Experimente einbeziehen, wird kurz ihr Probenahmeprotokoll erwähnt, aber die Autoren geben wenig bis gar keine Details über die jeweilige Methodik an, die zum Sammeln ihrer Proben verwendet wird. Viele solcher Studien erwähnen das Schneiden geradliniger Knochenblöcke beliebiger Dimensionen, geben aber im Allgemeinen keine weiteren Informationen über die verwendeten Werkzeuge oder Einbettmaterialien3,4,10,11,12,13,14. Einige Forscher verwenden häufig Hand-Drehwerkzeuge (z.B. Dremel), um geradlinige Knochenblöcke aus einem Bereich von Interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Diese Methode führt zu Proben mit ungleichmäßiger Größe, die größer als die FOV sein können, was die Wahrscheinlichkeit von Scanartefakten und Bildabschneidungen erhöht. Solche Proben erfordern oft eine weitere Verfeinerung mit einer Präzisions-Diamant-Wafer-Säge (z.B. Bühler Isomet). Die Beschaffung von Stichproben mit konsistenten Abmessungen (bis zu zwei Hundertstel/mm) ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die erfassten Datensätze von höchster Qualität sind und die nachfolgenden Ergebnisse reproduzierbar sind.

Die begrenzte Berichterstattung über die Stichprobenbeschaffungsmethodik fügt eine zusätzliche Schwierigkeitsschicht bei dem Versuch hinzu, Methoden einzusetzen und/oder zu validieren, die in einer früheren Studie durchgeführt wurden. Derzeit müssen sich die Forscher direkt an die Autoren wenden, um weitere Informationen zu ihren Probenahmeverfahren zu erhalten. Das hier beschriebene Protokoll bietet biomedizinischen Forschern eine gründlich dokumentierte, reproduzierbare und kosteneffiziente Probenahmetechnik. Das primäre Ziel dieses Artikels ist es, ein umfassendes Tutorial zur Beschaffung konsistent dimensionierter kortikaler Knochenkernproben mit einer Fräsbohrmaschine und einem Diamant-Coring-Bit für die genaue Visualisierung und Extraktion von mikroarchitektonischen Daten bereitzustellen. Diese Methode wird von Verfahren geändert, die verwendet werden, um routinemäßig einheitliche,1-5 mm Zylinder mit kleinem Durchmesser (1-5 mm) aus Blöcken harter Materialien in der Hochdruckgesteinsmechanik15,16,17,18,19zu sammeln.

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Protokoll

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Alle Proben wurden von einbalsamierten kadaverischen Spendern der University of Toledo, des College of Medicine and Life Sciences und der Northeast Ohio Medical University (NEOMED) mit der informierten Zustimmung des Spenders selbst oder des nächsten Angehörigen des Spenders bezogen. Das Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects (IRB) der Universität Akron hielt diese Proben für von der vollständigen IRB-Überprüfung ausgenommen, da sie nicht von lebenden Personen beschafft wurden. Demografische Informationen wie Alter, Geschlecht und Todesursache lagen allen Spendern vor. Die ausgewählten Personen hatten weder dokumentierte knochenbeeinflussende Bedingungen noch eine Exposition gegenüber Behandlungsschemas, die sich zum Zeitpunkt des Todes auf den Knochenumbau ausgewirkt haben könnten. Kortikale Knochenproben wurden aus Femora von kadaverischen modernen Männchen und Weibchen im Alter von 19 bis 101 Jahren (Mittelwert = 73,9 Jahre) gewonnen. Der femorale Mittelschaftwurde ausgiebig untersucht, einschließlich Untersuchungen der Variation der kortikalen Porosität20,21,22,23,24 und materialdichte knochengewebe25,26,27, und ist somit zu einem häufig verwendeten Ort für mikrostrukturelle Analysen geworden.

1. Gewebebeschaffung und Mazeration

  1. Verwenden Sie eine oszillierende Säge, die mit einer Tauchschneidehartklinge (für Verbundwerkstoffe) ausgestattet ist, um 7,5 cm Knochenblöcke aus der Mitte der Diaphysen der linken Femora zu beschaffen.
  2. Einweichen Sie femorale Blöcke in einer ofensicheren Glasschale, gefüllt mit einem pulverförmigen Proteaseenzym und Leitungswasserlösung für 1 h in einem Inkubator, der bei 45 °C eingestellt ist.
  3. Nach der Inkubation, entfernen Sie sorgfältig alle verbleibenden Weichteile und Periost mit stumpfer Sezier- oder Zahnwerkzeuge.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von scharfen Werkzeugen (z. B. Skalpell), um Weichteile zu entfernen. Solche Instrumente können Schäden am Knochen verursachen, die bei CT-Scans nachweisbar sind, was die Probenkonservierung und die Datenqualität beeinträchtigen.
  4. Entfernen Sie Schmutz oder Okklusionen in der medullären Kavität, indem Sie Knochenblöcke in einem Ultraschallreiniger für 5-10 Minuten mit 20:1 Teilen Leitungswasser zur Reinigungslösung (siehe Tabelle der Materialien)oder mit einem Handwasserseide (z. B. Waterpik) platzieren.
  5. Den Knochenblock in einen Probenbecher eintauchen und mit 70% Ethanol füllen. Lassen Sie den Knochen für mindestens 24 Stunden einweichen, um Lipide zu entfernen.
    HINWEIS: Xylole können auch verwendet werden, um Lipide zu entfernen. Das verlängerte Einweichen in Xylole kann den Knochen jedoch spröde oder kalkig machen, da er ein Emulgator ist.
  6. Nach 24 Stunden, entfernen Sie Knochenblöcke aus Ethanol und lassen Sie die Luft bei Umgebungstemperatur für 24-48 Stunden trocknen.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

2. Gewebeschnitt

  1. Legen Sie ein 75 x 25 mm Glasmikroskop-Dia auf eine Auf 140 °C eingestellte Kochplatte. Schmelzen Sie eine großzügige Menge an thermischem Epoxidharz (siehe Materialtabelle)in der Mitte des Dias.
    1. Bei der Vorbereitung zusätzlicher dünner Abschnitte für die Mikroskopie (<50 m) muss der Knochenblock möglicherweise in ein zweiteiliges Epoxid eingebettet werden, um Trabeculae zu erhalten. Darüber hinaus ist bei der Umsetzung dieses Protokolls für empfindliche Proben (z. B. diagenetische Knochen oder hochbelebelebige Proben) das Einbetten von Proben in ein Epoxid erforderlich.
      HINWEIS: Knochenproben, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden von einbalsamierten kadaverischen Proben abgerufen. Wenn bei der Autopsie oder aus einem chirurgischen Fall frische Proben gesammelt werden, um Weichteilstrukturen (z. B. Vaskulatur) über SR-CT zu untersuchen, kann die Imprägnierung mit Epoxid Schäden an solchen Geweben verursachen. In diesen Fällen wird ein alternatives Klebemittel oder Montagemedium empfohlen (z.B. doppelseitiges Klebeband, Modellierung von Ton).
  2. Drücken Sie den unteren Aspekt des Knochenblocks in das thermische Epoxidharz auf dem Mikroskopschlitten, wobei die Länge des Knochens senkrecht zum Dia ist. Verschieben Sie die Probe hin und her, um die Unterseite des Knochens zu beschichten und eine sichere Haftung an der Rutsche zu gewährleisten.
  3. Lassen Sie die montierte Probe für 5 min auf der Kochplatte ruhen, damit das thermische Epoxid in Poren und/oder Risse eindringen kann.
    HINWEIS: Das Epoxid auf dem Dia sollte für eine optimale Haftung frei von Blasen sein. Um Blasen zu entfernen, verschieben Sie die Probe auf der Folie hin und her. Blasen bilden sich oft durch Wasser und/oder Ethanol, das im Knochen entweicht und verdunstet.
  4. Entfernen Sie den Schlitten mit der montierten Probe von der Kochplatte mit stumpfen Zangen und lassen Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten abkühlen. Entfernen Sie Epoxid vom Rand des Schlittens mit einer Rasierklinge, um sicherzustellen, dass das Futter den Schlitten ausreichend greift.
  5. Befestigen Sie den Schlitten mit der aufhaftenden Probe an einem Glasschieberfutter und montieren Sie das Futter am Schwenkarm einer langsamlaufenden Schnittsäge (siehe Materialtabelle, Abbildung 2).
    HINWEIS: Während in diesem Protokoll eine Bühler IsoMet-Säge verwendet wurde, stehen weitere Präzisionsschnittsägen zur Verfügung, die anstelle des IsoMet verwendet werden können (z. B. Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).
  6. Stellen Sie den Schwenkarm mithilfe des Positionierzifferblatts ein, um sicherzustellen, dass die Klingenkontakte und die Probe überschneidet. Positionieren Sie die Probe so, dass ein Querschnitt des Knochens senkrecht zu seiner Länge geschnitten wird.
  7. Fügen Sie Gewichte auf der Rückseite des Schneidarms hinzu, um dem Gewicht des Arms entgegenzuwirken.
    HINWEIS: Wenn ein unzureichendes Gegengewicht verwendet wird, kann die Probe auf der Klinge absinken und die Klinge brechen lassen.
  8. Schneidflüssigkeit (20:1 Teile Wasser zur Schneidflüssigkeit) in den Flüssigkeitsbehälter der Säge geben.
  9. Sichern Sie die Diamant-Waferklinge fest und stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand den Schneidbereich der Klinge unterWasser gibt. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 200 Umdrehungen pro Minute ein, und senken Sie die Probe langsam auf das Blatt (Abbildung 3).
  10. Stellen Sie sicher, dass klinge und futter nicht wackeln und/oder hüpfen. Wenn übermäßige Bewegung festgestellt wird, sofort stoppen Sie die Säge und ziehen Sie die Klinge und/oder Futterarm-Montage vor dem Wiederaufnahme schneiden. Fügen Sie zusätzliche Gegengewichte hinzu, wenn sich das Futter aggressiv nach oben und unten bewegt. Übermäßige Bewegung einschließlich sichtbarer Seitenbewegung kann dazu führen, dass die Klinge bricht.
  11. Der erste dicke Abschnitt ist ein "Abfallschnitt", um eine klar definierte Oberfläche parallel zu jedem zusätzlichen Schnitt zu bieten. Nach dem ersten Abfallschnitt den Schwenkarm anheben und mit dem Positionierzifferblatt 5 mm in Richtung Klinge bewegen. Mit diesem Verfahren können weitere dicke Abschnitte (ca. 1 mm) für die Mikroskopie gesammelt werden.
    HINWEIS: Um wertvolles Gewebe zu sparen, kann der Abfallschnitt weggelassen werden. Beim Schnitt einer Probe mit einer unebenen Kante ist es jedoch wichtig, dass der Spitzender der Probe tangential an den Rand des Koringbohrers aufgereiht wird.
    1. Achten Sie darauf, die Kante der Klinge beim Schnitt zu berücksichtigen. Um beispielsweise einen 5-mm-Schnitt von einer Klinge mit einer Kante von 0,5 mm zu erhalten, bewegen Sie die Probe und futtern Sie 5,5 mm zur Klinge.
  12. Nachdem das Schnitten abgeschlossen ist, legen Sie die Glasrutsche mit der montierten Probe auf eine Kochplatte, um das thermische Epoxid zu schmelzen. Dies ermöglicht eine schnelle Entfernung von Knochenblöcken aus der Rutsche.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

3. Probe-Coring

  1. Montieren Sie 5 mm Knochenprofile an den Boden einer flachen Aluminiumdose (8 cm Durchmesser) mit der thermischen Epoxid-Bindungstechnik, wie in den Schritten 2.2-2.4 beschrieben.
  2. Zinn auf einen XY-Maschinentisch der Fräsbohrpresse legen (siehe Materialtabelle)und Befestigungsklemmen von Hand anziehen (Abbildung 4).
  3. Legen Sie 2 mm Hohlwellen-Juwelier-Diamantbohrer (siehe Materialtabelle)in das Fräsbohrfutter ein. Passen Sie den Tiefenbegrenzer an, um eine Verätzung durch die Dose zu verhindern (Abbildung 5).
  4. Richten Sie den zentralen vorderen Aspekt der Knochenprobe unter dem Bohrer aus, während sie einen engen Kontakt mit dem Periost, dem Endosteum oder den stark trabekularisierten Bereichen vermeiden.
    HINWEIS: Die automatische Auswahl von mid-vorderen Femoralkortika ist nicht möglich, da die kortikale Dicke von Person zu Person variiert, insbesondere mit zunehmendem Alter.
  5. Füllen Sie die Dose mit destilliertem Wasser, um die Probe vollständig zu bedecken. Dies verhindert Wärmebildung, Brennen der Probe und/oder Beschädigung des Bohrers während des Koranders.
    HINWEIS: Um die Möglichkeit von Hitzeschäden durch Koring zu bewerten, wurde ein Infrarot-Thermometer verwendet, um Temperaturmessungen aus dem destillierten Wasser zu erreichen, da das Koringbit zuerst in die Knochenoberfläche eingedrungen ist. Die Temperatur variierte um 1 °C von 22,9 – 23,9 °C unter den zehn für diesen Test entkernten Proben. Daher argumentieren wir, dass hitzeinduzierte Schäden vernachlässigbar sind.
  6. Für die ersten paar Fälle von Kontakt zwischen dem Kernbit und Knochen, tragen Sie sanften Druck, um einen Ring auf der oberen Oberfläche des Knochens zu tragen. Dies verhindert eine Umlenkung des Bohrers zu Beginn des Ätzvorgangs und sorgt für eine korrekte Platzierung des Bits.
  7. Heben Sie den Bohrer während des Korcorings in die Probe ein und aus, während Sie die Spitze des Bits unter der Wasseroberfläche halten. Setzen Sie diese Technik alle paar Sekunden fort, um eingeschlossenen Knochenstaub auszuspülen und sicherzustellen, dass der Schmutz den Bohrer nicht verstopft.
    HINWEIS: Wenn der Kern eine konische Form bildet, ist es wahrscheinlich auf 1) zurückzuführen, so dass nicht genügend Zeit bleibt, um Knochenstaub aus dem Koringbit zu spülen, und 2) Die Koringung tritt zu schnell auf. Erhöhte Geschwindigkeit kann große Stücke von der Probe abbrechen und den überlegenen Aspekt pulverisieren.
  8. Nach Abschluss des Korings kann sich der resultierende Knochenkern im Hohlstämmchen(Abbildung 6)einlogen lassen. Verwenden Sie ein Paar feingekippte Zangen oder einen kleinen Allenschlüssel, um den Kern aus dem Bit zu lösen (Abbildung 2).
  9. Bewahren Sie die entkernte Probe in einem beschrifteten Mikrozentrifugenrohr an einem kühlen und trockenen Ort bis zur Bildgebung auf.

4. Bildverarbeitungsroutinen zur Bewertung von Knochenmikroarchitektonischen Parametern aus kortikalen Knochenkernen

  1. Rekonstruktion von CT-Bildern
    1. Laden Sie die neueste NRecon-Version auf https://www.bruker.com/products/microtomography.html herunter und installieren Sie sie für die Rekonstruktion der SR-CT-Projektionsbilder.
    2. Wählen Sie die NRecon-Verknüpfung auf dem Desktop aus, und der zugehörige GPUReconServer wird angezeigt.
    3. Öffnen Sie das gewünschte Dataset im Popupfenster. Wenn das Fenster nicht angezeigt wird, wählen Sie das Ordnersymbol in der oberen linken Ecke des Dataviewer-Fensters aus.
    4. Wählen Sie die erste Projektion aus der SR-CT-Erfassung aus. Entfernen Sie unter Ausgabedie Auswahlen für Verwenden von ROI und Scales ON.
    5. Wählen Sie das Ziel der Rekonstruktionsdatei aus. Wählen Sie Durchsuchen aus, und erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen Recon. Das ausgewählte Dateiformat sollte BMP(8) sein.
    6. Überprüfen Sie die Ausgleichskompensation.
      HINWEIS: Diese Schätzung ist oft nahe an der Korrekta. Das grobe 3D-Rendering kann manuell angepasst werden, indem die Pfeile nach oben und unten verschoben werden, um die überlappenden Bilder so zu verschieben, dass der rechte und linke Rand so nah wie möglich ausgerichtet sind.
    7. Wählen Sie unter Einstellungendie gewünschte Auswahl aus, um Glättung, Strahlhärten, CS-Rotation, Objekt größer als FOV und Ringartefakte-Algorithmenanzuwenden.
    8. Passen Sie das Histogramm unter Ausgabe an, indem Sie Autoauswählen.
      HINWEIS: Das resultierende Bild kann abgeseut sein.
    9. Wählen Sie Start aus, um mit der Bearbeitung der Rekonstruktion zu beginnen.
    10. Verwenden Sie Die Standardnomenklatur für Kanal-/Osteozyten-Lakunarindizes28. Dazu gehören: Gesamt-VOI-Gewebevolumen (TV), Kanalvolumen (Ca.V), Gesamtzahl der Kanäle (Ca.N), durchschnittlicher Kanaldurchmesser (Ca.Dm), kortikale Porosität (Ca.V/TV), als Prozentsatz angegeben, Gesamtzahl der Lücken (N.Lc) und durchschnittliches Lückenvolumen (Lc.V). Zur Bestimmung der Lückendichte pro mm3 (N.Lc/BV) wird das Knochenvolumen (BV) als Gesamtvolumen minus Kanalvolumen (TV-Ca.V) berechnet.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
  2. Sammlung von Mikroarchitektonischen Daten aus rekonstruierten Bildern
    1. Laden Sie die neueste Version von CTAnalyser auf https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html herunter und installieren Sie sie für die Analyse von Mikroarchitekturparametern.
      HINWEIS: Die kostenlose Version von CTAnalyser ist in der Funktionalität eingeschränkt. Daher wird empfohlen, eine vollständige Lizenz zu erwerben, um detailliertere Analysen durchzuführen.
    2. Unter Bild | Eigenschaften | Ändern Siedie Pixelgröße , stellen Sie sicher, dass die Pixelgröße mit der des angewendeten CT-Bildgebungsprotokolls übereinstimmt.
      HINWEIS: Wenn Sie Bilder in ImageJ oder einem ähnlichen Programm bearbeiten, beachten Sie, dass beim Speichern der in die TIFF-Datei eingebettete Header geändert wird und die Analysesoftware die Pixelgröße beim Importieren des Datasets ändert.
    3. Auswählen Kundenspezifische Verarbeitung um eine Aufgabenliste zu erstellen (siehe Ergänzende Materialien), um die Knochenmikroarchitektur aus dem Scan-Dataset zu analysieren. Ein allgemeines Protokoll für Osteozyten-Lacunar-Netzwerkparameter mit Plugins, die ctAnalyser-Eigentum sind, folgt hier:
      HINWEIS: Die Plugin-Aufgabenliste eignet sich gut für Datasets, bei denen das Beispiel der einzige im FOV sichtbare Betreff ist. Wenn der freie Raum die Probe umgibt, ist die Anwendung eines ROI erforderlich. Andernfalls werden die in der 3D-Analyse und der Einzelobjektanalyse gesammelten Werte künstlich verringert.
      1. Laden Sie die Bilder neu, um Änderungen zurückzusetzen und/oder anzupassen (z. B. aus der Bearbeitung in ImageJ oder ähnlichem), bevor Sie das Menü "Benutzerdefinierte Verarbeitung" in der Analysesoftware öffnen.
      2. Um das Rauschen in den Bildern zu reduzieren, wenden Sie einen Gaußschen Tiefpassfilter im 3D-Raum mit einem runden Kernel und einem Radius von 2-3 an.
        HINWEIS: Diese Einstellungen wurden auf Datasets aus den gemeldeten SR-CT-Experimenten durch Test- und Fehlertests angewendet. Ziel war es, die qualitativ besten Rekonstruktionen für die Daten zu erhalten. Passen Sie die Rekonstruktionseinstellungen an jedes einzelne experimentelle Setup an.
      3. Wenden Sie einen globalen Graustufenschwellenwert auf die Bilder an, indem Sie niedrige und hohe Werte auswählen, um Gefäßkanäle hervorzuheben. Die rekonstruierten Scheiben in den Abbildungen 8B und 8D zeigen eine Beispielschwelle von 0-155.
        HINWEIS: Ähnlich wie in Schritt 4.2.3.2 wurden die hier angewendeten Schwellenwerteinstellungen durch umfangreicheVersuchs- und Fehlerfehler ausgewählt. Die Schwellenwerte sollten für jeden verwendeten Versuchsaufbau und jedes verwendete Bildgebungssystem der CT angepasst werden.
      4. Despeckle (Denoise) zu entfernen weiße Flecken im 3D-Raum, die innerhalb der volumetrischen Pixel (Voxel) Größenbereich von Osteocyten Lacunae sind, um nur Kanäle zu isolieren.
        HINWEIS: Bei einem SR-CT-Scan des menschlichen kortikalen Knochens, der mit einer Pixelgröße von 0,9 m aufgenommen wurde, beträgt die untere Grenze für Osteozyten-Lücken 13 Voxel.
      5. Despeckle, um alle schwarzen Flecken im 2D-Raum zu entfernen, um Artefakte in den Kanälen zu entfernen. Diese können in 2D ziemlich groß sein, wodurch Features entfernt werden, die <15.000 Pixel sind.
      6. Delegieren Sie die Poren im 3D-Raum mit der morphologischen Operationsfunktion mit einem runden Kern von 2 oder 3 Radius, je nach Bildqualität, um alle in Kanälen gefangenen Weichgewebe zu isolieren.
      7. Führen Sie eine zusätzliche Despeckle-Funktion mit den gleichen Einstellungen wie Schritt 4.2.3.5 aus. um isolierte Weichgewebe in Kanälen zu entfernen.
      8. Erodieren Sie die Dilatation ab Schritt 4.2.3.6. Verwendung einer morphologischen Betriebsfunktion mit einem runden Kernel mit 2 oder 3 Radius. Der Radius für diesen Schritt muss mit dem in Prozedur 4.2.3.6 verwendeten Radius übereinstimmen.
      9. Führen Sie die 3D-Analyse aus, und wählen Sie aus, welche Parameter für das Volumen der Gefäßkanäle berechnet werden sollen. Im Allgemeinen liefern die Grundwerte ausreichende Informationen.
      10. Speichern Sie die verarbeiteten Bilder mit Bitmaps speichern in einem benutzerdefinierten Unterordner im Verzeichnis.
        HINWEIS: Wenn Sie ein 3D-Rekonstruktionsbild aus den verarbeiteten Bildern mit einem Programm wie Amira/Avizo, Dragonfly, Drishti usw. erstellen, wird das Speichern der Bilder als monochrom (1 Bit) empfohlen.
      11. Berechnen Sie die Anzahl der Gefäßkanäle und beschreiben Sie deren Größe, Form und Ausrichtung mithilfe der Funktion Einzelobjektanalyse.
      12. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.3.1 – 4.2.3.3. , um das Bild für die Osteozyten-Lakunar-Analyse zurückzusetzen.
      13. Entfernen Sie weiße Flecken im 3D-Raum mit der Despeckle-Funktion, um sicherzustellen, dass solche Artefakte kleiner als die untere Grenze der Lacunar-Größe sind. Dieser Schritt entfernt Geräusche aus dem Scan, die als kortikale Poren erscheinen können, während echte Osteozyten-Lücken erhalten bleiben. Bei menschlichen SR-CT-Scans mit einer Pixelgröße von 0,9 m beträgt diese Untergrenze 13 Voxel.
      14. Despeckle noch einmal, um weiße Flecken zu entfernen, die größer als die obere Grenze der Lacunar-Größe sind. Für menschliche SR-CT-Datasets mit den in Schritt 4.2.3.13 aufgeführten Einstellungen beträgt dieser Grenzwert 2743 Voxel.
      15. Führen Sie 3D-Analysen durch, um mikrostrukturelle Informationen zu den Osteozyten-Lücken speziell zu extrahieren.
      16. Wählen Sie Bitmaps speichern, um die verarbeiteten Bilder zu speichern, um die Osteozyten-Lücke zu isolieren.
      17. Führen Sie eine individuelle Objektanalyse durch, um die Anzahl der Osteozyten in 3D innerhalb des ausgewählten VoI-Volumens (VolI) zu berechnen.
        HINWEIS: Sobald die Aufgabenliste erstellt und getestet wurde, verfügt CTAnalyser über eine Batch-Manager-Funktion (BatMan), die eingesetzt werden kann, um die Datenextraktion zu beschleunigen und eine gleichmäßige Bildverarbeitung zu gewährleisten. Eine Aufgabenliste mit Beispieleinstellungen für Prozedur 4.2.3. finden Sie in den Ergänzungsmaterialien.

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Ergebnisse

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Die beschriebene Methode der Kernprobenahme erwies sich als äußerst effektiv und effizient. Die Mithilfe für Proben, die dieses Protokoll verwenden, ermöglichte die Beschaffung von Proben in konstanter Größe von >300 für Experimente an der CLS BMIT-BM-Beamline2, mit einem FOV von 2 mm bei einer Voxelgröße von 1,49 m. Um die Konsistenz des Kerndurchmessers zu validieren, wurden entlang der Länge (oben, Mitte, Unten) einer Teilmenge menschlicher vorderer Femoralkerne (n=69) drei Messunge...

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Diskussion

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Es gibt kein umfassendes, standardisiertes Protokoll zur Beschaffung einheitlicher und zylindrischer kortikaler Knochenkernproben für hochauflösende SR-CT-Bildgebung mit begrenzten FOV-Setups. Das hier beschriebene Protokoll füllt diese Lücke, indem es ein umfassendes Tutorial zur Beschaffung von konsistent dimensionierten kortikalen Knochenkernproben für die SR-CT-Bildgebung und die anschließende genaue Visualisierung und Extraktion von mikroarchitektonischen Daten bereitstellt. Wir haben gezeigt, dass unser Protokoll e...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die in diesem Beitrag beschriebene Forschung wurde in der BMIT-Anlage der Canadian Light Source durchgeführt, die von der Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, der University of Saskatchewan, der Regierung von Saskatchewan, Western Economic Diversification Canada, dem National Research Council Canada und den Canadian Institutes of Health Research unterstützt wird. Die Autoren danken den Beamline-Wissenschaftlern der kanadischen Lichtquelle, insbesondere Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov und Ning Zu für die Unterstützung beim Aufbau und der Fehlerbehebung der SkyScan SR-CT- und Weißstrahlmikroskopsysteme. Wir danken auch Beth Dalzell vom University of Toledo College of Medicine and Life Sciences und Dr. Jeffrey Wenstrup von der Northeast Ohio Medical University für den Zugang zu kadaverischen Proben für diese Studie. JM Andronowski wird durch Start-up-Forschungsfonds der University of Akron und eines Stipendiums des National Institute of Justice Research and Development in Forensic Science for Criminal Justice Purposes (2018-DU-BX-0188) unterstützt. RA Davis wird von einer Graduiertenassistenz der University of Akron unterstützt. Ausrüstungundzubehör, die zum Kornieren und Sägen verwendet wurden, wurden durch Start-up-Fonds der Universität Akron und nSF-Zuschuss EAR-1624242 an CW Holyoke erworben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-1/8" Tauchschneidhartmetall für VerbundwerkstoffeWarrior6181228,6 mm Tauchen
70% EthanolFisher ScientificBP82015003,8 Liter
Pinzette mit stumpfer SpitzeFisher Scientific10-300
ZentrifugenröhrchenThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 EpoxidharzTed Pella821-3
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