Methodenartikel

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/61100

⸱

7. September 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der proteostatische Rückgang ist ein Kennzeichen des Alterns und erleichtert das Auftreten neurodegenerativer Erkrankungen. Wir skizzieren ein Protokoll zur quantifizierbaren Messung der Proteostase in zwei verschiedenen Caenorhabditis elegans-Geweben durch heterologe Expression von Polyglutamin-Wiederholungen, die mit einem fluoreszierenden Reporter verschmolzen sind. Dieses Modell ermöglicht eine schnelle genetische In-vivo-Analyse der Proteostase.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fähigkeit, die richtige Funktion und Faltung des Proteoms (Proteinhomöostase) aufrechtzuerhalten, nimmt während des normalen Alterns ab, was das Auftreten einer wachsenden Anzahl altersbedingter Krankheiten erleichtert. Zum Beispiel sind Proteine mit Polyglutamin-Expansionen anfällig für Aggregation, wie das Huntingtin-Protein und der gleichzeitige Ausbruch der Huntington-Krankheit zeigen. Die altersbedingte Verschlechterung des Proteoms wurde umfassend durch die Verwendung von transgenen Caenorhabditis elegans untersucht, die PolyQ-Wiederholungen exprimieren, die mit einem gelb fluoreszierenden Protein (YFP) verschmolzen sind. Dieses transgene PolyQ::YFP-Tiermodell ermöglicht die direkte Quantifizierung des altersbedingten Rückgangs des Proteoms durch Abbildung der fortschreitenden Bildung von Fluoreszenzherden (d.h. Proteinaggregaten) und des anschließenden Auftretens von Fortbewegungsdefekten, die sich als Folge des Zusammenbruchs des Proteoms entwickeln. Darüber hinaus kann die Expression des polyQ::YFP-Transgens durch gewebespezifische Promotoren gesteuert werden, was die Beurteilung der Proteostase über Gewebe hinweg im Kontext eines intakten mehrzelligen Organismus ermöglicht. Dieses Modell ist für die genetische Analyse sehr gut geeignet und bietet somit einen Ansatz zur Quantifizierung des Alterns, der die Lebensdauerassays ergänzt. Wir beschreiben, wie die Bildung von PolyQ::YFP-Herden in Neuronen oder Körperwandmuskeln während des Alterns und das anschließende Auftreten von Verhaltensdefekten genau gemessen werden kann. Als nächstes zeigen wir auf, wie diese Ansätze für einen höheren Durchsatz und mögliche zukünftige Anwendungen mit anderen aufkommenden Strategien für die genetische Analyse von C. elegans angepasst werden können.

Einleitung

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Proteinhomöostase (Proteostase) ist definiert als die zelluläre Fähigkeit, die richtige Funktion und Faltung des Proteoms aufrechtzuerhalten. Die inhärente Herausforderung für die Proteostase besteht darin, sicherzustellen, dass alle Proteine ordnungsgemäß gefaltet und in einer nativen Konformation gehalten werden, die durch die vielfältige Natur der Proteingröße, der Aminosäurezusammensetzung, der strukturellen Konformation, der Stabilität, des Umsatzes, der Expression, der subzellulären Kompartimentierung und der Modifikationen weiter verstärkt wird1. Die Proteostase wird durch die koordinierte Wirkung eines großen proteostatischen Netzwerks aufrechterhalten, das aus etwa 2000 einzigartigen Proteinen besteht, die die ordnungsgemäße Synthese, Faltung, den Transport und den Abbau innerhalb des Proteoms regulieren2,3. Die Arbeitspferdkomponenten des proteostatischen Netzwerks sind neun Hauptfamilien molekularer Chaperone4. Jeder Gewebe- und Zelltyp verwendet bevorzugt spezifische Untergruppen molekularer Chaperone, vermutlich in Übereinstimmung mit den unterschiedlichen Anforderungen verschiedener Proteome5.

Ein Kennzeichen der normalen organismischen Alterung ist der fortschreitende Rückgang und Zusammenbruch der zellulären Proteostase, von der angenommen wird, dass sie eine zugrunde liegende Grundlage für den Beginn und das Fortschreiten einer wachsenden Anzahl altersbedingter Krankheiten ist. Zum Beispiel haben Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ein gemeinsames Merkmal: In jedem Fall wird die Manifestation der Neurodegeneration durch genetische Veränderungen angetrieben, die ein mutiertes Protein für die Aggregation prädisponieren (Amyloid-β / Tau, α-Synuclein, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1)6,7,8,9,10 . Während des Alterns nimmt die Integrität und Induzierbarkeit des proteostatischen Netzwerks ab, was zur Anhäufung von proteotoxischen Aggregaten führt, die zu zellulärer Dysfunktion und Neurodegeneration führen. Bemerkenswert ist, dass Protein-Konformationskrankheiten nicht nur auf Neuronen beschränkt sind und in mehreren Geweben auftreten, wie Typ-II-Diabetes, multiples Myelom und Mukoviszidose11,12,13,14. Daher wird die Aufklärung von Mechanismen, die in der Lage sind, die Proteostase zu erhalten, die Entwicklung gezielter Interventionen zur Behandlung von Krankheiten und zur Förderung eines gesunden Alterns erleichtern.

Der kleine Bodennematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) war maßgeblich an der Entdeckung von Genen und der Aufklärung von Signalwegen beteiligt, die die Proteostase verändern. Viele Komponenten des proteostatischen Netzwerks und der Signaltransduktionswege, die die Proteostase regulieren, sind evolutionär konserviert. Darüber hinaus hat C. elegans die Komplexität und Redundanz im Vergleich zu Wirbeltiersystemen reduziert, was es für die genetische Analyse und Genentdeckung zugänglicher macht. Weitere Vorteile von C. elegans, die dazu geführt haben, dass es als Modellsystem zur Untersuchung der Proteostase weit verbreitet ist, sind: leistungsstarke genetische und funktionelle Genomik, ein kurzer Lebenszyklus (3 Tage) und eine kurze Lebensdauer (3 Wochen), ein kompaktes und gut annotiertes Genom, die Verfügbarkeit einer breiten Palette genetischer Mutanten und die einfache Visualisierung gewebespezifischer Veränderungen in der Zellbiologie mit fluoreszierenden Reportern.

Der fortschreitende Zerfall der Proteostase während des Alterns kann leicht in C. elegans quantifiziert werden. Das Morimoto-Labor zeigte zunächst, dass eine Polyglutaminexpansion, die mit gelb fluoreszierendem Protein (polyQ::YFP) verschmolzen ist, zur Quantifizierung des proteostatischen Rückgangs von C. elegans während des Alterns verwendet werden kann15,16,17,18. YFP-Fusionen zu 35 Glutamin-Wiederholungen oder mehr führen zu einer altersbedingten Bildung von Fluoreszenzherden zusammen mit Anzeichen einer zellulären Pathologie. Bemerkenswert ist, dass dieser Bereich der Glutaminexpansion die Länge des Polyglutamintraktes des Huntingtin-Proteins widerspiegelt, bei dem die Pathologie der Huntington-Krankheit beim Menschen beobachtet wird (typischerweise >35 CAG-Wiederholungen)19. Stämme mit Expression von polyQ::YFP in Muskel-, Darm- oder neuronalen Zellen wurden verwendet, um zu bestätigen, dass der altersbedingte Rückgang der Proteostase über verschiedene Zell- und Gewebetypen hinweg auftritt. Die muskelspezifische PolyQ::YFP-Expression (d.h. unc-54p::Q35::YFP)war der am weitesten verbreitete gewebespezifische Reporter, da akkumulierende fluoreszierende Herde in den ersten Tagen des Erwachsenenalters mit einem einfachen fluoreszierenden Seziermikroskop leicht zu quantifizieren sind (Abbildung 1A-1B). Zusätzlich werden Tiere in der Lebensmitte gelähmt, da das Proteom im Muskel aufgrund der proteotoxischen Wirkung des Reporters kollabiert (Abbildung 1C). In ähnlicher Weise kann der altersbedingte Rückgang der neuronalen Proteostase (rgef-1p::Q40::YFP) durch direkte Quantifizierung der Herde/Aggregatbildung und altersassoziierter Rückgänge in koordinierten Körperbeugen nach dem Einbringen von Tieren in Flüssigkeit verfolgt werden (Abbildung 2).

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, wie das altersabhängige Fortschreiten der Proteinaggregatakkumulation und die damit verbundene Proteotoxizität, die durch die Expression von Polyglutamin-Wiederholungen in neuronalem und Muskelgewebe in C. elegansinduziert wird, gemessen werden kann. Wir liefern Beispiele für typische Ergebnisse, die mit diesen Stämmen und Methoden generiert werden. Darüber hinaus zeigen wir, wie wir diese Methoden verwendet haben, um die transkriptionelle Regulation des proteostatischen Netzwerks zu untersuchen. Wir besprechen zusätzliche Möglichkeiten, wie diese Reporter einfach in andere vorhandene Reagenzien integriert oder für größere Bildschirme angepasst werden können.

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Protokoll

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1. Herstellung von Reagenzien

  1. Wählen Sie Gene von Interesse aus, die über fütterungsbasierte RNAi inaktiviert werden sollen. Kaufen Sie Bestände an HT115 E. coli, die den RNAi-Klon von Interesseenthalten 20. Alternativ subklone die cDNA des interessierenden Gens in die Multiklonierungsstelle des L4440-Plasmids.
    HINWEIS: Um den Abbau von dsRNA in den Bakterien zu verhindern, verwenden Sie den HT115-Stamm. Dies ist ein RNase III-defizienter E. coli-Stamm mit IPTG-induzierbarer T7-Polymerase-Aktivität. Für Proteostasestudien, die kein fütterungsbasiertes RNAi verwenden, können entweder HT115 oder OP50 E. coli auf Standard-NGM-Platten verwendet werden.
  2. Bereiten Sie 5 x 6 cm Platten pro Testbedingung vor. Induzieren Sie für Experimente mit RNAi die dsRNA-Produktion in transformierten HT115 E. coli. Für Studien ohne RNAi können OP50 E. coli auf Standard-NGM-Platten verwendet werden (siehe Supplemental File 1 für Standard-NGM- und RNAi-Plattenrezepte).
    HINWEIS: RNAi-Platten können vor der Aussaat mit Bakterien mehrere Monate bei 4 °C gelagert werden.
  3. Kulturen von E. coli über Nacht (16-20 h) bei 37 °C in einem Schüttelbrutschrank bei 220 U/min züchten. HT115 E. coli in Luria-Brühe (LB) mit Ampicillin (50 μg/ml) züchten.
    HINWEIS: Standard OP50 E. coli ist nicht antibiotikaresistent, aber es sind auch Streptomycin-resistente Varianten erhältlich.
    1. Konzentrieren Sie Bakterien durch Zentrifugation bei 2.400 x g für 15-20 min in einer Tischzentrifuge, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 1/10des Ausgangsvolumens (dh 10x Konzentration) von LB mit Ampicillin für HT115 oder LB ohne Ampicillin für Standard OP50.
    2. Aliquot 200 μL konzentrierte 10x Bakterien auf jede Platte (3-4 Replikate pro Testbedingung, mit 2 zusätzlichen Backup-Platten, die im Falle einer Kontamination verwendet werden können).
    3. Lassen Sie offene Platten in einer sauberen Umgebung wie einer Laminar-Flow-Bank trocknen, bis die gesamte Flüssigkeit absorbiert wurde, oder lassen Sie die abgedeckten Platten über Nacht auf einem Labortisch trocknen.
  4. Für ausgesäte RNAi-Platten, die in einer Haube getrocknet sind, lagern Sie die getrockneten Platten über Nacht (bis zu 24 Stunden) bei Raumtemperatur in einer Wurmbox. Nach 1 Tag bei RT können die Platten bei 4 °C bis zu 2 Wochen in einem versiegelten Beutel gelagert werden (um ein Austrocknen der Platten zu verhindern). Lassen Sie die bei 4 °C gelagerten Platten vor Gebrauch im Zip-Lock-Beutel auf Raumtemperatur zurückkehren, um zu verhindern, dass Kondenswasser Pilzverunreinigungen in der Luft verursacht.
    1. Wenn Sie RNAi auf Fütterungsbasis verwenden, lassen Sie ausgesäte HT115-Bakterien mindestens 12 Stunden lang bei Raumtemperatur auf RNAi-Platten, bevor Sie C. elegans hinzufügen. RNAi-Platten enthalten IPTG, das die dsRNA-Produktion induziert. Alternativ kann IPTG den flüssigen Kulturen am Ende von Schritt 1.3.1, 2 Stunden vor der Aussaat, zugesetzt werden.
    2. Vermeiden Sie eine langfristige Lagerung von ausgesäten HT115-Platten bei Raumtemperatur (länger als ein paar Tage), um ein Reißen des Agars zu vermeiden, das dazu führt, dass sich C. elegans in Agar eingräbt.

2. Synchronisation von C. elegans

HINWEIS: Wählen Sie, ob C. elegans entweder durch alkalische Hypochloritbehandlung von graviden Erwachsenen oder durch Eiablage synchronisiert werden soll.

  1. Synchronisieren Sie Tiere durch Hypochloritbehandlung von graviden erwachsenen Tieren, um die Freisetzung von Embryonen zu fördern22.
    1. Zur Behandlung mit Hypochlorit werden gravide Hermaphrodite 2 mal mit M9-Puffer gewaschen, dann 5 min lang in 5 ml Hypochloritlösung (3,25 ml Hypochloritlösung, 1 ml M9-Puffer und 0,75 ml 5 M NaOH) resuspendiert und die resuspendierten Tiere jede Minute geschüttelt. Nach 5 Minuten die Tiere herunterfahren und 3 Mal mit M9-Puffer waschen.
      HINWEIS: Es wurde postuliert, dass die Hypochloritbehandlung die Proteostasebeeinflusst 21.
    2. Lassen Sie die Embryonen nach der Hypochloritbehandlung über Nacht in 3 ml M9-Lösung mit einer Rotation bei 20 °C schlüpfen.
    3. Berechnen Sie die Dichte von L1-Tieren (oder alternativ Embryonen) pro μL, indem Sie 10 μL L1-Lösung 3x auf eine 6 cm große Platte fallen lassen und die Anzahl der L1-Tiere zählen, um die durchschnittliche Anzahl von L1-Tieren pro μL zu berechnen. Mischen Sie daher regelmäßig L1-Lösungen, um ein Absetzen zu vermeiden.
    4. Säen Sie 50 L1 Tiere pro Platte, zählen und notieren Sie die Anzahl der ausgesäten Tiere und bewegen Sie die Platten in einen 20 ° C-Inkubator. Es ist wichtig, die tatsächliche Anzahl der Tiere auf jeder Platte zu Beginn des Assays zu kennen.
      HINWEIS: Die Synchronisierung von L1-Tieren durch nächtliches Schlüpfen in M9 wird routinemäßig verwendet, da sie die Entwicklungsheterogenität minimiert, nachdem tiere auf Futter gesetzt wurden. Die Synchronisation erfolgt jedoch durch Entwicklungsstillstand als Reaktion auf Hungersignale, was für einige Studien vermieden werden sollte (siehe23 für zusätzliche Diskussionen). Alternativ können grob synchronisierte Tiere durch Eiablage gewonnen werden ,siehe 2.2.
    5. Reste L1-Tiere einfrieren und in flüssigem Stickstoff oder einem -80 °C Gefrierschrank lagern. Auf diese Weise bleibt eine Probe jedes Stammes zum Zeitpunkt des Versuchsaufbaus erhalten, wodurch eine wertvolle Ressource für zukünftige Studien geschaffen und die Reproduzierbarkeit verbessert wird.
      HINWEIS: Siehe Ergänzungsdatei 1 für Rezepturen für Hypochlorit und M9-Lösung.
  2. Um die Tiere über die Eiablage zu synchronisieren, legen Sie 20 junge erwachsene Tiere (Tag 1 des Erwachsenenalters) für 4-6 Stunden auf jeden Teller und lassen Sie sie Eier legen, bis ungefähr 50 Eier pro Teller vorhanden sind. Entfernen Sie alle graviden Erwachsenen und bewegen Sie die Platten mit den Eiern in einen 20 ° C-Inkubator.
    HINWEIS: Die erwachsenen Gravidtiere sollten am ersten Tag des Erwachsenenalters synchronisiert werden. Ältere Tiere können Eier legen, die in der Gebärmutter zurückgehalten wurden, was zur Freisetzung von Eiern führt, die sich in einem fortgeschritteneren Entwicklungsstadium befinden.

3. Nachkommenschaft

HINWEIS: Es müssen Schritte unternommen werden, um entweder die Nachkommenproduktion zu verhindern oder die synchronisierte Ausgangspopulation von ihren Nachkommen zu trennen. Die Verhinderung der Nachkommenproduktion kann chemisch durch Zugabe von 5-Fluor-2'-Desoxyuridin (FUdR) zu Platten erreicht werden, was hier beschrieben wird. Einige Studien haben berichtet, dass FUdR die Proteostase verändern kann24,25. Alternative Ansätze zur Verhinderung der Nachkommenproduktion werden im Folgenden diskutiert.

  1. Stellen Sie eine 1000-fache Stammlösung von FUdR her, indem Sie 1 g FUdR in 10 ml hochreines H2O auflösen. Aliquot 1 ml Vorrat in ein steriles 1,5 ml Röhrchen. Einfrieren und bei -20 °C lagern.
  2. Züchten Sie Tiere bei 20 °C bis zum L4-Stadium. N2-Tiere, die aus synchronisierten L1s aus der Hypochloritbehandlung gezüchtet wurden, benötigen etwa 40 Stunden Wachstum bei 20 °C, um L4 zu erreichen. Wachstumsraten für andere Stämme sollten vor dem Experimentieren empirisch getestet werden. Einzelheiten zur genauen Inszenierung von C. elegans finden Sie unter26.
    1. Zu jeder 6 cm Platte mit L4 Tieren 100 μL 80x FUdR hinzufügen. Es ist wichtig, FUdR in der L4-Stufe hinzuzufügen.
  3. Bringen Sie die Platten in eine Wurmbox zurück und legen Sie die Box in einen Zip-Lock-Beutel. Kehren Sie zum entsprechenden Inkubator zurück.

4. Messung des Rückgangs der Proteostase im Muskelgewebe mit Polyglutamin-exprimierenden Tieren

HINWEIS: Zwei Methoden können verwendet werden, um den Rückgang der Proteostase in Muskelzellen zu identifizieren: Bildgebung der Bildung von Proteinaggregaten während des Alterns (4.1) und Messung der Proteotoxizität, die diese Aggregate mit zunehmendem Alter bis zum Beginn der Lähmung verursachen (4.2).

  1. Bildgebung der Bildung von Polyglutaminaggregaten im Muskel während des Alterns
    HINWEIS: Das altersabhängige Fortschreiten der Proteinaggregation in den Muskelzellen wird unter Verwendung von Polyglutamin (polyQ) -Wiederholungen abgebildet, die zu einem gelb fluoreszierenden Protein (YFP) fusioniert sind. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des Stammes AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP],aber auch andere Polyglutamin-Variantenstämme können verwendet werden. Das polyQ::YFP-Transgen wird im Muskel mit dem muskelspezifischen Promotor unc-54 exprimiert. Synchronisierte unc-54p::p olyQ::YFP-exprimierende Tiere werden an Tag 1, 2, 3 und 4 des Erwachsenenalters visualisiert. Um unc-54p::p olyQ::YFP-Aggregate sichtbar zu machen, verwenden Sie ein für Fluoreszenz ausgestattetes Verbindungsmikroskop oder ein Fluoreszenz-Seziermikroskop. AM140 ist im Caenorhabditis Genetics Center (CGC) erhältlich unter: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. An Bildgebungstagen (Tag 1, 2, 3 und 4 des Erwachsenenalters) werden 20 Tiere entnommen und auf einem Objektträger mit einem 3% igen Agarosepad und einem 5 μL Tropfen 10 mM Natriumazid (verdünnt in M9-Puffer) montiert.
    2. Nachdem alle Tiere durch Natriumazid immobilisiert wurden (~ 5 Minuten), stellen Sie sich den ganzen Körper der Tiere mit einer 10-fachen Vergrößerungslinse vor (Abbildung 1A). Verwenden Sie für die Bildgebung einen FITC-Filter und die gleiche Belichtung für jedes Tier. Verwerfen Sie Objektträger nach der Bildgebung.
      HINWEIS: Alternativ können YFP-Herde auch direkt auf Platten quantifiziert werden, aber die Bewegung muss gehemmt werden, indem während des Scorings ein Kohlendioxidstrom auf die Platte aufgetragen wird. Diese alternative Methode eignet sich am besten für das Screening einer großen Anzahl von Bedingungen (siehe Diskussion für weitere Details).
    3. Zählen Sie nach der Aufnahme von Bildern die Anzahl der Herde in den Körperwandmuskeln des gesamten Tieres. Foci sind hellere punktuelle Signale, die von dem dimmerlöslichen Signal im Hintergrund unterschieden werden können.
    4. Zeichnen Sie den Verlauf der YFP-Foci-Akkumulation von Den Tagen 1, 2, 3 und 4 auf. Zeichnen Sie ein XY-Diagramm, wobei X die Tage des Erwachsenenalters und Y die Anzahl der unc-54p::p olyQ::YFP-Brennpunkte darstellt (Abbildung 1B). Die Anzahl der Herde im Versuchszustand (z.B. Gen-Downregulation oder Überexpression) wird mit Kontrolltieren verglichen. Führen Sie statistische Analysen zwischen den Gruppen zu jedem Zeitpunkt durch, der für jede Studie beobachtet wird.
      1. Wenn Sie die Herdezahlen für nur zwei Bedingungen vergleichen, führen Sie zu jedem Zeitpunkt einen unabhängigen Stichproben-t-Test durch.
      2. Wenn Sie herde Zählungen für mehr als zwei Bedingungen vergleichen, führen Sie für jeden Zeitpunkt eine Omnibus-Einweg-ANOVA-Analyse durch, einschließlich der Daten für alle Bedingungen zu diesem Zeitpunkt. Wenn die Omnibus-ANOVA einen signifikanten p-Wert ergibt (d. h. p < 0,005), führen Sie eine Post-hoc-Analyse mit paarweise unabhängigen Stichproben-t-Tests durch, um die spezifischen Bedingungen zu bestimmen, zwischen denen ein signifikanter Unterschied in den Herden festgestellt wurde (z. B. für die Gruppen A, B und C vergleichen Sie A & B, A & C und B & C).
  2. Messung der Lähmungsraten bei Tieren als Surrogat für Polyglutamin-Toxizität in Muskelzellen
    HINWEIS: Der altersabhängige Anstieg von PolyQ-Aggregaten im Muskel verursacht den Rückgang der Muskelfunktion, die die Fortbewegung antreibt. Dieser Defekt in der Fortbewegung kann durch Messung der progressiven Lähmungsrate bei polyQ-exprimierenden Tieren bestimmt werden. Für den Lähmungstest werden synchronisierte unc-54p::p olyQ::YFP-exprimierende Tiere an Tag 3, 5, 7 und 9 des Erwachsenenalters bewertet. Fügen Sie bei Bedarf zusätzliche Zeitpunkte hinzu, um den Bewertungsbereich zu erweitern, sodass Sie die Auswirkungen genetischer Störungen beurteilen können.
    1. Schauen Sie sich an den Wertungstagen (Tag 3, 5, 7 und 9 des Erwachsenenalters) die 6 cm großen Platten mit 50 Tieren an und notieren Sie die Anzahl der gelähmten Tiere. Gelähmte Tiere vom Teller nehmen. Wenn Tiere von der Platte gekrochen sind oder gestorben sind, sollten sie zensiert werden; Zeichnen Sie das Ereignis auf, damit es in der Analyse berücksichtigt werden kann.
      HINWEIS: Ein Tier gilt als gelähmt, wenn keine Bewegung beobachtet wird, nachdem es Licht oder sanften Berührungsreizen ausgesetzt wurde. Die Pharynxpumpenaktivität wird verwendet, um festzustellen, ob nicht bewegliche Tiere leben oder tot sind.
    2. Berechnen Sie nach Abschluss des Experiments die Lähmungsrate für jede Bedingung. Tun Sie dies zu jedem Zeitpunkt, indem Sie den Anteil der gelähmten Tiere durch die Gesamtzahl der Tiere teilen, die zu diesem Zeitpunkt für diesen Zustand beobachtet wurden. Wenn Sie mehrere Platten pro Bedingung und Zeitpunkt beobachten (d. h. Platten replizieren), berechnen Sie das Verhältnis für jedes Replikat separat.
    3. Zeichnen Sie den Verlauf der Lähmungsrate in einem XY-Diagramm (Streudiagramm) auf. X steht für Tage des Erwachsenenalters und Y für Lähmungsraten. Die Lähmungsrate von unc-54p::p olyQ::YFP-Tieren wird mit Kontrolltieren verglichen (Abbildung 1C). Führen Sie statistische Analysen zwischen den Gruppen durch; für mehrere Studien, behandeln Sie Studien unabhängig voneinander. Verwenden Sie die Cox-Proportional-Hazards-Regression und den Wald-Test. Die meisten Datenanalyse-Tools, die die Überlebensanalyse unterstützen, unterstützen auch die Cox-Modellierung.
      1. Transformieren der Daten: Jede Bedingung sollte zwei Spalten haben, eine für die Zeit und eine für "Ereignis". Fügen Sie zu jedem beobachteten Zeitpunkt eine Zeile mit "0" für jedes gelähmte Tier und eine "1" für jedes zensierte Tier hinzu. Die Gesamtzahl der Reihen sollte gleich der Anzahl der Starttiere auf dem Teller für diese Bedingung sein.
      2. Führen Sie die Cox Proportional-Hazards-Modellierung, gefolgt vom Wald-Test, gemäß den Anweisungen für Ihre Statistiksoftware durch. Ein univariates Modell eignet sich für typische Experimentdesigns. Für mehr als zwei Bedingungen, wenn ein Test mit allen enthaltenen Bedingungen ein signifikantes Ergebnis anzeigt (d. h. p < 0,005), können paarweise Tests zwischen Bedingungen durchgeführt werden, um das spezifische signifikante Paar von Bedingungen zu bestimmen.
        HINWEIS: Das Cox-Modell beruht auf der Annahme, dass die Testbedingung(en) die Wahrscheinlichkeit eines Ereignisses proportional über die Zeit modulieren. Dies bedeutet beispielsweise, dass das Cox-Modell nicht geeignet wäre, einen Zustand, unter dem die meisten Tiere an Tag 1 gelähmt sind, mit einem Zustand zu vergleichen, unter dem die meisten Tiere am Tag 9 gelähmt sind. Erweiterungen des Cox-Modells und andere Ansätze zum Vergleich von Anteilen, die zu jedem Zeitpunkt gelähmt sind, stehen für Fälle zur Verfügung, in denen die Annahme der proportionalen Gefahren nicht zutrifft, siehe27,28,29,30.

5. Messung des Rückgangs der Proteostase im neuronalen Gewebe unter Verwendung von Polyglutamin exprimierenden Tieren.

HINWEIS: Zwei komplementäre Methoden werden verwendet, um den Rückgang der Proteostase in Neuronen zu untersuchen(1) indem die Bildung von Proteinaggregaten (Fluoreszenzherden) während des Alterns quantifiziert wird und (2) der altersbedingte Rückgang des neuronalen Proteoms über einen bewegungsbasierten Assay gemessen wird.

  1. Abbildung der Bildung von Polyglutaminaggregaten in den Neuronen während des Alterns
    HINWEIS: Ähnlich wie bei dem bereits im Muskelgewebe diskutierten Assay wird das altersabhängige Fortschreiten der Proteinaggregation in den Neuronen durch Expression eines polyQ::YFP-Fusionsproteins abgebildet, das vom panneuronalen gewebespezifischen Promotor von rgef-1angetrieben wird. Konkret verwenden wir AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP], eine vierzig Glutamin-Fusion zu YFP16. Um rgef-1p::p olyQ::YFP zu visualisieren, verwenden Sie ein zusammengesetztes Mikroskop, das für die Fluoreszenz mit einer 40-fachen Vergrößerungslinse ausgestattet ist. AM101 ist beim CGC erhältlich unter: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. An Bildgebungstagen (Tag 4, 6, 8 und 10 des Erwachsenenalters) werden 20 Tiere entnommen und auf einem Objektträger montiert, der ein 3% iges Agarosepad mit einem 5-μL-Tropfen von 10 mM Natriumazid (verdünnt in M9-Puffer) enthält.
    2. Nachdem alle Tiere durch Natriumazid immobilisiert wurden (~ 5 Minuten), machen Sie Z-Stack-Bilder des Kopfes der Tiere mit einer 40-fachen Vergrößerungslinse (Abbildung 2A). Verwerfen Sie Objektträger nach der Bildgebung.
    3. Verarbeiten Sie nach der Aufnahme von Bildern z-Stacks, um die maximale Projektion zu erhalten, und quantifizieren Sie die Anzahl der Herde in Neuronen, die sich auf dem Nervenringbereich befinden. Foci sind hellere punktuelle Signale, die von dem dimmerlöslichen Signal im Hintergrund unterschieden werden können.
      HINWEIS: Wir haben speziell den Nervenringbereich ausgewählt, um rgef-1p::p olyQ::YFP-Aggregate zu quantifizieren, da dies die Region ist, in der die meisten Neuronen konvergieren, um synaptische Verbindungen herzustellen. Um jedoch die Aggregatbildung in Motoneuronen zu messen, können rgef-1p::p olyQ::YFP-Aggregate am dorsalen oder ventralen Nervenstrang quantifiziert werden.
    4. Zeichnen Sie den Verlauf der YFP-Foci-Akkumulation von D4, D6, D8 und D10 auf. Tun Sie dies in einem XY-Diagramm, in dem X für Die Tage des Erwachsenenalters und Y für die Anzahl der rgef-1p::p olyQ::YFP-Brennpunkte steht (Abbildung 2B). Die Anzahl der Herde im Versuchszustand (z.B. Gen-Downregulation oder Überexpression) wird mit Kontrolltieren verglichen. Die statistische Analyse der Herdezahlen für Neuronen erfolgt auf die gleiche Weise wie für Muskel-PolyQ-Herde; siehe Schritte 4.1.4 und die zugehörigen Hinweise.
  2. Messung von Körperbiegungen als Ersatzmaß für die Polyglutaminproteotoxizität in Neuronen.
    HINWEIS: Der proteotoxische Stress, der durch die progressive aggregierte Akkumulation von neuronalem PolyQ induziert wird, wird bestimmt, indem Motoneurondefekte durch einen Thrashing-Assay untersucht werden. Quantifizieren Sie die Anzahl der Körperbiegungen in einem Zeitraum von 30 Sekunden, während sie im physiologischen M9-Puffer suspendiert sind (Supplemental File 1).
    1. Nehmen Sie an Tag 2 des Erwachsenenalters 10 synchronisierte Tiere von der Platte und legen Sie sie auf einen 10-μL-Tropfen M9-Puffer auf einem Objektträger. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens viermal, um eine Probe von 40 oder mehr Tieren zu erhalten.
    2. Videoaufzeichnung der Bewegung der 10 Tiere auf dem Objektträger mit 10 μL M9-Puffer für einen Zeitraum von 30 s auf einem Stereomikroskop mit einer videofähigen Kamera. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 Mal für eine Gesamtstichprobenanzahl von 40. Zoom und Position sollten so eingestellt werden, dass alle Tiere für die vollen 30 Sekunden im Bild sichtbar sind.
    3. Sobald alle Videos mit den zu analysierenden Tieren aufgenommen wurden, spielen Sie das Video ab und bewerten Sie die Körperbeugen jedes Tieres. Eine Körperbeuge ist definiert, wenn die Vulva des Tieres von einer Seite zur gegenüberliegenden und den ganzen Weg zurück in die Ausgangsposition geht.
      HINWEIS: Wir finden, dass Wildtyptiere typischerweise 49 ± 0,79 Körperbeugen in 30 Sekunden haben.
    4. Zeichnen Sie die Anzahl der Körperbiegungen für jedes Tier in einem Säulendiagramm auf, wobei jeder Punkt die Anzahl der Körperbiegungen in 30 s (Y-Achse) mit den verschiedenen auf der X-Achse getesteten Bedingungen darstellt. Die Anzahl der Körperbiegungen von unc-54p::p olyQ::YFP-Tieren wird mit Kontrolltieren verglichen (Abbildung 2C). Führen Sie für jede Studie unabhängig statistische Analysen zwischen den Gruppen durch; Wenn der Assay zu mehreren Zeitpunkten wiederholt wird, analysieren Sie die Daten unabhängig für jeden Zeitpunkt.
      1. Wenn Sie nur zwei Bedingungen berücksichtigen, führen Sie einen unabhängigen Stichproben-t-Test durch.
      2. Wenn Sie mehr als zwei Bedingungen gleichzeitig berücksichtigen, führen Sie zunächst eine Omnibus-Einweg-ANOVA-Analyse durch, einschließlich der Daten für alle Bedingungen zu diesem Zeitpunkt/ Zeitpunkt. Wenn die Omnibus-ANOVA einen signifikanten p-Wert ergibt (d. h. p < 0,005), führen Sie eine Post-hoc-Analyse mit paarweise unabhängigen Stichproben-t-Tests durch, um die spezifischen Bedingungen zu bestimmen, zwischen denen ein signifikanter Unterschied in der Körperbiegezahl festgestellt wurde.

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Ergebnisse

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In C. eleganswar das Polyglutamin-Wiederholungsmodell maßgeblich an der Identifizierung von Genen beteiligt, die das proteostatische Netzwerk regulieren. Zum Beispiel haben wir zuvor gezeigt, dass die homöodomain-interagierende Proteinkinase (hpk-1), ein transkriptioneller Cofaktor, die Proteostase während des Alterns beeinflusst, indem sie die Expression der Autophagie und der molekularen Chaperone reguliert31. Wir fanden heraus, dass der Verlust von hpk-1,entweder durc...

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Diskussion

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Das Altern ist durch einen allmählichen Rückgang der Proteostase gekennzeichnet. Die Proteostase wird durch ein komplexes System, das proteostatische Netzwerk, zur koordinierten, dynamischen, stressreaktionsschnellen Steuerung von Proteinfaltung, -abbau und -translation aufrechterhalten. Warum die Proteostase im Laufe des Alterns versagt, ist kaum verstanden, aber ein zerfallendes Epigenom, eine abnehmende Induzierbarkeit von Stressreaktionen und der Verlust von kompensatorischem Crosstalk fallen alle mit diesem Zusammen...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Wir möchten den ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Samuelson-Labors für ihre Unterstützung bei der Verfeinerung dieser Methode und/oder Diskussion danken, die die Entwicklung dieses Manuskripts unterstützt hat. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute on Aging der National Institutes of Health unter den Award-Nummern RF1AG062593 und R21AG064519 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Well-KulturplattenGreiner Bio-One#662102
2 mL 96-Well-PlattenGreiner Bio-One#780286
600 µ L 96-Well-PlattenGreiner Bio-One#786261
96-poliger PlattenreplikatorNunc250520
Luftdurchlässige PlattendichtungVWR60941-086
bakteriologischer AgarAffymetrix/USB10906
Bacto-PeptonVWR90000-368
C. elegans RNAi-Klonbibliothek in HT115-Bakterien - AhringerQuelle: BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)Siehe auch Kamath et. al., Nature 2003.
C. elegans RNAi-Klonbibliothek in HT115-Bakterien- VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)Siehe auch Rual et. al., Genome Research 2004. Diese Bibliothek ist auch bei Dharmacon erhältlich.
FuDR (5-Fluor-2'-desoxyuridin)Alfa AesarL16497
Glasmikroskop-DeckgläserVWR48404-455
Glas-ObjektträgerVWR160004-422
IPTG (Isopropyl-beta-D-1-thigalactopyranosid)Gold Bio12481C100
Rechteckige, unbehandelte Single-Well-Platte, 128x86mmThermo-Fisher
Sodium Azide, CAS #26628-22-8Sigma-AldrichS2002
Zeiss Axio Imager M2m Mikroskop mit AxioVision v4.8.2.0 SoftwareZeissunbekannt
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad MikroskopZeissunbekannt
242811

Referenzen

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Proteostasis DeclineC elegans AgingPolyQ YFP ReporterTissue Specific ExpressionFluorescent Foci QuantificationLocomotion DefectsNeuronal ProteostasisMuscle ProteostasisGenetic AnalysisHPK 1 Regulation

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