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Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

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DOI:

10.3791/61112

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31. Mai 2020

 , 
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Zusammenfassung

Die vorgestellten Verfahren beschreiben eine verallgemeinerte Methodik zur Infektion von Aedes aegypti-Mücken mit dem Zika-Virus unter Laborbedingungen, um die Infektionsrate, die disseminierte Infektion und die mögliche Übertragung des Virus in der betreffenden Mückenpopulation zu bestimmen. Diese Verfahren werden weltweit mit verschiedenen Modifikationen in der Vektorkompetenzbewertung eingesetzt. Sie sind wichtig für die Bestimmung der potenziellen Rolle, die eine bestimmte Mücke (dh Art, Population, Individuum) bei der Übertragung eines bestimmten Erregers spielen kann.

Einleitung

Vektorkompetenz ist definiert als die Fähigkeit auf der Ebene der Art, der Population und sogar eines Individuums eines bestimmten Arthropoden wie einer Mücke, Zecke oder Phlebotin-Sandfliege, einen Wirkstoff biologisch mit Replikation oder Entwicklung im Arthropoden zu erwerben und zu übertragen1,2. In Bezug auf Moskitos und durch Arthropoden übertragene Viren (dh Arboviren) wird das Mittel von einem virämischen Wirt von einer weiblichen Mücke aufgenommen. Nach der Einnahme muss das Virus produktiv eine aus einer kleinen Population von Mitteldarmepithelzellen infizieren3und verschiedene physiologische Hindernisse wie den proteolytischen Abbau durch Verdauungsenzyme, das Vorhandensein der Mikrobiota (Mitteldarminfektionsbarriere oder MIB) und die sezernierte peritrophe Matrix überwinden. Auf die Infektion des Mitteldarmepithels muss eine Replikation des Virus und ein eventueller Austritt aus dem Mitteldarm in das offene Kreislaufsystem der Mücke oder Hämolymphe folgen, was den Beginn einer disseminierten Infektion darstellt, die die Mitteldarmfluchtbarriere (MEB) überwindet. Zu diesem Zeitpunkt kann das Virus Infektionen von sekundärem Gewebe (z. B. Nerven, Muskeln und Fettkörper) aufbauen und sich weiter replizieren, obwohl eine solche sekundäre Replikation möglicherweise nicht unbedingt notwendig ist, damit das Virus die Azinuszellen der Speicheldrüsen infizieren kann (Überwindung der Speicheldrüseninfektionsbarriere). Der Austritt aus den Acinarzellen der Speicheldrüse in ihre apikalen Hohlräume und die anschließende Bewegung in den Speichelgang ermöglicht die Impfung des Virus in nachfolgende Wirte beim Beißen und schließt den Übertragungszyklus1,2,4,5,6,7ab .

Angesichts dieses gut charakterisierten und allgemein erhaltenen Ausbreitungsmechanismus innerhalb eines Mückenvektors sind Laborvektor-Kompetenzbewertungen oft methodisch ähnlich, obwohl Unterschiede in den Protokollen bestehen1,2. Im Allgemeinen werden Moskitos nach oraler Virusexposition so seziert, dass einzelne Gewebe wie Mitteldarm, Beine, Eierstöcke oder Speicheldrüsen auf Virusinfektion, disseminierte Infektion, disseminierte Infektion / potenzielle transovariale Übertragung bzw. disseminierte Infektion / potenzielle Übertragungskompetenz untersucht werden können8. Das bloße Vorhandensein eines Virus in den Speicheldrüsen ist jedoch kein endgültiger Beweis für die Übertragungsfähigkeit, da hinweise auf eine Speicheldrüsen-Flucht-/Austrittsbarriere (SGEB) in einigen Vektor/Virus-Kombinationen1,2,4,5,7,9. Die Standardmethode zum Nachweis der Übertragungskompetenz bleibt die Mückenübertragung auf ein anfälliges Tier10,11,12. Da dies jedoch für viele Arboviren die Verwendung von immungeschwächten murinen Modellen13,14,15,16erfordert , ist diese Methode oft unerschwinglich. Eine häufig verwendete Alternative ist die Sammlung des Mückenspeichels, der durch reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder einen infektiösen Assay analysiert werden kann, um das Vorhandensein des viralen Genoms bzw. infektiöser Partikel nachzuweisen. Es ist erwähnenswert, dass solche In-vitro-Speichelentnahmemethoden12 oder 17 der während der In-vivo-Fütterung abgelagerten Virusmenge überschätzen oder unterschätzen können, was darauf hindeutet, dass solche Daten mit Vorsicht interpretiert werden müssen. Nichtsdestotrotz ist die In-vitro-Methode sehr wertvoll, wenn sie aus der Perspektive des bloßen Vorhandenseins von Viren im Speichel analysiert wird, was auf ein Übertragungspotenzial hinweist.

Es gibt zwei Hauptansätze, um die Rolle von Mückenvektoren bei arboviralen Krankheitsausbrüchen zu bestimmen. Die erste Methode beinhaltet die Feldüberwachung, bei der Moskitos im Rahmen der aktiven Übertragung18,19, 20,21,22,23,24gesammelt werden . Angesichts der Tatsache, dass die Infektionsraten jedoch in der Regel recht niedrig sind (z. B. die geschätzte Infektionsrate von Moskitos von 0,061% in Gebieten mit aktiver Zirkulation des Zika-Virus (ZIKV) in den Vereinigten Staaten21),kann die Belastung potenzieller Vektorarten durch die Fangmethodik25,26 und den Zufall (z. B. Probenahme einer infizierten Person von 1.600 nicht infizierten Personen) stark verzerrt sein21 . Unter Berücksichtigung dieser Tatsache kann eine bestimmte Studie nicht genügend Moskitos sowohl in der Rohzahl als auch in der Artenvielfalt erfassen, um Mücken, die an der Übertragung beteiligt sind, genau zu beproben. Im Gegensatz dazu werden Vektorkompetenzanalysen in einem Labor durchgeführt, was eine strenge Kontrolle von Parametern wie der oralen Dosis ermöglicht. Obwohl diese Laborbewertungen nicht vollständig in der Lage sind, die wahre Komplexität der Mückeninfektion und -übertragungsfähigkeit in einer Feldumgebung darzustellen, bleiben diese Laborbewertungen leistungsstarke Werkzeuge auf dem Gebiet der Arbovirologie.

Basierend auf verschiedenen Vektorkompetenzanalysen mit ZIKV in mehreren Mückenarten, Populationen und Methoden27,28,29,30,31,32, sowie einer aktuellen Überprüfung von Vektorkompetenzbewertungen 1 beschreiben wir hier einige der Protokolle, die miteinemtypischen Vektorkompetenz-Workflow verbunden sind. In diesen Experimenten wurden drei Ae. aegypti-Populationen aus Amerika (der Stadt Salvador, Brasilien; der Dominikanischen Republik; und dem unteren Rio Grande Valley, TX, USA) einem einzigen Stamm von ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) bei 4, 5 oder 6 log10 focus-forming units (FFU) / ml Dosen durch künstliche Blutmehle ausgesetzt. Anschließend wurden sie nach verschiedenen Zeiten extrinsischer Inkubation (2, 4, 7, 10 und 14 Tage) mittels Dissektion und einem zellkulturbasierten Infektionstest auf Hinweise auf Infektion, disseminierte Infektion und Übertragungskompetenz analysiert. Obwohl die derzeitigen Arbeitsabläufe/Protokolle für ZIKV optimiert sind, sind viele Elemente in den Arthropoden-Eindämmungs- und Biosicherheitsstufen 2 und 3 (ACL/BSL2 oder ACL/BSL3) direkt auf andere durch Mücken übertragene Arboviren übertragbar.

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Protokoll

Alle in diesen Protokollen durchgeführten Verfahren wurden in voller Übereinstimmung mit den Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Biosafety Committee und dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas Medical Branch in Galveston genehmigt wurden.

1. ZIKV in Vero-Zellen verstärken

  1. Züchten Sie Vero-Zellen (CCL-81 oder VeroE6) in Dulbeccos Modifikation von Eagles minimal essentiellem Medium (DMEM), ergänzt mit 10% v/v hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS) und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin (100 U/ml bzw. 100 μg/ml) in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 bis 80−90% Konfluenz in einem 150 cm2 Gewebekulturkolben.
  2. Entfernen Sie in einer Biosicherheitswerkbank (BSC) das Medium und entsorgen Sie es entweder in 10% Bleichmittel oder einer Arbeitsverdünnung von dualem quartärem Ammonium (Materialtabelle). Impfen Sie die Monoschicht sofort mit 1 ml Virusbestand, mit dem Ziel, 0,1−1 infektiöse Viruspartikel pro Zelle zu erhalten. Den Kolben sofort so rühren, dass das Inokulum die Monoschicht in seiner Gesamtheit berührt.
  3. Füllen Sie das Medium auf ein Volumen von 5 ml mit DMEM auf, das mit 2% v / v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Dann den Kolben für 60 min in den befeuchteten 37 °C Inkubator mit5% CO2 geben.
  4. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und bringen Sie ihn in ein BSC. Fügen Sie zusätzliches Medium zu einem Gesamtvolumen von 15 ml hinzu, indem Sie DMEM verwenden, das mit 2% v / v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Den Kolben in einen befeuchteten 37 °C Inkubator mit 5 %CO2 stellen.
  5. Untersuchen Sie den Kolben täglich unter Phasenkontrastmikroskopie auf Hinweise auf zytopathische Wirkungen (CPE). Fahren Sie mit der Virusernte (Schritt 1.7) fort, wenn nur etwa 40-50% der Zellen in der Monoschicht verbleiben, in der Regel 3-5 Tage nach der Infektion, abhängig vom verwendeten ZIKV-Stamm.
  6. Den Überstand ansaugen und in eine konische Durchstechflasche mit 50 ml geben. Klären Sie den Überstand von Zelltrümmern durch Zentrifugation (3.500 x g für 20 min).
    HINWEIS: Wenn mehrere Kolben identisch infiziert waren, können Überstände aus mehreren Kolben zu konischen 50-ml-Röhrchen kombiniert werden.
  7. Entfernen Sie den Überstand aus dem konischen 50-ml-Rohr zu einem frischen und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Ergänzen Sie den Überstand mit wärmeinaktiviertem FBS bis zu einer Endkonzentration von 30% (v/v). Aliquotieren Sie diese Mischung in einzelne Schraubverschlussrohre und frieren Sie bei -80 °C bis zum Gebrauch ein.

2. Herstellung von künstlichen Blutmehlen

  1. An dem Tag, an dem Moskitos infektiösen Blutmehlen ausgesetzt werden sollen, schalten Sie die Stromquelle ( Table of Materials ) in einer Arthropoden-Eindämmungseinrichtung so ein, dass die Fütterungseinheiten (Table of Materials) vorgewärmt sind, wenn die Moskitos für die Exposition vorbereitet sind.
  2. Bereiten Sie künstliche Blutmehle mit einer der unten beschriebenen Methoden vor.
    1. Methode 1: Frisch geerntetes (innerhalb einer Woche) zitriertes oder heparinisiertes menschliches Blut, das im Handel gekauft wurde, 1:1 v/v mit Virusmaterial (hergestellt wie in Abschnitt 1 beschrieben) kombinieren.
      HINWEIS: Diese Methode ist davon abhängig, dass im Blut keine Antikörper gegen das Virus/die Virusfamilie vorhanden sind.
    2. Wenn das Fehlen von Antikörpern nicht bestätigt werden kann oder bekannt ist, dass die Blutquelle zuvor flavivirusexpositioniert ist, waschen und verpacken Sie die Erythrozyten manuell.
      1. In einem BSC 30 ml menschliches Vollblut in ein 50 mL konisches Rohr geben und bis zu 50 ml mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auffüllen.
      2. Zentrifuge bei 3.500 x g für 20 min.
      3. Aspirieren Sie den Überstand entweder durch vorsichtiges Gießen in eine Schalenpfanne, die entweder 10% Bleichmittel enthält, oder durch Arbeitsverdünnung von dualem quartärem Ammonium, wobei darauf zu achten ist, dass das Erythrozytenpellet nicht verworfen wird.
      4. Fügen Sie 10 ml PBS hinzu und klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des konischen Röhrchens gegen den Boden des BSC, so dass das Erythrozytenpellet rekonstituiert wurde. Bringen Sie das Volumen der Suspension mit PBS auf bis zu 50 ml. Durch sanfte Inversion mischen.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2.1−2.2.2.4 insgesamt 4−6x. Bestätigen Sie, dass der Überstand klar oder nur leicht rosa und nicht mehr undurchsichtig ist. Entfernen Sie den gesamten Überstand mit einer serologischen Pipette. Resuspendieren Sie das Erythrozytenpellet in 1−2 ml PBS.
      6. Setzen Sie das Blutmehl zusammen: 350 μL gepackte Erythrozyten, 100 μL 10% Saccharose, 200 μL hitzeinaktiviertes FBS, 900 μM rekombinantes ATP und 2 ml entsprechend verdünntes Virusmaterial unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 2% v/v hitzeinaktiviertem FBS und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
  3. Überlagern Sie eine Standard-3-ml-Reservoireinheit(Materialtabelle)mit der Haut einer nicht infizierten Maus (andere Optionen umfassen Paraffinfilm, kollagene Membranen oder Wursthülle).
  4. Legen Sie den überdachten Behälter auf weiße Papiertücher. Fügen Sie ~ 2 ml infektiöses Blutmehl zu dem Reservoir 1 ml auf einmal hinzu. Untersuchen Sie das Handtuch unter dem Feeder auf Anzeichen von Leckagen. Wenn Leckagen vorhanden sind, holen Sie das Blutmehl aus den Feedern zurück und entsorgen Sie die Abdeckungen. Verschließen Sie die Feeder mit Stopfen. Bestätigen Sie erneut, dass keine Lecks vorhanden sind.

3. Backtitration von Blutmehl/Plaque-Assay

  1. Unter Verwendung des verbleibenden Volumens des vorbereiteten Blutmehls wird eine 10-fache serielle Verdünnungsreihe (d. h. 6 Verdünnungen, die von 10x bis 1.000.000x verdünnt sind) unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 2% v/v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin, durchgeführt.
  2. Aliquot 100 μL der Verdünnungen in die Vertiefungen von 24 oder 12 Well Platten von den am meisten verdünnten bis zu den konzentriertesten.
  3. Inkubieren Sie für 1 h in einem 37 °C, 5% CO2 Inkubator.
  4. Am Ende der 1-stündigen Inkubationszeit werden die Platten wieder in das BSC gebracht und 1 ml oder 2 ml Methylcellulose-Overlay entsprechend in die 24 Well- oder 12 Well-Platten gegeben.
  5. Legen Sie die überlagerten Platten wieder in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator und inkubieren Sie für 3-7 Tage (virusstammabhängig).
  6. Nach der Inkubation die Platten aus dem Inkubator entfernen und in den BSC bringen. Entsorgen Sie das Methylcellulose-Overlay in eine Schalenpfanne, die 10% Bleichmittel oder duales quartäres Ammoniumdesinfektionsmittel enthält.
  7. Waschen Sie jede Vertiefung 2x mit PBS und entsorgen Sie die Wäsche in eine Schalenpfanne mit 10% Bleichmittel oder dualem quartärem Ammonium.
  8. Fügen Sie ~ 1 ml Methanol: Aceton (1: 1 v: v) hinzu und lassen Sie die Zellen mindestens 30 minuten lang im BSC bei Raumtemperatur (RT) auf der Platte fixieren. Entsorgung von Methanol:Aceton gemäß der institutionellen Politik für organische Abfälle.
  9. Visualisieren Sie ZIKV mit einer von zwei unten beschriebenen Methoden.
    1. Nach der Entfernung von Methanol:Aceton sofort mit einer kristallvioletten Lösung (0,25% w/v in 30% Methanol) für 5 min einfärben. 2x in Leitungswasser abspülen und trocknen lassen, dann direkt mit dem Auge sichtbar machen, um Hinweise auf Plaques oder Zerstörung der Monoschicht zu erhalten.
    2. Alternativ können Sie einen Fokusformungsassay durchführen.
      1. Lassen Sie die Platten an der Luft trocknen, bis kein organisches Fixiermittel mehr übrig ist.
        HINWEIS: Dies sollte ~ 2−3 h außerhalb des BSC dauern, kann aber durch Lufttrocknung in einem BSC oder chemischen Abzug beschleunigt werden.
      2. Jede Vertiefung 3x für jeweils 15 min in nichtsterilem PBS(Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen. Entfernen Sie PBS und geben Sie 1 ml Blockierungslösung (PBS + 3% FBS) zu jeder Vertiefung und gestein für 15 min bei RT.
      3. 100 μL pro Vertiefung α-ZIKV- oder α-Flavivirus-Primärantikörper (z. B. Flavivirus-Gruppenhybrioma D1-4G2-4-15 [4G2]) in einer Verdünnung von 1:2.000 in Blocklösung zugeben. Inkubieren mit Schaukeln für mindestens 4 h (vorzugsweise über Nacht, nicht mehr als 18 h) bei RT.
      4. Den primären Antikörper entfernen und 3x für jeweils 15 min mit PBS(Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen.
      5. Fügen Sie 100 μL pro Vertiefung des sekundären Antikörpers (Ziegen- α Maus-HRP-markiert) hinzu, der 1:2.000 in blocking buffer verdünnt ist. Inkubieren Sie mit Schaukeln für 1 h bei RT.
      6. 3x für je 15 min mit PBS (Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen.
      7. Aliquot 100 μL Substratentwicklungsreagenz (Materialtabelle) pro Vertiefung. Gesteinsplatten bei RT für 15 min.
      8. Stoppen Sie die Reaktion bei der Entwicklung von Herden / Plaques, indem Sie das Substrat entfernen und die Platten 2x mit Leitungswasser spülen. Gießen Sie Leitungswasser ab und lassen Sie die Platten vor der Quantifizierung an der Luft trocknen.
      9. Zählen Sie virale Herde, um die Anzahl der in der gegebenen Probe vorhandenen FFU zu bestimmen.

4. Verabreichung von Blutmehl

  1. Verwenden Sie Ae. aegypti Moskitos 2-4 Tage nach der Eklosion. Sortieren Sie weibliche Moskitos in 0,5-Liter-Kartons mit abgeschirmten Deckeln und entziehen Sie ihnen Zucker (im Allgemeinen 36-48 h vor dem infektiösen Blutmehl). Geben Sie ad libitum Wasser über wassergesättigte Wattebällchen.
  2. Entfernen Sie die wassergesättigten Wattebällchen an dem Morgen, an dem die Moskitos dem infektiösen Blutmehl ausgesetzt sind.
  3. Befestigen Sie Behälter mit künstlichen Blutmehlen an den Leitungen der Fütterungseinheit in einem durchsichtigen Kunststoffhandschuhfach.
  4. Legen Sie im Handschuhfach einen 0,5-Liter-Karton mit einem abgeschirmten Deckel mit 50−100 ausgehungerten Ae. aegypti-Mücken unter die am Reservoir befestigte Futtereinheit.
    HINWEIS: Entsprechend ausgehungerte Moskitos fressen in der Regel innerhalb von 20 Minuten. Die Fütterung kann bei Bedarf verlängert werden, um die Stichprobengröße in langsameren Populationen zu erhöhen, obwohl dies nicht über 60 minuten hinausgehen sollte, da der (ZIKV) Virustiter nach ~ 60 minuten im Feeder abnehmen kann.
  5. Nach Abschluss der Fütterung entfernen Sie das Reservoir und tauchen Sie es in frisch hergestelltes 10% Bleichmittel ein.
  6. Kaltanästhesieren Sie Moskitos durch Inkubation für 30 s bei -20 ° C oder für 5 minuten im Kühlschrank.
  7. Gießen Sie die Moskitos im Handschuhfach in eine Petrischale auf Eis. Zählen und sortieren Sie die geschwollenen Weibchen von ungeschmiedeten Moskitos. Entsorgen Sie die ungefederten Moskitos durch Eintauchen in ein 50 ml langes konisches Röhrchen, das mit 70% Ethanol gefüllt ist. Während die Moskitos noch betäubt sind, gießen Sie sie zurück in den 0,5 L Karton und decken Sie sie schnell mit dem Bildschirm und dem Deckel ab. Schneiden Sie überschüssiges Siebnetz vom Karton ab und sichern Sie das Netz mit Klebeband.
  8. Fügen Sie einen Wattebausch hinzu, der mit steriler gefilterter 10% wässriger Saccharose gesättigt ist, zum Sieb jedes Kartons. Legen Sie alle Mückenkartons in einen großen Sekundärbehälter aus Kunststoff mit einem feuchten Schwamm, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
  9. Stellen Sie einen sekundären Behälter mit Kartons mit Moskitos in einen Inkubator mit einer Temperatur von 27 ± 1 ° C (oder je nach Bedarf zur Simulation von Bedingungen in der Region von Interesse) mit 80% ± 10% relativer Luftfeuchtigkeit und einem 16: 8 Hell: Dunkel-Zyklus). Halten Sie die Moskitos mit Ad-libitum-Zugang zu 10% Saccharose bis zum Abschluss der Experimente aufrecht.

5. Probenentnahme und -verarbeitung

  1. An bestimmten Tagen nach der Fütterung saugen Sie eine vorbestimmte Anzahl von Moskitos aus den entsprechenden Kartons mit einem mechanischen Aspirator in einem Handschuhfach ab. Schließen Sie das Auffangrohr mit einer Baumwollrunde ab, nachdem die erforderliche Anzahl von Moskitos erworben wurde.
  2. Kaltanästhesie von Moskitos durch Inkubation für 30 Sekunden bei -20 ° C oder für 5 Minuten bei 4 ° C.
  3. Gießen Sie die Moskitos im Handschuhfach in eine Petrischale auf Eis. Entfernen Sie mit zwei Pinzettenpaaren alle sechs Beine jeder Mücke und legen Sie sie in ein voretikettiertes 2 ml rundes Mikrozentrifugenrohr mit einem sterilisierten Edelstahlkugellager (7/32 ") und 500 μL Mückensammelmedium (MCM), bestehend aus DMEM, 2% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin und 2,5 μg / ml Amphotericin.
  4. Legen Sie die Mücke vorsichtig auf einen Tropfen Mineralöl, um sie zurückzuhalten, und achten Sie darauf, dass kein Kontakt zwischen dem Öl und dem Kopf und dem Rüssel der Mücke zulässt.
  5. Führen Sie den Mückenboss in eine 10 μL Pipettenspitze ein, die mit 10 μL wärmeinaktiviertem FBS gefüllt ist.
    HINWEIS: Alternativ kann die Pipette mit Saccharose, Blut oder Mineralöl gefüllt werden. Das Öl ermöglicht die direkte Visualisierung von Speichelblasen mittels Lichtmikroskopie.
  6. Lassen Sie die Mücke 30 Minuten lang speicheln. Werfen Sie die Mikropipettenspitze, die FBS + Speichel enthält, in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μL MCM aus und legen Sie dann den Korpus in ein separates 2 ml rundes Mikrozentrifugenrohr mit einem sterilisierten Stahlkugellager und 500 μL MCM. Stellen Sie sicher, dass die für Körper, Beine und Speichel verwendeten Röhrchen so gekennzeichnet sind, dass klar ist, dass alle drei Proben von derselben Mücke stammen.
  7. Während die Mücken speicheln, führen Sie die Schritte 5,3-5,5 bei den verbleibenden Moskitos durch.
  8. Transportieren Sie die Röhrchen, die die Körper und Beine enthalten, zu einer Homogenisierungsvorrichtung für das Perlenmahlgewebe, die in einem BSC enthalten ist. Alle Körper- und Beinproben bei 26 Hz für 5 min verdrieren, um virale Partikel in den Überstand freizusetzen. Klären Sie alle Proben durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min, um Zelltrümmer zu pelletieren.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei -80 °C eingefroren oder sofort untersucht werden.

6. Nachweis von ZIKV durch Infektiologie-Assay

  1. Bereiten Sie in einem BSC 24 h vor Beginn des infektiösen Assays 24 Well-Gewebekulturplatten mit Vero-Zellen (105 Zellen pro Well) vor. Beschriften Sie jede Vertiefung mit der Identität einer einzelnen Mücke / Probe.
  2. Wenn die Proben bei -80 °C eingefroren wurden, lassen Sie sie auftauen.
  3. Entfernen Sie das Medium vor der Impfung mit Proben eine Platte nach der anderen von den Vero-Zellplatten.
  4. Bei Proben, die Körper oder Beine enthalten, vorsichtig 100 μL geklärten Überstand in jede Vertiefung aliquotieren, wobei darauf zu achten ist, dass die Mückenzellablagerungen aus dem Pellet nicht gestört werden.
    HINWEIS: Speichelproben können vor der Impfung auf Zellen 1:1 (v/v) mit MCM verdünnt werden, um die Proben für eine spätere Titration zu konservieren, falls erforderlich.
  5. Die Platten in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator geben und 1 h inkubieren.
  6. Bringen Sie die Platten zum BSC zurück und fügen Sie ~ 1 ml Methylcellulose-Overlay zu jeder Vertiefung hinzu. Legen Sie die überlagerten Platten wieder in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator und inkubieren Sie sie für 3−7 Tage (virus-/stammabhängig).
  7. Führen Sie die Fixierung und Visualisierung wie in den Schritten 3.6 bis 3.9 beschrieben durch.
  8. Quantifizieren Sie in Bezug auf das Scoring über einen Fokusformungsassay die positiven Vertiefungen durch Untersuchung unter einem Lichtmikroskop. Der Nachweis einer intrazytoplasmatischen Färbung von Zellen in einem Brunnen weist auf das Vorhandensein eines Virus hin. Stichproben werden ausschließlich als Fokus-positiv oder -negativ bewertet.

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Ergebnisse

Drei Populationen von Ae. aegypti aus Amerika (Salvador, Brasilien; die Dominikanische Republik; und das Rio Grande Valley, TX, USA) wurden einem Ausbruchsstamm von ZIKV aus Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas State, Mexiko, 2015) über eine Reihe von Blutmehltitern (4, 5 und 6 log10 FFU / ml) ausgesetzt, die in einem gewaschenen künstlichen Blutmehl auf der Basis von menschlichen Erythrozyten präsentiert wurden. An den Tagen 2, 4, 7, 10 und 14 nach der Infektion wurden Untergruppen von Moskitos verarbeitet...

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Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden bieten einen verallgemeinerten Workflow zur Durchführung von Vektorkompetenzanalysen. Als allgemeiner Rahmen sind viele dieser Methoden in der Literatur erhalten. Es gibt jedoch erheblichen Spielraum für Änderungen (überprüft in Azar und Weaver1). Virus (z. B. virale Abstammung, Speicherung des Challenge-Virus, virale Passage-Geschichte), Entomologie (z. B. Laborbesiedlung von Mückenpopulationen, angeborene Immunität, das Mückenmikrobiom / -virom) und experimentelle...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Wir danken den Mitarbeitern des World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton und Divya Mirchandani, für ihre unermüdliche Arbeit bei der Kuratierung und Bereitstellung vieler der Virusstämme, die für die Vektorkompetenzexperimente unserer und anderer Gruppen verwendet werden. Die vorgestellten Arbeiten wurden durch den McLaughlin Fellowship Fund (SRA) und die NIH-Zuschüsse AI120942 und AI121452 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3mL Standard ReservoirR37P30Hemotek LtdInsektenausrüstung
7/32" Edelstahl 440 Grad C Kugeln4RJH9GraingerSchleifkörper
Aceton, histologische Qualität, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/KartonA16-P4FisherScientificFixiermittel
Adenosin 5'-triphospat Dinatriumsalzhydrat, mikrobiell, BioReagenz, geeignet für Zellen KulturA6419-1GMilliporeSigmaReagenz
Anti-Flavivirus-Gruppe Antigen Antikörper, Klon D1-4G2-4-15MAB10216MilliporeSigmaPrimärer Antikörper für fokusbildenden Assay
Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper, humanes Serum adsorbiert und peroxidase-markiert, 1,0 ml/Flasche5450-0011KPL/SeracareSekundärer Antikörper für fokusbildenden
Assay BleicheNC0427256FisherScientificDekontamination
Corning, mit Zellkulturen behandelte Kolben, 150 cm2, belüfteter Deckel, Karton mit 5010-126-34FisherScientificVerbrauchsmaterial für Zellkulturen
Costar Zellkulturplatten, 24 Wells, 5/Beutel, 100/Karton, Corning07-200-740FisherScientificZellkultur-Verbrauchsmaterial
Costar Zellkulturplatten, 96 Wells, 5/Beutel, 100/Karton, Corning07-200-91FisherScientificVerbrauchsmaterial für Zellkulturen
Crystal VioletC0775-100GMilliporeSigmaStain
Eppendorf Snap Cap Mikrozentrifuge Safe-Lock 2 ml-Röhrchen, 500/Karton05-402-7FisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
Falcon 15 ml konische Zentrigue-Röhrchen14-959-70CFisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
Falcon 50 ml konische Zentrigue-Röhrchen14-959-49AFisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 10 ml, 200/Karton13-675-20FisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 1 ml, 1000/Karton13-675-15BFisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 25 ml, 200/Karton13-675-30FisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol, 5 ml, 200/Karton13-675-22FisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
Falcon Standard-Gewebekulturschalen08-772BFisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
fötales Rinderserum-Premium, 500 mlS11150Atlanta BiologicalsZellkultur-Reagenz
Fisherbrand Economy Mikroskopobjektträger aus Glas12-550-A3FisherScientificImmobilisierung von Mücken
FU1 FeederFU1-0Hemotek LtdInsektenausrüstung; Fütterungseinheiten
Gibco DPBS mit Calcium und Magnesium, 10 x 500 mL Flaschen140-040-182FisherScientificZellkulturreagenz
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250 μm; g/ml, 50 ml/Flasche15-290-026Fisher ScientificZellkulturreagenz
Gibco Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml), 100 ml/Flasche, 20 Flaschen/Karton15-140-163FisherScientificZellkulturreagenz
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenolrot, 20 x 100 ml Flaschen25-200-114FisherScientificZellkulturreagenz
Gibcom DMEM, hoher Glukosegehalt, 10 x 500 ml Flaschen11-965-118FisherScientificZellkultur-Reagenz
Menschliches Blut, nicht näher bezeichnetes Geschlecht, Na-Citrat, 1 Einheit7203706LampireBloodmeal Zubereitung
InsectaVac Aspirator2809BBioquipInsektenausrüstung
Methanol, zertifiziertes ACS, Fisher Chemicals, Braunglasflasche, 4L, 4/KartonA412-4FisherScientificFixiermittel
Methylcellulose, Viskosität: 3.500-5.600 cP, 2 % in Wasser (20 &de; C), 250g/FlascheM0512-250GMilliporeSigmaZellkultur-Reagenz
Micro-chem Plus Desinfektionsmittel ReinigungsmittelC849T34Thomas ScientificDekontamination; Arbeitsverdünnung von dualem quartärem Ammonium
Mineralöl, BioReagenz, für die MolekularbiologieM5904-5X5MLMilliporeSigmaImmobilisierung von Moskitos
O-RingeOR37-25Hemotek LtdInsektenausrüstung
KunststoffstopfenPP5-250Hemotek LtdInsektenausrüstung
PS6 Netzteil (110-120V)PS6120Hemotek LtdInsektenausrüstung; Stromquelle
Rubis Pinzette, Offset-Klingen, superfeine Spitzen4525BioquipInsektenausrüstung
Sarstedt Inc., 2 ml Mikroröhrchen mit Schraubverschluss, konischer Boden, O-Ring-Kappe, steril, 1000/Karton50-809-242FisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
Saccharose, BioUltra, für die Molekularbiologie84097-250GMilliporeSigmaReagenz
ThermoScientific, ART Barriere Niedrige Retention 1000 μm; L Pipettenspitzen, 100 Spitzen/Rack, 8 Racks/Packung, 4 Packungen/Karton21-402-487FisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μ L Pipettenspitzen, 96 Spitzen/Rack, 10 Racks/Packung, 5 Packungen/Karton21-402-486FisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μ L Pipettenspitzen, 96 Spitzen/Rack, 10 Racks/Packung, 5 Packungen/Karton21-402-484FisherScientificKunststoff-Verbrauchsmaterial
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μ L Pipettenspitzen, 96 Spitzen/Rack, 10 Racks/Packung, 5 Packungen/Karton21-402-482FisherScientific
TissueLyser II85300QIAGENHomogenisierung
TrueBlue Peroxidase Substrat Kit, 200 ml5510-0030SeracareEntwicklungslösung für fokusbildende Assays
VeroCCL-81American Type Culture CollectionSäugetierzelllinie zur Amplifikation des Virus und zur Durchführung eines infektiösen Assays
Vero C1008 [Vero 76, Klon E6, Vero E6]CRL-1586Amerikanische KultursammlungSäugetierzelllinie zur Amplifikation des Virus und zur Durchführung eines infektiösen Assays
Stück für

Referenzen

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