Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Worm-align/Worm_CP ist ein einfacher FIJI/CellProfiler-Workflow, der verwendet werden kann, um Caenorhabditis elegans-Proben zu begradigen und auszurichten und bildbasierte Tests zu bewerten, ohne dass vorherige Trainingsschritte erforderlich sind. Wir haben Worm-align/Worm_CP auf die Quantifizierung der hitzeschockinduzierten Expression bei lebenden Tieren oder Lipidtröpfchen in festen Proben angewendet.

Zusammenfassung

Ein Problem, das häufig beim Erfassen von Bilddaten von festen oder anästhesierten C. elegans auftritt, ist, dass Würmer sich mit ihren Nachbarn kreuzen und gruppieren. Dieses Problem verschärft sich durch die zunehmende Dichte von Würmern und schafft Herausforderungen für die Bildgebung und Quantifizierung. Wir haben einen FIJI-basierten Workflow, Worm-align, entwickelt, der verwendet werden kann, um Ein- oder Mehrkanalmontagen von vom Benutzer ausgewählten, begradigten und ausgerichteten Würmern aus Rohbilddaten von C. elegans zu generieren. Worm-align ist ein einfacher und benutzerfreundlicher Workflow, der weder eine vorherige Schulung des Benutzers noch des Analysealgorithmus erfordert. Mit Worm-align erzeugte Montagen können die visuelle Inspektion von Würmern, deren Klassifizierung und Darstellung unterstützen. Darüber hinaus kann die Ausgabe von Worm-align für die nachfolgende Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Würmern verwendet werden, entweder in FIJI direkt oder in anderen Bildanalyse-Softwareplattformen. Wir demonstrieren dies, indem wir die Wurm-Align-Ausgabe in Worm_CP importieren, eine Pipeline, die die Open-Source-Software CellProfiler verwendet. Die Flexibilität von CellProfiler ermöglicht die Integration zusätzlicher Module für das High-Content-Screening. Als praktisches Beispiel haben wir die Pipeline auf zwei Datensätzen verwendet: Der erste Datensatz sind Bilder von Hitzeschock-Reporterwürmern, die unter der Kontrolle des Promotors eines Hitzeschock-induzierbaren Gens hsp-70grünes fluoreszierendes Protein (GFP) ausdrücken, und der zweite Datensatz sind Bilder, die von festen Würmern gewonnen wurden, die für Fettspeicher mit einem fluoreszierenden Farbstoff gebeizt wurden.

Einleitung

Ein relativ einfacher Organismus, die Nematode C. elegans, ist ein äußerst nützliches Modellsystem zur Untersuchung menschlicher Krankheiten. Etwa 38% der Gene im C. elegans Genom haben funktionelle Gegenstücke beim Menschen^1,2. Eines der einzigartigen Merkmale von C. elegans ist, dass es optisch transparent ist und einen einfachen Zugang zu In-vivo-Informationen über die (sub-)zelluläre Expression von fluoreszierenden Reportern über Gewebe hinweg ermöglicht. Dies macht C. elegans zu einem erstklassigen Modellorganismus für bildschirmreiche Bildschirme mit hoher Inhalte mit bildbasierten Plattformen³. Ein Problem, das diese Studien oft erschwert, ist jedoch, dass sie bei der Abbildung dichter Populationen von Würmern dazu neigen, sich zu kreuzen und zu bündeln, indem sie Vergleiche zwischen einzelnen Würmern herausfordern, die nachgelagerte Bildanalyse und -quantifizierung trüben.

Vorhandene Lösungen, die dieses Problem lösen, basieren in der Regel auf der Optimierung des Kultivierungs- und Bildgebungsprotokolls, z. B. durch die Verwendung von Mikrofluidik-Setups⁴, so dass einzelne Würmer in separaten Bildern erfasst werden können^5,6. Andere haben maschinelle Lernalgorithmen angewendet, die die Erkennung einzelner Würmer ermöglichen, selbst in einer verklumpten Population. Ein hervorragendes Beispiel dafür ist die WormToolbox, eine modulare Erweiterung der Open-Source-Bildanalyseplattform CellProfiler⁷. WormToolbox bietet eine Lösung mit hohem Durchsatz und hohem Inhalt für die Analyse von C. elegansund profitiert eindeutig von der Aufnahme in CellProfiler, da zusätzliche Analysemodule problemlos einbezogen werden können. Obwohl WormToolbox mit einem vortrainierten Modell (DefaultWormModel.xml geliefert wird, ist in der Regel für jede neue Anwendung eine Umschulung des Machine-Learning-Algorithmus erforderlich. Online-Tutorials dazu sind auf Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/) verfügbar. Trotzdem erfordert die Installation und Verwendung von WormToolbox eine erhebliche Zeitinvestition für unerfahrene Benutzer.

Hier beschreiben wir ein einfaches und kosten- und zeiteffektives Protokoll zur Kultur und Imagepopulationen von C. elegans. Um die Beurteilung einzelner Würmer in den aufgenommenen Bildern zu ermöglichen, haben wir einen einfachen Open-Source-WORKFLOW auf FIJI-Basis namens Worm-align entwickelt. Worm-align kann verwendet werden, um Ein- oder Mehrkanalmontagen von begradigten und ausgerichteten Würmern zu erzeugen. Zunächst muss der Benutzer einzelne Würmer für die Analyse manuell auswählen, indem er eine Linie vom Kopf zum Schwanz zeichnet. Worm-align verwendet diese Auswahl, um ausgewählte Würmer aus dem Übersichtsbild zuzuschneiden und eine Montage zu generieren, in der ausgewählte Würmer begradigt und ausgerichtet werden, um den visuellen Vergleich und die Präsentation zu erleichtern.

Darüber hinaus kann die Ausgabe von Worm-align für die nachfolgende Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Würmern verwendet werden, entweder in FIJI direkt oder in anderen Bildanalyse-Softwareplattformen. Wir demonstrieren dies, indem wir die Wurm-Align-Ausgabe in Worm_CP importieren, eine Pipeline, die die Open-Source-Software CellProfiler verwendet. Die Flexibilität von CellProfiler ermöglicht die Integration zusätzlicher Module für das High-Content-Screening. Wir haben die Worm_CP-Pipeline verwendet, um die Wärmeschock-Reaktion zu quantifizieren, einen gut erhaltenen Schutzmechanismus, der Proteine, die aufgrund von Stressoren wie Hochtemperatur⁸falsch gefaltet werden, neu faltet. Insbesondere haben wir die Pipeline auf Würmer mit einem integrierten Multi-Copy-Transgen angewendet, wo der Promotor eines Hitzeschock-induzierbaren Gens, hsp-70(C12C8.1), grünes fluoreszierendes Protein (GFP)⁹antreibt. Wir haben auch die Worm_CP-Pipeline für feste Tiere verwendet, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekennzeichnet wurden, der Lipidtröpfchen (LDs), die Hauptfettspeicherorganelle in C. elegans¹⁰visualisiert. Obwohl dieser Workflow nicht den von WormToolBox angebotenen Durchsatz hat, ist er eine benutzerfreundliche und einfache Alternative zur visuellen Darstellung und Analyse bildbasierter C. elegans-Experimente.

Protokoll

1. Fixierung von Würmern für die Fettgehalt-Bildgebung mit einem Fluoreszenzfarbstoff für Lipidtröpfchen (BODIPY)¹⁰

1. Bereiten Sie eine synchronisierte Population von C. elegans durch Bleichen nach Standardverfahren²vor. Platte ca. 1.000 L1-Stufige Würmer auf eine 9 cm Nematoden-Wachstumsmedienplatte (NGM) pro Zustand.
   HINWEIS: Es werden mehr Würmer vorbereitet, als am Ende tatsächlich quantifiziert wurden, da würmer verloren gehen.
2. Um Tiere im Stadium junger Erwachsener (ca. 50 h nach L1-Beschichtung bei 20 °C) abzubilden, waschen Sie jede 9 cm Platte mit 15 ml M9 in einem konischen Rohr, Zentrifuge bei 252 x g für 1 min, und entfernen Sie den Überstand.
3. Wiederholen Sie die Wäsche und lassen Sie 1 ml M9 über dem Pellet der Würmer.
4. Übertragen Sie 1 ml M9 mit den Würmern in einem 2 ml eiweißbindenden Mikrozentrifugenrohr mit niedrigen Retentionsspitzen.
5. Drehen Sie bei 252 x g in einer Mikrozentrifuge für 1 min und entfernen Sie den Überstand, wobei Sie darauf achten, das Wurmpellet an der Unterseite des Rohres nicht zu berühren.
6. Zur Überwachung des Fettgehalts mit 4,4-Difluor-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen (BODIPY) Färbung^{1 0} (Materialtabelle), fixieren Würmer entweder durch Zugabe von 0,5 ml 60% Isopropanol zum Schneckenpellet für 3 min¹¹, oder durch Zugabe von 2 ml eiskaltem Methanol für 10 min. Für beide Verfahren, invertieren Sie das Rohr alle 30 s.
   VORSICHT: Wenn Methanol das gewählte Fixationsreagenz ist, muss dieser Schritt aufgrund seiner Toxizität in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden.
7. Entfernen Sie so viel fixative wie möglich, ohne das Wurmpellet zu berühren und fügen Sie 1 ml M9 hinzu. Lassen Sie die Würmer an der Unterseite des Rohres für 3-5 min absetzen.
8. Mit 1 ml M9 erneut waschen, die Würmer absetzen lassen und den Überstand entfernen lassen, so dass ca. 50 l im Rohr bleiben. Sichern Sie das Rohr mit einer Klemme.
9. Die Würmer einfrieren, indem Sie das sicher geschlossene Rohr in flüssigen Stickstoff eintauchen und dann bei 40 °C in ein Warmwasserbad eintauchen.
10. Wiederholen Sie Schritt 1.9 noch einmal.
11. Fügen Sie 0,5 ml BODIPY in M9 bei einer Endkonzentration von 1 g/l verdünnt und auf einen Rotator bei Raumtemperatur für 1 h legen.
12. Nach 1 h lassen Sie die Würmer 3 bis 5 min am Boden des Rohres absetzen.
13. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml M9 hinzu.
14. Lassen Sie die Würmer am Boden absetzen und überstand entfernen.
    HINWEIS: Alternativ ist es möglich, bei 252 x g für 1 min zu drehen, da dies die Morphologie nicht zu beeinflussen scheint.
15. Fügen Sie 0,5 ml M9 hinzu.
    HINWEIS: Wenn das Fixativ 60% Isopropanol ist, können die Würmer nur innerhalb von 48 h verwendet werden. Wenn das Fixativ Methanol ist, sollten die Würmer innerhalb von 24h verwendet werden.

2. Vorbereiten von Agarose-Pads zum Montieren der Würmer

HINWEIS: Der entscheidende Schritt bei der Vorbereitung eines Agarose-Pads ist es, ein Pad mit regelmäßiger Dicke zu erhalten. Andernfalls werden Würmer auf dem Pad in verschiedenen Fokusebenen sein, was es schwierig macht, ein fokussiertes Bild eines breiteren Sichtfeldes zu erhalten.

1. Bereiten Sie 2% Agarose-Pads vor, indem Sie 0,2 g Agarose zu 10 ml sterilisiertem_H2O in einem Becher oder einem konischen Kolben hinzufügen. Erhitzen Sie in der Mikrowelle 30 s, bis die Agarose zu kochen beginnt.
   HINWEIS: Nicht überhitzen und stoppen, sobald Blasen auftreten; Andernfalls erhöht es die Viskosität der Agarose, was es schwieriger macht, die gewünschte Paddicke zu erreichen.
2. Sobald die Agarose geschmolzen ist, geben Sie einen Tropfen geschmolzener Agarose in der Mitte eines Mikroskopglasschlittens mit einer 1000 L Pipettenspitze mit ihrem Endschnitt aus. Halten Sie sofort, aber zart, eine weitere Glasrutsche ganz in der Nähe des Agarosetropfens und lassen Sie sie auf die Agarose los, um ein Pad mit regelmäßiger Dicke für beste Mikroskopieergebnisse zu bilden.
   HINWEIS: Das Lösen der oberen Folie aus einer Höhe bildet nicht nur Blasen, sondern führt zu einem unebenen Pad. Alternativ ist es auch möglich, zwei Glasschlitten zu verwenden, die das Dia mit dem Pad flankieren, mit einer dünnen Klebeschicht auf jeder Folie.
3. Entfernen Sie nach mindestens 2 bis 3 min die obere Folie vorsichtig. Trimmen Sie das Pad mit der Seite der oberen Folie, um es quadratisch geformt zu machen. Montieren Sie die Würmer innerhalb von 5 min, um zu verhindern, dass das Pad vor Gebrauch trocknet.

3. Montage fester Würmer für die Bildgebung

1. Erstellen Sie eine Mundmikropipette, indem Sie eine dünne Glaskapillare in der Flamme eines Bunsenbrenners ausdehnen (Abbildung 1A). Nach Verlängerung in der Flamme, brechen Sie die Kapillare in zwei Stücke (Abbildung 1B). Wählen Sie die am besten geeignete, in der Regel die längste, und testen Sie, ob das Ende der Kapillare offen ist, indem Sie versuchen, Wasser zu saugen.
   HINWEIS: Wenn die Flüssigkeit nicht in die Kapillare gelangt, ist sie zu dünn oder blockiert. Schneiden Sie das Ende der Kapillare vorsichtig mit einer Schere, um zu vermeiden, zu viel zu schneiden, da Würmer angesaugt werden, wenn das Loch zu groß ist.
2. Stecken Sie die Glaskapillare aus Schritt 3.1 in den Kapillaradapter(Abbildung 1C), der mit dem 6 mm Silikonrohr verbunden ist, und stecken Sie das andere Ende des 6 mm Silikonrohrs in einen 0,2-mm-Filter, der an einem 3-mm-Silikonrohr am anderen Ende befestigt ist(Abbildung 1C). Stecken Sie eine 1 ml Filterspitze (Abbildung 1C) in das freie Ende des 3 mm Silikonrohrs, um Flüssigkeit zu saugen.
   ANMERKUNG: Zwischen dem Mund des Experimentators und der Kapillare wird der 0,2-mm-Filter hinzugefügt, um ein Höchstmaß an Sicherheit des Experimentators zu gewährleisten. Eine ähnliche Lösung wird für Mundmikropipetten verwendet, um Maus-Embryonen zu behandeln¹². Wechseln Sie den Filter (in der Regel alle paar Monate), wenn die Mundmikropipette keine Flüssigkeit mehr ansaugt.
3. Entfernen Sie mit der Mundmikropipette unter einem Seziermikroskop so viel Flüssigkeit wie möglich um das Wurmpellet fester Würmer (Abbildung 2).
   HINWEIS: Pipettierüberstand mit einer manuellen Mikropipette kann als Alternative zu den Mundpipetten in den Schritten 3.1 bis 3.3 verwendet werden, um so viel Überstand wie möglich zu entfernen. Fügen Sie 6 l des Montagemediums hinzu. Wir stellen jedoch fest, dass diese Methode nicht so effizient funktioniert, da übermäßige Flüssigkeit in den Pads eine spärliche Wurmdichte erzeugt, was die Bildgebung zeitaufwändiger macht. Setzen Sie Schritt 3.6 fort. Schauen Sie sich die Unterseite des Rohres an und stellen Sie sicher, dass die Pipette die Würmer nicht ansaugt.
4. Fügen Sie schnell 10 l Montagemedium (Materialtabelle) an der Unterseite des Rohres hinzu.
5. Spülen Sie eine 10-L-Spitze in PBS mit Spuren von Reinigungsmittel (0,01% Triton), um zu verhindern, dass Würmer an den Seiten der Kunststoffpipettenspitze kleben. Schneiden Sie das Ende der Spitze mit einer Schere.
6. Übertragen Sie 8 l des Montagemediums mit den Würmern auf das in Schritt 2.3 hergestellte Agarosepad. Schütteln Sie unter dem Mikroskop vorsichtig das Dia, um Überlappungen der Würmer zu vermeiden.
7. Bedecken Sie den Tropfen des Montagemediums auf dem Agarose-Pad mit einem 18 mm x 18 mm Abdeckzettel (Abbildung 3).
   HINWEIS: Kleinere Abdeckungen werden bevorzugt, da sie weniger Druck auf die Würmer ausüben. Halten Sie den Coverslip mit einer Pinzette und wenden Sie eine Kante des Coverslips gegen das Agarose-Pad an, bevor Sie den Coverslip vorsichtig mit der Pinzette ablagern.

4. Montage von Live-Würmern für die Bildgebung

HINWEIS: Um Live-Würmer abzubilden, müssen sie auf dem Pad immobilisiert werden. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen, ist, sie mit dem Nikotinrezeptor-Agonisten zu lähmen: Levamisol (Tabelle der Materialien).

1. In M9 gelöste Pipette 3 x 4 l l von 3 mM Levamisol auf das in Schritt 2.3 erstellte Agarose-Pad.
   HINWEIS: Es sollte genügend Flüssigkeitsvolumen vorhanden sein, dass die Würmer nicht übereinander, aber nicht zu viel Flüssigkeit sind, dass die Würmer zu spärlich auf dem Pad sind. Erfahrene Wurmpflücker können 3 L Levamisol verwenden. Weniger erfahrene Picker müssen möglicherweise ein größeres Volumen an Levamisol hinzufügen, damit das Levamisol nicht vollständig verdunstet.
2. Wählen Sie 30 bis 50 Würmer pro Bedingung in den Tropfen Levamisol.
3. Bedecken Sie den Tropfen Levamisol auf dem Agarose-Pad mit einem 18 mm x 18 mm Abdeckzettel. Bildwürmer innerhalb von 1 h, da der lähmende Agent schließlich zum Tod der Würmer führen wird.

5. Bildgebungsfolien mit Epifluoreszenzmikroskop

1. Mit einem Agarose-Pad von gleichmäßiger Dicke, bilden alle Würmer auf dem Dia auf einmal mit einem 6 x 6 oder 7 x 7 großen Bild zum Beispiel mit dem 20-fachen Objektiv eines Fluoreszenzmikroskops. Wenn die Dicke des Pads nicht gleichmäßig ist, erfassen Sie mehrere kleinere 3 x 3 oder 4 x 4 Bilder desselben Dias.
2. Verwenden Sie die gleichen Einstellungen für Fluoreszenzintensität und Belichtungszeit für alle Bedingungen. Passen Sie jede Einstellung an die Folie mit der hellsten Intensität an, um sicherzustellen, dass keine Pixelsättigung vorhanden ist. Spezifische Anweisungen zur Bildaufnahme finden Sie in den Anweisungen des Mikroskopherstellers.

6. Erstellen von Montagebildern von ausgerichteten Einzelwürmern mithilfe der Worm-align FIJI-Pipeline

1. Installieren Sie das Open-Source-Image-Analyse-Softwarepaket FIJI¹³/ImageJ¹⁴ von https://imagej.net/Fiji. Wenn eine vorherige Installation von FIJI verfügbar ist, stellen Sie sicher, dass sie auf Version 1.52a oder höher aktualisiert wird, da einige der im Makro verwendeten Funktionen (z. B. Tabellenfunktionen) dies erfordern. Laden Sie das Worm-Align-Makro von Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align herunter.
2. Öffnen Sie FIJI, und führen Sie das Worm-Align-Makro aus. Führen Sie Worm-align aus, indem Sie auf Plugins | Makros | Führen Sie in der FIJI-Hauptmenüleiste (Abbildung S1) aus. Suchen Sie nun das Worm-align.ijm-Skript auf dem Computer.
3. Das Makro initialisiert sich, indem es nach der Position der Bilder fragt. Die Pipeline funktioniert sowohl auf einkanaligen als auch auf mehrkanaligen Fluoreszenzbildern (Abbildung S2). Wählen Sie einen Eingabeordner aus, und das Makro generiert automatisch einen Ausgabeordner, in dem alle Ergebnisse gespeichert werden (Abbildung S3).
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass der ausgewählte Ordner nur Bilddateien enthält, da das Vorhandensein anderer Dateiformate zum Absturz des Makros führt. Im Idealfall gruppieren Sie nur Bilder, die mit den gleichen Mikroskopeinstellungen aufgenommen wurden. Worm-align akzeptiert viele verschiedene Dateiformate, einschließlich nd2, czi, tif, rgb, jpg und png. Der Name des Ausgabeordners ist derselbe wie der Eingabeordner, wobei '_output' als Postfix hinzugefügt wird, d. h. wenn der Eingabeordner 'Images' ist, wird die Ausgabe in 'images_output' gefunden. Der Ausgabeordner enthält vier Unterordner, in denen die Daten gespeichert werden.
4. Lassen Sie das Makro fortfahren, das erste Bild im Eingabeordner zu öffnen, und verwenden Sie es als repräsentatives Bild, um eine Einstellung zum Generieren der Montage zu extrahieren.
   HINWEIS: Worm-align wählt automatisch das erste Bild im Eingabeordner aus, um die Einstellungen zu generieren, die auf alle anderen Bilder im Ordner angewendet werden. Wenn ein anderes Bild als repräsentativer für das Dataset betrachtet wird, stellen Sie sicher, dass dieses Bild ausgewählt wird, indem Sie eine Kopie des Bildes im Eingabeordner speichern und den Namen so ändern, dass er jetzt oben in der Liste aufgeführt ist (z. B. '0_RepresentativeImage').
5. Zeichnen Sie mit dem Werkzeug Geradelinie eine Linie über die Breite eines Wurms (Abbildung S4), und verwenden Sie die Länge dieser Linie, um die Höhe der zugeschnittenen Bereiche für einzelne Würmer zu bestimmen. Geben Sie für jeden Kanal den Namen, die Suchtabelle (LUT), die Intensitätseinstellungen (B&C) und die Angabe an, ob sie in die Montage einbezogen werden sollen (Abbildung S4).
   HINWEIS: Diese Parameter werden aufgezeichnet und in einer Einstellungsdatei, Einstellungen.csvgespeichert, die sich im CellProfiler-Unterordner des Ausgabeordners befindet.
6. Sobald alle Einstellungen erfasst wurden, wird dem Benutzer angezeigt, wie die Bilder nach der Anwendung der angewendeten Einstellungen aussehen werden (Abbildung S5). Aktivieren Sie das obere Kästchen, wenn die Einstellungen ausreichend sind. Optionen für die Montagegenerierung auswählen (Ticks entfernen, falls nicht erforderlich): 1. Generieren Sie eine Montage ausgewählter Würmer für jedes einzelne Bild oder 2. Generieren Sie eine kombinierte Montage, in der alle Würmer, die auf allen Bildern im Eingabeordner ausgewählt wurden, zu einer einzigen Montage kombiniert werden. Klicken Sie auf OK, um den Rest des Makros auszuführen.
   HINWEIS: Wenn das obere Feld nicht angekreuzt ist, bevor Sie auf "OK" klicken, führt das Makro das Setup erneut aus, sodass die Bildeinstellungen optimiert werden können.
7. Die Worm-Align-Pipeline öffnet nun alle Bilder im Eingabeordner. Zeichnen Sie für jedes Bild Linien auf der Längsachse aller Würmer, die in die Montage einbezogen werden sollen und/oder quantifizieren (Abbildung 4 und Abbildung S6), mit dem Werkzeug "Segmentlinie" (in der FIJI-Hauptmenüleiste). Um eine ordnungsgemäße Ausrichtung des Wurms zu gewährleisten, zeichnen Sie Linien konsistent vom Kopf bis zum Schwanzende (oder umgekehrt) und entlang der gesamten Länge des Wurms (siehe Beispiele für "gute" und "schlechte" Linienzeichnung in Abbildung 4B).
8. Fügen Sie jede Zeile zum ROI-Managerhinzu, indem Sie auf Strg+T klicken. Worm-align verwendet die dem ROI-Manager hinzugefügten Linien in Kombination mit dem Parameter Wurmbreite (in Schritt 6.4 festgelegt), um zugeschnittene Bilder einzelner ausgewählter Würmer zu generieren. Die Auflistung der Zeilen-ROIs wird im Unterordner "Daten" gespeichert. Dieser Ordner enthält auch eine Kopie des Originalbildes, das die Zeilen sowie die Nummer des Wurms anzeigt. Zeilen werden mit der Glasbey_on_dark-Suchtabelle farbcodiert. Die Bilder von begradigten Würmern werden im single_worms Unterordner des Ausgabeordners gespeichert. Wenn in Schritt 6.6 dieses Protokolls ausgewählt, erzeugt Worm-align außerdem Montagen aller Würmer, die pro Übersichtsbild und/oder für alle Übersichtsbilder im Eingabeordner ausgewählt wurden (siehe Abbildung 4C und Abbildung S7). Diese Montagen finden Sie im "ausgerichteten" Unterordner des Ausgabeordners.

7. Analyse der Fluoreszenzintensität mit einem Einzigen-Wurm mithilfe der Ausgabe von Worm-align in einer automatisierten CellProfiler-Pipeline

1. Für die nachgeschaltete Datenverarbeitung und Analyse der Worm-Align-Ausgabe können Sie das Open-Source-Bildanalyse-Softwarepaket 'CellProfiler^15,16 von https://cellprofiler.org/ herunterladen und installieren. Laden Sie die Worm_CP.cpproj-Pipeline von GitHub herunter: https://github.com/hannekeo/Worm-align
   HINWEIS: Die hier beschriebene Beispielpipeline wurde mit CellProfiler2.2.0 erstellt und wird möglicherweise nicht in späteren Versionen von CellProfiler ausgeführt.
2. Stellen Sie vor dem Starten der Worms_CP.cpproj-Pipeline sicher, dass alle erwarteten Ausgabebilder im CellProfiler-Unterordner des Wurm-Align-Ausgabeordners vorhanden sind: eine verarbeitete Kopie des Originalbildes (benannt: Original_), eine binäre Bildmaske der Wurmpopulation (benannt: Mask_), eine Linienmaske der Linien, die auf ausgewählten Würmern gezeichnet wurden (benannt nach Lines_), und ein Bild, das jeden der im Originalbild vorhandenen Kanäle darstellt (benannt nach Kanalnummer).
3. Um die Fluoreszenzintensität in einzelnen Würmern zu quantifizieren, klicken Sie auf das Eingabemodul Bilder und ziehen Sie einfach den CellProfiler-Ausgabeordner in das Fenster, das Hier Drop-Dateien und -Ordnerangibt. Wenn eine Liste von Bildern aus der vorherigen Analyse vorhanden ist, entfernen Sie diese zuerst, indem Sie mit der rechten Maustaste in das Fenster klicken und Dateiliste löschenauswählen. Um die Datei "Einstellungen.csv" aus der Bilderliste auszuschließen, wählen Sie entweder "Nur Bilder" oder "Custom" mit "Extension is tif, tiff, ome.tif oder ome.tiff" für die Filtereinstellungen (Abbildung S8).
4. Klicken Sie auf das Metadaten-Eingabemodul. Klicken Sie in der zweiten Extraktionsmethode auf den gelben Ordner, und suchen Sie den CellProfiler-Unterordner im WormAlign-Ausgabeordner (Abbildung S9). Wählen Sie die Datei Einstellungen.csv aus und verknüpfen Sie die Einstellungen in der Datei mit der CellProfiler-Ausgabe, indem Sie die Metadaten in den CSV-Dateien mit denen in den Bildern (Kanalmetadaten) abgleichen.
5. Klicken Sie auf das NamesAndTypes-Eingabemodul, und fügen Sie ein neues Bild für jeden Kanal des zu quantifizierenden Originalbildes ein.
   HINWEIS: Bereits in der Beispielpipeline sind die Wurmmaske, zwei Farbbilder, die Linienmaske und das Originalbild sowie drei Graustufenbilder (der grüne und der rote Kanal) vorhanden. Die Liste in diesem Modul muss angepasst werden, wenn die Originalbilder mehr oder weniger Kanäle als die Beispielbilder haben.
6. Überprüfen Sie, ob der Name der Bilder in jeder Spalte Beschriftung/Maske/Würmer korrekt ist.
   HINWEIS: Die Namen der Bilder in einer Zeile sollten alle dem gleichen Anfangsbild entsprechen, das analysiert werden soll. Wenn während des Bildanalysevorgangs ein Fehler gemacht wird, fehlen einige der Ausgabebilder und die Namen unter den drei Spalten Label/Maske/Würmer entsprechen nicht mehr dem gleichen Anfangsbild für jede Zeile. Wenn dies der Fall ist, finden Sie heraus, wo der Fehler ist.
7. Drücken Sie die Ausgabeeinstellung Ansicht, um den Ordner auszuwählen, in dem die Ausgabe von Cellprofiler gespeichert werden soll.
8. Klicken Sie auf Testmodus starten. Überprüfen Sie die Einstellungen der Pipeline, indem Sie sie auf das erste Bild im Dataset anwenden, indem Sie auf Ausführen klicken (der alle aktiven Module in der Pipeline durchläuft) oder Step (der jeweils ein Modul durch die Pipeline führt).
   HINWEIS: Im Testmodus werden die extrahierten Messungen nicht exportiert, auch wenn ein ExportToSpreadsheet-Modul in der Pipeline vorhanden (und aktiv) ist.
9. Sobald die Pipeline so ausgeführt wird, wie sie sollte, klicken Sie auf Testmodus beenden, und drücken Sie dann Bilder analysieren. Wie derzeit konfiguriert, wird die Worms_CP (1) das Mask_ Bild verwenden, um eine grobe Wurmmaske und das Lines_ Bild (Abbildung S10A) zu segmentieren, um die ausgewählten Würmer herauszuarbeiten und einzelne Wurmmasken zu erzeugen (Abbildung S10C), (2) die Fluoreszenzintensität aller Kanäle messen, die in den Eingabebildern in den identifizierten und maskierten Würmern vorhanden sind. Die Pipeline kann auch die Hintergrundintensität messen (Abbildung S10B) und alle Bilder entsprechend korrigieren (angezeigt durch den Wortschwellenwert im Namen des gemessenen Parameters. z.B.: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) die Größe der ausgewählten Würmer messen und (4) alle gemessenen Parameter exportieren (Abbildung S10D).
10. Öffnen Sie die Worm_CP Ausgabe, die aus zwei csv-Dateien, Würmern.csv und Zeilen besteht.csv die im ausgewählten Ausgabeordner gespeichert sind (siehe Abbildung S11). Diese Dateien können in Excel oder R (Studio) für die Nachbearbeitung und Berichterstellung geöffnet werden. Wenn eine zusätzliche Ausgabe erforderlich ist, z.B. pro Bilddaten, kann diese im ExportToSpreadsheet-Modul in der Pipeline ausgewählt werden.

Ergebnisse

Die Kultivierung und Abbildung von C. elegans nach der in diesem Protokoll beschriebenen Methode erzeugt große Übersichtsbilder von Wurmpopulationen. Um die visuelle Inspektion und Klassifizierung von Würmern aus diesen Bildern zu erleichtern, haben wir Worm-align entwickelt. Worm-align ist ein einfaches und benutzerfreundliches FIJI-Skript, das verwendet werden kann, um Montagen von begradigten und ausgerichteten Würmern zu erstellen. Würmer werden aus Übersichtsbildern ausgewählt, indem eine Linie entlang der Längsachse der Würmer gezeichnet wird. Jedem ausgewählten Wurm wird eine Zahl zugewiesen, beschnitten und begradigt und einer Montage hinzugefügt. Montagen können pro Bild generiert werden oder alle Bilder aus dem ursprünglichen Eingabeordner kombinieren.

Wie erwartet hängt die Ausgabe der Pipeline weitgehend von der Qualität der Linien ab, die über den Bildern gezeichnet werden. Zur Veranschaulichung dieses Punktes zeigt Abbildung 4 mehrere Linienbeispiele und deren Ausgabe aus Worm-align. Eine komplette Linie vom Kopf bis zur Schwanzspitze erzeugt einen richtig ausgerichteten Wurm (mit der Aufschrift "gut"). Abbildung 4 zeigt auch, wie sich Ungenauigkeiten bei der Ablaufverfolgung von Worm-Align auf die Ausgabe der Ausrichtung auswirken. Aus der in Abbildung 4Centhaltenen anmerkungsierten Montage ist darauf zu achten, dass die folgenden Fehler vermieden werden, da sie die richtige Ausrichtung von Würmern behindern:

• Inkonsistente Rückverfolgung des Wurms von Kopf zu Schwanz (mit der Aufschrift "Schwanz bis Kopf"). Dies führt dazu, dass Würmer in verschiedene Richtungen (d.h. Schwanz-zu-Kopf versus Kopf-zu-Schwanz) in der Ausrichtung ausgerichtet werden.
• Unvollständige Ablaufverfolgung (mit der Bezeichnung "unvollständig"). Dies führt nur dazu, dass nur der Teil des Wurms, der für die Montage abgeschnitten wurde, abgeschnitten wurde.
• Einschließlich mehrerer Würmer in einer einzigen Spur (mit der Bezeichnung "Wurm mit zwei Köpfen"). Dies führt dazu, dass Würmer und (bedeutende Abschnitte) ihrer Nachbarn in das gleiche Panel der Montage eingefügt werden.
• Hinzufügen zufälliger Linien zum Bild (mit der Bezeichnung "zufällig"). Dies führt zum Einfügen von zufälligen Panels in die Montage.

Für die Erstellung der Montage ist es kein Problem, wenn sich zwei einzelne Zeilen schneiden (mit der Bezeichnung "schneidend") oder an beiden Enden des Wurms verbunden sind (mit der Bezeichnung "verbunden"), solange jede Zeile die gesamte Länge eines einzelnen Wurms nachverfolgt: Das Worm-Align-Skript wählt jede Zeile ROIs einzeln und sequenziell aus, schneidet und richtet sie, so dass jedes Panel in der endgültigen Montage eine einzelne Zeilenablaufverfolgung darstellt. Bei den sich schneidenden Würmern, obwohl in der Montage für Wurm "intersecting1" und "intersecting2" in voller Länge aufgefallen sind, fällt deutlich auf, dass sich diese Würmer im ursprünglichen Übersichtsbild kreuzen. Daher kann der Schluss gezogen werden, dass die visuelle Identifizierung von sich schneidenden Linien aus dem Overlay-Bild im Unterordner "Daten" (Abbildung 5A) sowie aus den Panels einzelner Würmer in der Montage möglich ist (Abbildung 5B). Darüber hinaus können alle Überlappungen von Würmern/Linien aus der Qc-Tabelle (Quality Control) identifiziert werden, die für jedes verarbeitete Bild von Worm-align generiert und im Datenunterordner gespeichert wird. Diese Tabelle zeichnet drei Parameter für jeden der im Bild gezeichneten Linien-ROIs auf (siehe Abbildung 5C):Davon gibt Länge die Länge des Linien-ROI an, was ein guter Indikator für die Größe des Wurms ist; und die Wurmnummer gibt die Reihenfolge an, in der die Zeilen auf dem Übersichtsbild gezeichnet wurden. Schließlich gibt die letzte Spalte an, ob es eine Überlappung zwischen dem betreffenden Wurm/der betreffenden Zeile und einem der anderen im Bild ausgewählten Würmer/Linien gibt. Im Falle einer Überlappung unterscheidet sich die Zahl in dieser Spalte von der in der Spalte Wurmnummer aufgeführten. In Kombination mit dem Überlagerungsbild sollte die QC-Tabelle dem Forscher helfen, erlernte Entscheidungen darüber zu treffen, welche Würmer von der Montage und/oder Quantifizierung ausgeschlossen werden sollten.

Die Ausgabe von Worm-align kann für die nachfolgende Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Würmern verwendet werden. In FIJI können die Line-ROIs verwendet werden, um die Fluoreszenzintensität in den ursprünglichen Bilddaten zu messen, z. B. durch Ausführen des einfachen FIJI-Skripts ' Worm-quant.ijm', das auch im Worm-Align-Repository auf Github zu finden ist. Alternativ kann die Worm-Align-Ausgabe in Bildanalysesoftware von Drittanbietern importiert werden. Wir demonstrieren dies, indem wir die Worm-Align-Ausgabe von zwei Datasets in Worm_CP importieren, eine Pipeline, die wir in CellProfiler generiert haben. Worm_CP verwendet die Dateien im Unterordner "CellProfiler" des Wurm-Ausrichtung-Ausgabeordners, um Segmentierungsmasken der einzelnen Würmer, die während der Ausführung des Wurm-Align-Makros ausgewählt wurden, zu optimieren. Insbesondere verwendet es die Linienmaske (benannt: Lines_), um ausgewählte Würmer von der Wurmpopulation zu isolieren, die in der Binärmaske (benannt: Mask_) zu sehen ist. Es sei darauf hingewiesen, dass Linien, die sich auf dem Übersichtsbild schneiden (Abbildung 5A), obwohl kein Problem für die Erzeugung von Montagen, sind problematisch für die Worm_CP Pipeline. Warum dies der Fall ist, wird in Abbildung 5 D-Everanschaulicht. Worm_CP verwendet die Linienmaske (Abbildung 5D) und nicht einzelne ROIs, um die Identifizierung einzelner Würmer zu unterstützen. Die sich schneidende Linie, die während der Ausführung von Worm-align an zweiter Stelle gezogen wird, wird auf der ersten Linie überlagert, und daher wird die Intensität entlang dieser Linie die des ROI2 sein, einschließlich in dem Bit, in dem sich Linie 1 und 2 überlappen. Daher segmentiert CellProfiler Zeile2 als ein Objekt, aber zeile1 als zwei Objekte, die an der Stelle getrennt sind, an der sie sich mit Zeile2 schneidet. Dies bedeutet, dass CellProfiler zwei (halbe) Wurmmasken für Wurm 'intersecting1' erzeugt (Abbildung 5E). Die einfachste Möglichkeit, diese Ereignisse aus der Endanalyse auszuschließen (falls erforderlich), besteht darin, die Wurmanzahl der sich schneidenden Würmer aus der QC-Tabelle (Datenunterordner) zu identifizieren und Messungen für diese Würmer aus den CellProfiler-Ausgabedateien zu entfernen. Bitte beachten Sie, dass Würmern in FIJI und CellProfiler nicht unbedingt die gleiche Nummer zugewiesen werden: Um die FIJI-Wurmnummer in der CellProfiler-Ausgabe zu identifizieren, schauen Sie sich die Intensity_Max_Intensity Werte in der Ausgabedatei "Lines.csv" an. Jeder Intensity_Max_Intensity Wert, der mehr als einmal pro Bild in der Tabelle "Linien.csv" angezeigt wird, ist ein Hinweis auf diesen Roi der Linie, der zu einer gebrochenen Wurmmaske führt.

Sobald einzelne Wurmmasken segmentiert sind, können Worm_CP die Fluoreszenzintensität in den ausgewählten Würmern für alle aufgezeichneten Kanäle messen. Alle Messungen stammen aus den ursprünglichen (Roh-)Bilddaten, wobei zu beachten ist, dass CellProfiler die Pixelintensität automatisch auf einer Skala von 0-1 skaliert. Dies wird erreicht, indem der Rohpixelintensitätswert durch die maximal mögliche Pixelintensität für das Bild dividiert wird. Bei 8-Bit-Bildern ist dieser Wert 255, bei 16-Bit-Bildern 65535. CellProfiler-Intensitätswerte müssen daher mit dem maximal möglichen Intensitätswert multipliziert werden, um Werte wiederzuerlangen, die den Rohbilddaten entsprechen. Die Worm_CP Ausgabe besteht aus zwei csv-Dateien, 'worms.csv' und 'Lines.csv', die im ausgewählten Ausgabeordner gespeichert werden. Bei der Überprüfung dieser Dateien ist klar, dass CellProfiler eine große Anzahl von Parametern im Zusammenhang mit der Fluoreszenzintensität aufzeichnet. Davon entspricht die Intensity_IntegratedIntensity der Gesamtfluoreszenz pro Wurm (d. h. der Summe der Fluoreszenzintensität in allen Pixeln, die die Maske eines einzelnen Wurms auslegt). Der Parameter Intensity_MeanIntensity bezieht sich auf die durchschnittliche Fluoreszenzintensität innerhalb eines einzelnen Wurms (d. h. die durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Pixel für alle Pixel, die in einem einzelnen Wurm enthalten sind). Aufgrund des gelegentlichen Auftretens von (kleinen) Fehlern bei der Segmentierung der Schneckenmasken wird empfohlen, beim Vergleich von Fluoreszenzmessungen einzelner Würmer zwischen zwei Bedingungen MeanIntensity-Messungen zu verwenden. Wenn Sie die Hintergrundfluoreszenz von quantifizierten Messumsuren subtrahieren möchten, verwenden Sie die measurments, die MeanIntensity_Threshold genannt werden.

Wir haben die Worm_CP-Pipeline verwendet, um die Fluoreszenzintensität von festen Tieren zu quantifizieren, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekennzeichnet wurden, der in Lipidtröpfchen (LDs) einbaut (Abbildung 6). Um die Fluoreszenzquantifizierung aus der Worm-Align/Worm_CP-Pipeline zu validieren, quantifizierten wir die Fluoreszenzintensität in demselben Satz von Würmern aus dem BODIPY-Dataset entweder durch die Wurm-Align/Worm_CP-Pipeline oder die manuelle Quantifizierung in FIJI/ImageJ. Die manuelle Quantifizierung erfolgte in FIJI/ImageJ, indem jeder Wurm sowie eine dunkle Hintergrundzone in jedem Bild umkreist wurden. Die Fluoreszenzintensität wurde im ROI-Manager gemessen und der für den Bildhintergrund gemessene Wert von der Wurmfluoreszenzmessung jedes Wurms subtrahiert, wie^{beschrieben 17}. Wir verglichen Wildtyp (WT) N2 Würmer mit dbl-1(nk3) Mutanten, die einen verringerten Lipidtröpfchengehalt¹⁸aufweisen. Wie erwartet ist die grüne Fluoreszenzintensität zwischen WT- und dbl-1(nk3)-Würmern mit beiden Methoden signifikant verringert (Abbildung 6A,B). Beispiele für ausgerichtete Würmer sind in Abbildung 6C,Dzu finden. Der Lipidtröpfchengehalt wird durch manuelle Quantifizierung um 17% (p-Wert<0.0001, unpaired t-test) zwischen WT und dbl-1(nk3) und um 14% (p-wert=0.0051 unpaired t-test) mit der Worm_CP Pipeline verringert. Die hier in dbl-1(nk3) beobachtete Abnahme des Lipidtröpfchengehalts bei beiden Quantifizierungsmethoden entspricht der Literatur¹⁸. Dies zeigt, dass die Quantifizierung der erfassten Fluoreszenzbilder mit der Worm_CP CellProfiler-Pipeline mit der manuellen Quantifizierung vergleichbar ist.

Wir haben auch Worm_CP verwendet, um die Hitzeschockreaktion bei lebenden Würmern zu quantifizieren, die GFP unter Kontrolle des Hitzeschock-induzierbaren Gens hsp-70(C12C8.1)⁹ausdrücken. Abbildung 7 zeigt repräsentative Bilder von lebenden C. Eleganen, die den hitzeempfindlichen hsp-70(C12C8.1)p::GFP-Reporter tragen. In Ermangelung von Hitzespannung induzieren die Würmer keine GFP-Expression (Abbildung 7A,B). Wenn Würmer jedoch einem kurzen Hitzeschock von 30 min bei 34 °C ausgesetzt sind, induzieren sie GFP-Expression (Abbildung 7C,D). GfP-Expressionsniveaus mit und ohne Hitzeschock sind in Abbildung 7Equantifiziert.

So wie es aussieht, ist Worm_CP eine sehr grundlegende Pipeline. Dieser Ansatz ermöglicht jedoch eine genauere Segmentierung einzelner Wurmmasken, was eine genauere Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in den würmern ermöglicht, die aus dem Bild ausgewählt wurden. Aus diesem Grund bevorzugen wir diesen Ansatz gegenüber einer groben Quantifizierung in FIJI, indem wir nur die Linienmasken verwenden. Darüber hinaus bietet CellProfiler den Vorteil, dass zusätzliche Analysemodule problemlos in die Pipeline eingebunden werden können. Für das Dataset, das sich mit dem Fetttröpfchengehalt befasst, könnte das Einfügen zusätzlicher Module in die Worm_CP-Pipeline beispielsweise lipidtröpfchenzahlen und die Fluoreszenzintensität einzelner Tröpfchen in den in den Übersichtsbildern ausgewählten Würmern untersuchen.

Abbildung 1: Generieren einer Mundmikropipette. Eine Glaskapillare wird in der Flamme eines Bunsenbrenners (A) verlängert, bis sie dünne, längliche Extremitäten liefert (B). Die verlängerte Glaskapillare wird dann in das Adapterstück der Mundmikropipette eingesteckt. (C) Schemat einer Mundmikropipette. Die Mundmikropipette wurde mit einer Glaskapillare in einen Adapter gesteckt montiert. Ein 6-mm-Silikonrohr verbindet den Adapter mit einem 0,2-mm-Spritzenfilter, der zur Sicherheit verwendet wird. Das andere Ende des Filters ist an einem 3 mm Silikonrohr befestigt, das mit einer 1ml Filterspitze endet. Der Experimentator kann über die Filterspitze aspirieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Aspiration der Flüssigkeit, die das Wurmpellet umgibt, mit der Mundmikropipette. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Hinzufügen des Deckelzettels auf die Würmer, die auf dem Agarose-Pad liegen, klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beispiele für die Begradigung des Wurms mit Wurmausrichtung auf Fluoreszenzbildern, die von lebenden Tieren mit dem Transkriptionsreporter Fett-7paufgenommen wurden: :GFP im Darm und ein roter Co-Injektionsmarker im Rachen (myo-2p::tdtomato). (A) Screenshot eines zusammengesetzten Bildes, das am Fluoreszenzmikroskop von lebenden Würmern am 3. Tag des Erwachsenenalters aufgenommen wurde. Das Bild wurde mit Worm_align geöffnet und Linien entlang der Längsachse der Würmer mit Worm-Align gezeichnet. (B) Screenshot des gleichen Bildes wie in (A), mit Beispielen, die von einer guten und schlechten Zeichnung der Linien entlang der Achse der Würmer mit Worm-Align kommentiert wurden. (C) Beispiele für Linien, die auf Würmern gezeichnet werden und zu falsch ausgerichteten Würmern ansteigen können. Die Wurm-Ausrichtung-Ausgabe der in B ausgewählten Würmer wurde aufgenommen. Bilder wurden mit einem 20-fachen Objektiv auf einem invertierten Weitfeldmikroskop (siehe Materialtabelle) mit grüner Fluoreszenzintensität=1, Exposition=60 ms und roter Fluoreszenzintensität = 8, Exposition = 60 ms aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Beispiele für die Begradigung des Wurms mit Wurmausrichtung bei sich schneidenden Würmern. (A) Screenshot eines zusammengesetzten Bildes, das am 3. Tag von Tieren im Erwachsenenalter, die den Transkriptionsreporter Fat-7ptragen, auf dem fluoreszierenden Mikroskop von lebenden Würmern aufgenommen wurde: :GFP im Darm und ein roter Co-Injektionsmarker im Rachen (myo-2p::tdtomato). Schneidende Würmer werden als "intersecting1" und "intersecting2" gekennzeichnet, während nicht überlappende Würmer als "good3" und "good4" gekennzeichnet sind. (B) Montage, die von Worm-align erstellt wurde und begradigte Würmer darstellt, die in (A )ausgewählt wurden. In der Montage fällt auf, dass sich die Würmer 1 und 2 auf dem Originalbild kreuzten (Würmer, die als "schneidend1" und "intersecting2" bezeichnet werden). (C) Screenshot der QC-Tabelle von Worm-align, mit dem Fälle entdeckt werden können, in denen sich Würmer schneiden. Länge: Länge der ROI-Linie; Wurmnummer: Reihenfolge, in der die Linien gezeichnet wurden; Die letzte Spalte gibt an, ob es eine Überlappung zwischen dem Wurm/der Interessenlinie und einem anderen Wurm gibt. In diesem Beispiel überlappt sich der Wurm im ersten Rohformat (Wurmnummer1) mit Wurmnummer 2, wie durch die Zahl "2" in der letzten Spalte angegeben. (D) Screenshot der mit Worm-align gezeichneten Linien auf den vier Würmern, die in A. (E) ausgewählt wurden, Screenshot der Masken, die von Worm-align auf den vier in A ausgewählten Würmern generiert werden, zeigt, wie die Masken für die beiden sich schneidenden Würmer gerendert werden. In diesem Fall entsprechen nun zwei Masken statt einer dem Wurm "intersecting1". Die Bilder wurden mit einem 20-fachen Objektiv auf einem invertierten Weitfeldmikroskop (siehe Materialtabelle) mit grüner Fluoreszenzintensität=1, Exposition=60ms und roter Fluoreszenzintensität = 8, Belichtung = 60 ms aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Die Worm_CP-Pipeline quantifiziert die Fluoreszenz so genau wie die manuelle Quantifizierung. Vergleich der Fluoreszenzquantifizierung junger erwachsener Würmer, die für den Fetttröpfchengehalt fixiert und gebeizt wurden, mit dem grünen Fluoreszenzfarbstoff BODIPY, entweder mit Worm_CP Pipeline (A) oder manueller Quantifizierung (B). Der Lipidtröpfchengehalt von WT und dbl-1 (nk3) wurde durch Fixierung und Färbung von Tieren mit BODIPY überwacht, die zu Fettsäuren von Lipidtröpfchen intercaliert (siehe Protokoll A). Junge erwachsene Tiere wurden mit 60% Isopropanol fixiert und mit BODIPY für 1h gebeizt. Derselbe Satz von Tieren wurde entweder anhand der Worm_CP-Pipeline (siehe Schritt 7) oder durch manuelle Quantifizierung nach Standardverfahren¹⁷quantifiziert. (A) Quantifizierung der Fluoreszenz unter Verwendung Worm_CP Pipeline. WT: n=22 Tiere, durchschnittliche Fluoreszenz= 1,016 (A.U) ± 0,206 SD; dbl-1(nk3): n=25 Tiere, durchschnittliche Fluoreszenz= 0,8714 (A.U) ± 0,126 SD. Ungepaarter t-Test. (B) Manuelle Quantifizierung der Fluoreszenz. WT: n=22 Tiere, durchschnittliche Fluoreszenz = 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3): n=25 Tiere, durchschnittliche Fluoreszenz = 0,8632 ± 0,109 SD. Ungepaarter t-Test. (C, D) Repräsentatives Beispiel oder Worm-Align-Ausgang für WT (C) und dbl-1(nk3) (D) Tiere, die mit der Worm-Align-Pipeline begradigt wurden. Die Bilder wurden mit einem 20-fachen Objektiv auf einem invertierten Weitfeldmikroskop (siehe Materialtabelle) mit grüner Fluoreszenzintensität=2, Exposition=60ms aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Beispiel für die Fluoreszenzquantifizierung und Ausrichtung von lebenden Würmern aus Fluoreszenzbildern von lebenden Würmern, die den Transkriptionsreporter hsp-70(C12C8.1)p::GFP nach Hitzeschock tragen. (A) Bei einem kurzen Hitzeschock (30 min bei 34 °C) wurden junge erwachsene Würmer bei ihrer Kultivierungstemperatur (25 °C) geborgen und dann 3,5h nach dem Hitzeschock abgebildet. Etwa 30 Würmer wurden nach einem Hitzeschock mit Hilfe der Wurm-Align-Pipeline quantifiziert. (A-B) Beispiele für ausgerichtete Würmer, die keinem Hitzeschock ausgesetzt waren. (C-D) Beispiele für hitzegeschockte Würmer, die hsp-70(C12C8.1)p::GFP mit Worm-align tragen. (E) zeigt die GFP-Durchschnittsintensität (Worm_CP Parameter: MeanIntensity_Threshold) der jungen Erwachsenenwürmer, die ohne Hitzeschock oder bei Einwirkung von Hitzeschock (34 °C für 30 min) angebaut wurden. Die Bilder wurden mit einem 20-fachen Objektiv auf einem invertierten Weitfeldmikroskop (siehe Materialtabelle) mit grüner Fluoreszenzintensität=1, Exposition=60ms aufgenommen; ohne HS: n=12, HS: n=32. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Position in FIJI, wo sich das Wurm-Ausrichtung-Makro nach der Installation befindet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Auswahl des Ordners mit allen Bildern, die mit den gleichen Einstellungen aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Generierung von 4 Unterordnern im Ausgabeordner in FIJI. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Zeichnen einer Linie über die Breite des Wurms und Kanaleinstellungen für die Montage. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Vorschau des Bildes mit den angewendeten Einstellungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Zeichnen einer Linie entlang der Längsachse der Würmer von Interesse für die Aufnahme in die Montage und/oder Quantifizierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Montage der ausgewählten Würmer im Ausgabeordner unter "ausgerichtet". Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: Löschen früherer Bilder aus früheren Analysen in Cell Profiler. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 9: Importieren von Metadaten in CellProfiler aus dem Wurm-Ausrichtung-Ausgabeordner, indem Sie den Unterordner Einstellungen.csv auswählen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 10: Die CellProfiler-Pipeline Worm_CP.cpproj verwendet die Lines_-Bilder, um die ausgewählten Würmer (A) zu einzeln zu halten, und erzeugt einzelne Wurmmasken der Würmer von Interesse (C). Die Pipeline misst auch die Hintergrundintensität (B). Outlook aller parameter, die von der Pipeline Worm_CP.ccproj gemessen werden, die in einer csv-Datei (D) exportiert werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 11: Auswahl von Ausgabedateien in der "ExportToSpreadsheet in der Worm_CP.cpproj-Pipeline. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Worm-align ist eine FIJI-basierte Bildverarbeitungspipeline, die leicht Montagen von vom Benutzer ausgewählten Würmern erzeugt, in denen Würmer begradigt und ausgerichtet werden, um visuelle Vergleich, Klassifizierung und Darstellung zu unterstützen. Obwohl diese Funktion auch von einigen vorhandenen Tools angeboten wird, insbesondere dem WormToolbox-Modul in CellProfiler⁷, erfordert Worm-align vergleichsweise wenig Erfahrung mit der vorherigen Bildanalyse: Benutzer müssen nur die Würmer verfolgen, die sie für die Montage (und Analyse) auswählen möchten. Obwohl die Verfolgung der Würmer auf den Rohbilddaten ein einfacher Prozess ist - insbesondere wenn ein Touchscreen-Computer oder Tablet verfügbar ist -, ist es von größter Bedeutung, dass Linien korrekt entlang der Längsachse der Würmer gezeichnet werden. Unvollständige Linien, die nur einem Teil des Wurms folgen, führen zu Teilwürmern in der Montage (d. h. Würmern fehlen den Köpfen der Schwanzenden) und teilsegmentierenden Masken während der CellProfiler-Analyse. Wenn sich auch Linien von zwei einzelnen Würmern kreuzen, werden die Würmer in der Schneckenausrichtungsmontage sowie bei der Fluoreszenzquantifizierung nicht korrekt verarbeitet. Zur Qualitätskontrolle wird ein Überlagerungsbild der Zeilenauswahl auf dem Originalbild im Datenordner zusammen mit einer QC-Tabelle gespeichert. Aus diesen können problematische Linien, die zu falsch segmentierten Würmern führen, leicht identifiziert und von der Montage und/oder nachfolgenden Analyse ausgeschlossen werden.

Obwohl die direkte Eingabe des Experimentators bei der Auswahl der Würmer vielleicht etwas zeitaufwändig erscheint, stellt sie einen klaren Vorteil des Workflows gegenüber anderen in Experimenten dar, bei denen Würmer aus verschiedenen Entwicklungsstadien im selben Bild vorhanden sind: Würmer können während des "Tracing Step" ausgewählt werden, indem nur die Würmer skizziert werden, die sich in der richtigen Entwicklungsphase befinden. Alternativ können Würmer mithilfe der Ausgabe von Worm_CP gefiltert werden, entweder basierend auf der Länge der Ablaufverfolgungslinie oder dem Bereich der Segmentierungsmaske, beides zuverlässige Indikatoren für die Länge/Größe der Würmer. Vermutlich können maschinelle Lernalgorithmen Schwierigkeiten haben, Würmer aus verschiedenen Entwicklungsstadien zu erkennen, da ihre Größe und ihr Aussehen in den DIC-Bildern so unterschiedlich sind.

Die Ausgabe von Worm-align kann für die nachfolgende Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Würmern verwendet werden, entweder in FIJI direkt oder in anderen Bildanalyse-Softwareplattformen. Wir haben dies demonstriert, indem wir die Wurm-Align-Ausgabe in eine einfache CellProfiler-Pipeline (Worm_CP importiert haben, die die Quantifizierung der Mehrkanalfluoreszenzintensität in den einzelnen Würmern ermöglicht, die beim Ausführen der Worm-Align-Pipeline ausgewählt wurden. Diesen Ansatz haben wir uns aufgrund der Flexibilität der CellProfiler Software gewählt: Es ist einfach, zusätzliche Module in die Pipeline zu integrieren, um zusätzliche Merkmale in einzelnen Würmern zu analysieren (z.B. Messung der Größe von Lipidtröpfchen oder Spannungsgranulat, Kernen, Mitochondrien). Darüber hinaus könnten die einzelnen Wurmmasken möglicherweise verwendet werden, um ein neues Modell für WormToolbox⁷zu trainieren.

Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie schnell ist und eine einfache Wurmmontage erfordert. Diese Methode ist schneller, da sie keine Zeit mit dem Erlernen von Softwareoder dem Ausführen von Trainingssätzen über einen Maschinenalgorithmus⁷erfordert. Darüber hinaus funktioniert diese Methode entweder mit lebenden oder festen Würmern, die einfach auf regulären Agarose-Pads montiert sind. Es besteht keine Notwendigkeit, komplexe mikrofluidische Kammern zu verwenden, wie in anderen Methoden^{entwickelt 5,6}.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	MeLford Biolaboratories Ltd	MB1200
Aspiratorröhrchen	Sigma-Aldrich	A5177	zur Herstellung einer Mikropipette für den Mund (siehe Protokollschritt)
Becherglas
BODIPY 493/593	Invitrogen	D3922	Stammlösung, hergestellt in DMSO bei 1 mg/ml
Zentrifuge	MISTRAL 1000
Konuskolben
Deckglas	VWR	631-0120
Filter 0,2 & Mikro; m für Spritze	Sartrius	16534-K	Filter, zur Herstellung einer Mikropipette für den Mund (siehe Protokollschritt)
Isopropanol
Levamisolhydrochlorid	Sigma-Aldrich	BP212	3mM Lösung, hergestellt durch Auflösen von Levamisol in M9
Flüssigstickstoff			Flüssigstickstoff Anlage
Low Retention Tip 1000µ L	Starlab	S1182-1830
Methanol	VWR Chemikalien	20847.307
Objektträger, MENZEL GLASSER	Thermo Scientific	BS7011/2
Mikroskop	Nikon		Eclipse Ti
Mikrowellenherd	Delongi
M9			im Labor hergestellt nach15
9 cm NGM-Platten			die im Labor nach 15
PBS			hergestellt wurden, im Labor hergestellt
Protein LoBind Tube 2 ml	Eppendorf	22431102
Triton	SIGMA	T9284-500ML
Ring Caps	SIGMA-ALDRICH	Z611247-250EA	Mikrokapillarröhrchen aus Glas zur Herstellung von Mund- Mikropipette (siehe Protokollschritt)
Rotator	Stuart Scientific
Silikonschlauch durchscheinend	Scientific Laboratory Lieferanten	TSR0600200P	6,0 mm x 2,0 mm Wandstärke - zur Herstellung einer Mikropipette im Mund (siehe Protokollschritt)
Sterilisiertes H2O			MilliQ Wasser, autoklaviert im Labor
10µ L Spitzen	Starlab	S1120-3810
200µ L Spitzen	Starlab	S1120-8810
1000µ L Tips	Starlab	S1122-1830
15mL Zentrifugenröhrchen	CORNING	430791
Vecta Shield	VECTOR	94010	Antifading-Eindeckmedium (H-1000) ohne DAPI