Summary
Aqui descrevemos um método para a geração de filhotes livres de germes a partir de ovos de uma linha de frango comercial, o Ross PM3. Este método pode ser adaptado para a geração de animais livres de germes de outras espécies de aves.
Abstract
Estudos da contribuição da microbiota intestinal para a fisiologia e imunocompetência do hospedeiro são facilitados pela disponibilidade de modelos animais livres de germes, que são considerados o padrão-ouro. Aves de ninho são modelos ideais para a produção de animais livres de germes, já que não há necessidade de criar seus parentes em condições estéreis. As galinhas livres de germes são geradas principalmente a partir de linhas experimentais específicas sem patógenos (SPF), que são pouco representativas das linhas comerciais de frango. O método aqui proposto permitiu a produção de frangos sem germes a partir da linha de frangos de corte de rápido crescimento Ross PM3, comumente utilizada pela indústria avícola. Os ovos foram rapidamente coletados depois de colocar em uma fazenda de criadores de frangos. Eles foram submetidos a um rigoroso processo de descontaminação desde a coleta até a introdução em um isolador de estéril de eclosão de ovos. Os filhotes foram eclodidos e mantidos nestes isoladores estéreis durante o período necessário para controlar sua esterilidade. Originalmente desenvolvido para uma linha experimental de leghorn branco SPF, o presente protocolo foi adaptado não apenas para a linha de frango ross PM3, mas também para codornas. Representa, portanto, um procedimento robusto e prontamente adaptável a outras espécies avícolas e aves de ninho de relevância econômica, biológica ou ecológica.
Introduction
Houve um aumento dramático do interesse científico e popular em relação à contribuição da microbiota intestinal para a saúde animal. A microbiota, composta por bactérias, vírus, fungos e arqueias que habitam diferentes nichos no intestino do animal, está implicada direta ou indiretamente na regulação de doenças inflamatórias, infecciosas e metabólicas que afetam não apenas espécies de mamíferos, mas também animais, como aves1. Vários modelos animais foram desenvolvidos para melhor estudar a contribuição da microbiota intestinal para a saúde e a doença. Por exemplo, animais sem germes e gnotobióticos permitem o estudo da ausência completa de micróbios ou de uma microbiota conhecida, respectivamente, sobre a fisiopatologia das infecções 2,3. No entanto, gerar e manter esses animais requer técnicas e instalações especializadas, e os custos, mão-de-obra e habilidades necessárias para mantê-los limitam seu acesso a muitos pesquisadores. De fato, animais livres de germes devem ser monitorados regularmente para possíveis contaminações usando uma combinação de métodos de cultivo de bactérias, microscopia, sorologia, morfologia bruta e técnicas de detecção baseadas em sequenciamento. Procedimentos semelhantes também se aplicam a outras espécies, como a pecuária, onde os animais são geralmente maiores e requerem instalações maiores para sua reprodução e manutenção, o que pode dificultar, em certa medida, pesquisas sobre a microbiota.
As aves de capoeira, mais especificamente as galinhas, são a pedra angular da produção pecuária em todo o mundo, com uma população de rebanhos que pode ultrapassar 40 bilhões de aves por ano. É a fonte mais importante de proteína animal no mundo (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Além disso, não há tabus culturais ou religiosos associados à criação ou consumo de galinhas. A microbiota intestinal de aves está importantemente envolvida no crescimento do animal, na razão de conversão de ração, imunidade, resistência ao patógeno, entre muitos outros processos nutricionais, fisiológicos ou patológicos4. A geração de frangos sem germes é, portanto, indispensável para ressaltar o diálogo entre a microbiota e seu hospedeiro4. Mesmo que as comunidades microbianas habitem o ovidutode frango 5, o conteúdo de um ovo recém-colocado por uma galinha saudável é, em sua maioria, livre de microrganismos, casca de ovo e membranas que possuem barreiras mecânicas para evitar a invasão de microrganismos4. Além disso, os filhotes são facilmente criados na ausência de seus parentes, o que, ao contrário dos mamíferos, permite a produção de animais livres de germes sem criação dos pais em condições estéreis.
A instalação experimental "Infectiologia da Fazenda, Modelo e Animais Silvestres" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, França, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) faz parte da Rede Nacional de Infraestrutura Francesa EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). A PFIE dominou a produção de frangos sem germes para realizar vários estudos experimentais por mais de 40 anos 7,8,9,10,11. Esses animais foram produzidos a partir de ovos específicos livres de patógenos (SPF) de uma linha de desarmamento de leghorn branca criada em reprodução fechada desde a década de 1970. Utilizadas principalmente para estudos microbiológicos 7,8,9, aves sem germes estão experimentando um ressurgimento do interesse com questões como a contribuição da microbiota intestinal para o comportamento13, utilização de nutrientes14, desenvolvimento imunológico15 e atividade endócrina. Mesmo que alguns estudos tenham sido publicados usando as linhas de frango sem germes16, esses estudos permanecem sub-representados em comparação com estudos usando linhas de camadas experimentais. A evolução das questões científicas para o crosstalk entre a microbiota e seu hospedeiro em saúde e bem-estar avícola nos levou a adaptar nosso protocolo histórico para produzir frangos sem germes da linha Ross PM3, a linha de frango de corte mais utilizada do mundo.
Protocol
Os procedimentos de cuidado animal foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias (86/609/CEE) e pelas regulamentações francesas sobre experimentação animal.
1. Preparação do isolador
- Insira os materiais necessários em um isolador rígido sob pressão positiva: tubos de 50 mL, pipetas plásticas de 5, 10 e 25 mL, ração irradiada, água autoclavada e recipientes plásticos selados estéreis.
- Encha a armadilha germicidal de transferência com uma solução de amônio quaternário de 2%.
- Esterilize o isolador três vezes com vapor de formaldeído usando 60 mL de formalina (24% de formaldeído) adicionado a 30 g de permangante de potássio por metro cúbico (m3). Mova os materiais dentro do isolador entre cada esterilização para garantir a esterilização de todas as superfícies de contato.
- Coloque a temperatura isoladara para 37 °C por pelo menos 2 dias antes de introduzir os ovos. Coloque o higrômetro em 65-70% de umidade relativa (RH) no dia da introdução.
2. Coleta e incubação de ovos
- Recolher os ovos das fazendas selecionadas com base em uma boa taxa de eclosão das galinhas poedeiras (pelo menos 80% no pico da produção de ovos) e seu bom estado sanitário (ou seja, ausência de patógenos de aves comuns e ausência de doenças dentro do rebanho). Selecione visualmente ovos limpos e impecáveis na esteira.
- Descontamine imediatamente a superfície do ovo mergulhando-as por 5 minutos em uma solução de ácido peracético de 1,5% à temperatura ambiente.
- Transporte os ovos para a instalação experimental usando uma caixa descontaminada com vapor formaldeído.
- Guarde os ovos por 24 horas a 4 °C. Repita o processo de descontaminação descrito na etapa 2.2 e coloque-os em uma incubadora de incubação (Dia 0) por 19 dias.
3. Incubação
- No dia 19, verifique a fertilidade, a viabilidade (motilidade) e o desenvolvimento do embrião, usando um candler de ovo leve em condições estéreis. Introduza apenas ovos embriados vivos nos isoladores estéreis de eclosão.
- Descontamine os ovos selecionados pulverizando 1,5% de solução de ácido peracético para 30 s ou até que toda a superfície de cada ovo esteja coberta. Os ovos permanecerão em contato com o spray por 16 minutos e 30 s durante a transferência para isoladores.
- Transfira os ovos para os isoladores estéreis de eclosão e enxágue-os com água desmineralizada estéril antes de colocá-los no espaço de eclosão.
NOTA: Os animais são eclodidos e criados em isoladores estéreis. Eles são alimentados com ad libitum com uma dieta comercial esterilizada pela irradiação gama e regada com água da torneira autoclavada fornecida por distribuidores de água.
4. Análise do estado bacteriológico
- Um dia após a eclosão, pegue uma amostra fecal diretamente do reto de diferentes filhotes e acumule-os em um tubo de vidro esterilizado, a fim de tornar esta amostra representativa de todos os animais dentro de um determinado isolador.
- As amostras fecais sendo mais ou menos líquidas, adicionam um equivalente de 1 mL de fezes a 9 mL de caldo de tioglicolato com resazurina. Adicione a amostra fecal restante a 9 mL de caldo de infusão do coração cerebral (BHI) e incubar os tubos a 37 °C sem tremer por 18 a 48 h. Isso permitirá o crescimento de uma ampla gama de espécies aeróbicas aeróbicas, facultativas e não versíbicas.
NOTA: O caldo de tiaglicolato com resazurina destina-se à detecção de bactérias anaeróbicas não versíduas, mas também permite a detecção de bactérias aeróbicas. Este meio está em conformidade com as farmacocopoias europeias, americanas e japonesas para testes de esterilidade 18,19,20. - Observe visualmente se alguma modificação na mídia de crescimento ocorre após 18 horas de incubação. Depois de 48 h, pegue uma gota da mídia de caldo fecal bhi, coloque-o em um slide de vidro e observe sob um microscópio (ampliação 40X) para a ausência ou presença de bactérias.
- Se houver suspeita sobre a presença de bactérias, pegue uma amostra da cultura BHI e semee-a em placas de ágar BHI. Incubar a 37 °C por 18 a 48 h.
- Se as colônias estiverem presentes, realize técnicas de alta produtividade, como espectrometria de massa MALDI-TOF para identificação microbiana precisa.
NOTA: Após 72 h, se as análises bacteriológicas forem negativas, os animais são declarados livres de germes.
Representative Results
Seis corridas de geração de filhotes livres de germes foram conduzidas com ovos Ross PM3 provenientes de duas fazendas francesas diferentes (Tabela 1). Foram coletados 853 ovos e, após duas etapas de descontaminação e 19 dias de incubação, 86,40% foram viáveis. 490 desses ovos viáveis passaram por uma terceira etapa de descontaminação e foram introduzidos em vários isoladores de eclosão, para uma taxa média de incubação de 79,80%. Isso representa uma taxa de eclosão de 68,94% em relação ao número inicial de ovos coletados.
No entanto, os resultados de eclosão variam substancialmente de acordo com a série realizada: de 41,67% para 88,16% dos filhotes viáveis em comparação com o número de ovos coletados. Essas variações também foram observadas entre as diferentes escotilhas durante o mesmo experimento. Uma vez que nem todos os isoladores têm sido usados para todas as corridas, é difícil excluir um efeito dependente de isolador. No entanto, este efeito em lote foi diretamente correlacionado com a idade das galinhas poedeiras (Figura 1), onde os ovos provenientes de galinhas mais velhas eram menos viáveis.
As seis corridas foram realizadas usando quatro isoladores de eclosão diferentes. Após o controle bacteriológico, os animais de 14 dos 16 isoladores foram confirmados como livres de germes. Isso corresponde a uma taxa de sucesso de 87,5%. Os dois isoladores restantes foram contaminados por uma única bactéria ambiental e não-patática.
Todos os animais usados para os experimentos científicos permaneceram livres de germes até o final dos estudos, por pelo menos três semanas após a eclosão.
Figura 1: Efeito da idade da galinha na taxa de eclosão O presente número destaca as taxas de eclosão observadas com base na idade do rebanho de galinhas em pondo, expressas em semanas de colocação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ovos coletados | D19 ovos viáveis | D19 ovos viáveis/ovos coletados | Ovos tranferidos em isolador 1 | Ovos tranferidos em isolador 2 | Ovos tranferidos em isolador 3 | Ovos tranferidos em isolador 4 | total de ovos transferidos | filhotes viáveis eclodiram em isolador 1 | filhotes viáveis eclodiram em isolador 2 | filhotes viáveis eclodiram em isolador 3 | filhotes viáveis eclodiram em isolador 4 | total de filhotes viáveis eclodidos | viável eclodido/transfere ovos isolados1 | viável eclodido/transfere ovos isolados2 | viável eclodido/transfere ovos isolados3 | isolador de ovos hatched/transfered viável4 | ovos viáveis eclodidos/transferidos globais | |
| Corrida 1 | 101 | 93 | 92.08% | 23 | 24 | - | - | 47 | 22 | 23 | - | - | 45 | 95.65% | 95.83% | 95.74% | ||
| Corrida 2 | 130 | 117 | 90.00% | 25 | 25 | 25 | 75 | 20 | 24 | 18 | - | 62 | 80.00% | 96.00% | 72.00% | 82.67% | ||
| Corrida 3 | 132 | 97 | 73.48% | 26 | - | 26 | 45 | 97 | 14 | - | 13 | 28* | 27 | 53.85% | 50.00% | 62.22% | 56.70% | |
| Corrida 4 | 130 | 116 | 89.23% | 36 | 35 | - | - | 71 | 33 | 34 | - | - | 67 | 91.67% | 97.14% | 94.37% | ||
| Corrida 5 | 180 | 148 | 82.22% | 30 | 30 | 30 | 30 | 120 | 26* | 25 | 17 | 24 | 66 | 86.67% | 83.33% | 56.67% | 80.00% | 76.67% |
| Corrida 6 | 180 | 166 | 92.22% | - | 40 | 40 | - | 80 | - | 35 | 35 | - | 70 | 86.67% | 87.50% | 87.50% | 87.50% | |
| Total | 853 | 737 | 86.40% | 140 | 154 | 121 | 75 | 490 | 89 | 141 | 83 | 24 | 337 | 82.14% | 91.56% | 68.60% | 69.33% | 79.80% |
Tabela 1: Resultados técnicos dos diferentes experimentos de incubação. A presente tabela destaca os resultados da série de 6 eclosões sem germes realizadas: número de ovos coletados, viabilidade do embrião aos 19 dias e filhotes viáveis nos diversos isoladores.
Discussion
Vários métodos para gerar galinhas sem germes foram descritos anteriormente 7,21,22. Métodos simples, como o apresentado aqui, utilizam diferentes desinfetantes para reduzir a carga bacteriana na superfície do ovo e nos isoladores. Os desinfetantes mais usados são cloreto mercurico, amônio quaternário, iodoforme, hipoclorito de sódio e soluções de dióxido de cloro. Os resultados são muitas vezes satisfatórios. No entanto, apesar da acessibilidade desses métodos, poucas estruturas podem aplicar o método e criar os animais em larga escala, tornando a utilização de frangos livres de germes uma abordagem relativamente rara, usada apenas para abordar questões científicas muito específicas. Os métodos, materiais e equipamentos descritos aqui permitem uma proporção de eclosão altamente eficiente de frangos sem germes, que permanecem saudáveis e estéreis por pelo menos 3 semanas (a duração dos experimentos científicos aos quais foram produzidos).
Os resultados mostram que a adaptação do protocolo à produção de filhotes livres de germes a partir de ovos coletados em granjas comerciais de aves é bem sucedida. A experiência com a produção de ovos spf revela que a eficiência do eclosão depende principalmente da idade das galinhas poedeiras e da qualidade dos ovos coletados. Ambos os parâmetros foram levados em consideração quando as fazendas foram escolhidas e os ovos coletados. Usando o mesmo método, a taxa média de eclosão de frangos sem germes é muito melhor do que a obtida na última produção de galinhas poedeiras spf em nossa instalação (79% vs 35%), sem afetar a esterilidade animal (87% vs 83%). Essas diferenças podem estar associadas ao contexto genético das aves (frangos de corte versus camadas) bem como à qualidade da casca de ovo, que provavelmente será mais frágil nos ovos dos animais da FPS, mantidos em reprodução fechada por mais de 40 anos. Além disso, também mostramos que o transporte de mais de 2h (das fazendas até a instalação experimental) não afeta a eficiência e a qualidade do eclosão.
Embora o processo de esterilização utilizado para isoladores de eclosão e o protocolo de descontaminação de ovos tenham sido otimizados, cerca de 10% dos isoladores não estavam livres de germes. Para entender a origem da contaminação, é muito importante realizar o controle de esterilização de rotina dos isoladores eclodidos antes da introdução do ovo.
Quanto ao estado de esterilidade das aves, tentamos aplicar métodos que permitem o crescimento de bactérias anaeróbicas aeróbicas e não versíbicas a partir de amostras fecais, garantindo assim que estamos detectando bactérias vivas e viáveis. Esses métodos estão em conformidade com as farmacopeias internacionais para testes de esterilidade e representam técnicas rápidas, fáceis e reduzidas de custos para serem usadas rotineiramente. No entanto, técnicas de biologia molecular, como o sequenciamento genético de rRNA 16S, embora não fornecendo informações sobre viabilidade de bactérias, podem ser aplicadas para a confirmação da presença de bactérias nãocultivais. De fato, um estudo recente sugeriu que algumas bactérias da microbiota oviduto materno parecem ser transferidas para o embrião através da clara de ovo, mais tarde constituindo a maior parte da população bacteriana intestinal5. Além disso, outro estudo sugeriu que parte dos colonizadores microbianos abrigados em embriões primitivos foram herdados de galinhas maternas, e a abundância e diversidade microbiana intestinal foram posteriormente influenciadas por fatores ambientais e genética hospedeira durante o desenvolvimento23. No entanto, os resultados desses estudos são baseados na análise de sequência de DNA, onde um grande número dessas bactérias pode estar morta ou não replicável na clara de ovo (muito carregada com moléculas antimicrobianas). Thomas e colaboradores16 realizaram testes de esterilidade através da avaliação de bactérias aeróbicas cultivable aeróbicas e facultativas através da queda fecal em placas de BHI, destacando assim a eficiência dos métodos bacteriológicos padrão para o controle da esterilidade livre de germes. Além disso, no protocolo proposto, utilizamos o monitoramento de crescimento no caldo de tioglicolato com resazurina para detectar o crescimento de bactérias anaeróbicas nãofastidiosas.
Já utilizado para a produção de codornas e galinhas livres de germes, o protocolo é adaptável à produção de animais livres de germes da maioria das aves de ninho e oferece perspectivas para o estudo da contribuição da microbiota para a fisiologia desses animais. Além do uso desse modelo para investigar interações mútuas hospedeira-microbiota no intestino avícola, também pode ser útil para a pesquisa aplicada. Por exemplo, poderia ser usado para avaliar a segurança e a eficácia de probióticos derivados de microrganismos commensais de intestino de frango para melhorar a saúde e robustez do animal.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos criadores e à sociedade Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, França) pelo fornecimento de ovos fertilizados. Este estudo foi realizado sob os auspícios do consórcio de pesquisa APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019), financiado pelo Centro Région Val de Loire, na França.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
| 50 mL tubes | Falcon | ||
| BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
| Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
| Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
| Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
| Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
| Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
| Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
| Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
| Pipette aid | Drummond | ||
| Plastic pipettes | |||
| Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
| Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
| Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
| Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |
References
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