Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Summary

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur nahtlosen Genbearbeitung in humanen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der Cas9-Nickase-Mutante. Zwei Punktmutationen wurden in Exon 8 des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Locus (HNF4α) in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt.

Abstract

Maßgeschneiderte Endonukleasen, wie RNA-geführte Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, ermöglichen eine effiziente Genom-Editierung in Säugetierzellen. Hier beschreiben wir detaillierte Verfahren zur nahtlosen Genomeditierung des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Locus (HNF4α) als Beispiel in humanen pluripotenten Stammzellen. Durch die Kombination eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der CRISPR-Cas9-Nickase-Mutante in einer zweistufigen genetischen Selektion demonstrieren wir ein korrektes und effizientes Targeting des HNF4α-Locus.

Introduction

Humane pluripotente Stammzellen (hPS-Zellen) stellen eine unbegrenzte Quelle somatischer Zellen für die Forschung oder die Klinik dar¹. Das Gen-Targeting in hPS-Zellen bietet eine leistungsstarke Methode, um die Genfunktion während der Zellspezifikation zu untersuchen und Krankheitsmechanismen zu verstehen. Obwohl es effiziente Genom-Editing-Methoden gibt, bleibt die Modifizierung von Genen in hPS-Zellen eine technische Herausforderung. Standard-Gen-Targeting durch homologe Rekombination in hPS-Zellen tritt bei niedriger Frequenz auf oder ist bei einigen Genen sogar nicht nachweisbar 2, und DNA-Doppelstrangbruch (DSB) stimuliertes Gen-Targeting (als Geneditierung bezeichnet) ist daher in diesen Zellen^{notwendig 2,3}. Darüber hinaus ist die Transfektion von hPS-Zellen und die anschließende Klonierung einzelner Zellen nicht sehr effizient, obwohl die Einzelzell-assoziierte Apoptose durch den Einsatz des Rho-assoziierten Proteinkinase-Inhibitors (ROCK) reduziert werden kann⁴. Schließlich können auch die potenziellen On-Target- und Off-Target-Mutationen am interessierenden Gen problematisch sein. Daher ist ein zuverlässiges Protokoll unerlässlich, um maßgeschneiderte genetische Veränderungen in hPS-Zellen vorzunehmen.

Die RNA-geführte CRISPR- (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) und CRISPR-assoziierte Protein-9-Technologie (Cas9) ist heute ein etabliertes Werkzeug in der Genbearbeitung. Transkribierte CRISPR-RNA (crRNA) und eine transaktivierende RNA (tracrRNA) bilden die Single Guide RNA (sgRNA), die sich mit dem Cas9-Protein komplexiert und eine genspezifische Spaltung ermöglicht⁵. Das CRISPR/Cas9-System ist programmierbar, indem eine 20-bp-Führungssequenz der sgRNA geändert wird, was bedeutet, dass fast jeder Locus, der die Anforderung an das Protospacer-benachbarte Motiv (PAM) erfüllt, bearbeitet werden kann. Der Wildtyp Cas9 kann jedoch einige Diskrepanzen zwischen seiner Führungssequenz und einem DNA-Ziel tolerieren, was zu unerwünschten Off-Target-Effekten führen kann. Um seine Spezifität zu verbessern, wurde eine Nickase-Mutante (Cas9n) entwickelt. Eine Cas9n-Mutation, die D10A oder N863A enthält, besitzt nur eine funktionelle Nukleasedomäne und kann daher nur DNA auf einem Strang einnicken. Ein Paar Cas9n, das angemessen verteilt und orientiert ist, kann effektiv DNA-DSB induzieren, und die Off-Target-Effekte werden dramatisch reduziert⁶. Um eine effiziente Cas9n-Modifikation zu gewährleisten, wurde gezeigt, dass zwei Cas9n-sgRNA idealerweise mit einem Offset von -4 bis 20 bp platziert werden und immer einen 5'-Überhang⁶ erzeugen sollten.

Cas9(n)-sgRNA-induziertes DSB kann für die Genom-Editierung in hPSCs ^7,8 verwendet werden. Es kann Gen-Knockout durch nicht-homologe Endverbindungsreparatur erzeugen oder Genmodifikation durch homologiegesteuerte Reparatur (HDR) einführen, wenn eine Spender-DNA-Vorlage vorhanden ist. Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein piggyBac-Transposon-basiertes Donor-Plasmid (oder Targeting-Vektor) für HDR, bei dem ein Arzneimittelresistenzmarker von den transposon-invertierten Wiederholungen flankiert wird. Der Vorteil dieses Ansatzes ist ein effizientes Screening und eine nahtlose Gen-Editierung, wie Yusa et ^al.9,10 erstmals gezeigt haben. Die Wirkstoffauswahlkassette ermöglicht die Anreicherung von Zellen mit dem integrierten Vektor, die anschließend mittels Junction-PCR gescreent werden, um die durch HDR abgeleiteten Zellen zu identifizieren. Darüber hinaus kann die Wirkstoffauswahlkassette so positioniert werden, dass sie die Zielsequenzen für die Cas9(n)-Spaltung ersetzt, so dass nach HDR kein weiterer DNA-Bruch auftritt, wodurch "On"-Zielmutationen eliminiert werden, die aus der Cas9(n)-Re-Spaltung resultieren. Darüber hinaus wird durch Ausnutzung der präzisen Exzision, die durch piggyBac-Transposase katalysiert wird, der Selektionsmarker dann aus dem Genom entfernt, ohne eine Narbe zu hinterlassen. Nur die ursprüngliche endogene TTAA-Sequenz für die piggyBac-Insertion verbleibt nach der Entfernung des Arzneimittelauswahlmarkers⁹. Selbst wenn die TTAA-Standorte durch die Einführung von Substitutionen geschaffen werden müssen, ist die Wahrscheinlichkeit störender regulatorischer Elemente im Vergleich zu anderen Methoden geringer¹⁰.

Hier beschreiben wir detaillierte Verfahren zur Implementierung von Seamless Genome Editing in hPSCs. Durch die Kombination eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der CRISPR-Cas9-Nickase-Mutante in einer zweistufigen genetischen Selektion haben wir zwei vorbestimmte Punktmutationen in das Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Gen (HNF4α)¹¹ eingeführt. Dieser Ansatz ist zuverlässig und effizient und hat eingehende Analysen der wichtigen Rolle ermöglicht, die HNF4α bei der Endoderm- und Hepatozytenspezifikation von humanen pluripotenten Stammzellen^{spielt 11}.

Protocol

1. Design und Konstruktion von CRISPR/Cas9n-sgRNA-Expressionsplasmiden

1. Suchen Sie nach 20-bp-Führungssequenzen direkt stromaufwärts eines beliebigen 5'-NGG in der Nähe des zu ändernden Standorts. Ein Paar Single-Guide-RNAs (sgRNAs) wird benötigt, wenn die Cas9-Nickase (Cas9n) aus Streptococcus pyogenes verwendet wird. Das sgRNA-Paar muss in der Lage sein, 5'-Überhänge beim Nicken mit^{einem Offset von} -4 bis 20 bp 6 zu erzeugen.
2. Bestellen Sie notwendige Oligos und pSpCas9n-2A-puro Vektor.
3. Klonen Sie sgRNA in den pSpCas9n-Vektor zur Co-Expression mit Cas9n gemäß dem veröffentlichten Protokoll¹².

2. Entwurf und Aufbau eines piggyBac-basierten Targeting-Vektors

1. Laden Sie die Zielgensequenz herunter und suchen Sie nach einer TTAA-Stelle in der Nähe der zu modifizierenden Stelle.
   HINWEIS: Der Abstand zwischen dem TTAA-Standort und dem zu ändernden Standort sollte so gering wie möglich sein. Wenn innerhalb der kodierenden Sequenz und innerhalb eines 100-bp-Abstands keine TTAA-Stelle vorhanden ist, ist es notwendig, eine durch synonyme Nukleotidsubstitutionen einzuführen.
2. Entwerfen Sie Homologiearme (HAs) und integrieren Sie gewünschte Punktmutationen in die HAs. Die optimale Länge von HAs sollte etwa 500 - 1200 bp betragen.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, synonyme Nukleotidsubstitutionen einzuführen, um die PAM-Sequenz zu mutieren, um eine mögliche Cas9n-Re-Spaltung zu vermeiden.
3. Konstruieren Sie den endgültigen Zielvektor nach einem festgelegten Protokoll¹⁰.
   HINWEIS: In dem hier verwendeten Zielvektor wird eine PGK-Promotor-gesteuerte Puro-deltaTK-Auswahlkassette von transposon-invertierten Wiederholungen flankiert.

3. Genetische Editierung humaner pluripotenter Stammzellen

1. Halten Sie humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂ auf rekombinanten Laminin 521-beschichteten Oberflächen (5 μg/ml) in mTeSR1-Medium¹³. Die Zellen sollten nach 72 Stunden nach einem 1:3-Split-Verhältnis 70-85% Konfluenz erreichen.
   HINWEIS: Falls vorhanden, entfernen Sie spontan differenzierte Zellen vor dem täglichen Medienwechsel, indem Sie sie sanft absaugen.
2. Am Tag der Transfektion genügend Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 300 μL der Laminin 521-Lösung (5 μg/ml) bei 37 °C für mindestens 2 h beschichten.
3. Entfernen Sie die Beschichtungslösung vorsichtig und geben Sie 300 μL frisches mTeSR1-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor, in jede Vertiefung und legen Sie dann die Platte zurück in den Inkubator, um Zellen aufzunehmen.
   HINWEIS: Lassen Sie die Platten zu keinem Zeitpunkt trocknen, wenn die Laminin-Beschichtungslösung entfernt wird.
4. Ziehen Sie die hPS-Zellen aus dem Inkubator, entfernen Sie verbrauchtes Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 1 ml sterilem 1x DPBS.
5. Geben Sie 1 ml sanftes Zelldissoziationsreagenz in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 °C für 6-8 min, um die Zellen zu dissoziieren.
   HINWEIS: Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte und prüfen Sie, ob sich die Zellen leicht lösen können, um zu entscheiden, ob die Verdauung lang genug ist.
6. Pipettieren Sie vorsichtig mit einer P1000-Spitze, um alle hPSCs abzuheben.
7. Beenden Sie die Dissoziation durch Zugabe von 2 ml frischem mTeSR1-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632), in die Zellsuspension.
8. Gut mischen und die einzellige Suspension in ein 50-ml-Röhrchen geben und bei 200 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
9. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen gut in 2 ml frischem mTeSR1-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor.
10. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer. Verwenden Sie Trypan Blue, um tote Zellen zu färben und auszuschließen.
11. 8 x 10 5 bis 1 x 10⁶ lebende Zellen werden für jede Nukleofektionsreaktion in ein^1,5 ml Röhrchen überführt und bei 200 x g für 3 min zentrifugiert. Dann saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.
12. Mischen Sie 3 μg der gepaarten Cas9n-sgRNA-Expressionsplasmide und 5 μg Zielvektorplasmid in 100 μL gemischter Nukleofektionslösung/Ergänzung aus dem humanen Stammzell-Nukleofektionskit. Verwenden Sie das GFP-Kontrollplasmid aus dem Kit und bereiten Sie auch eine GFP-Kontrollplasmidmischung vor.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine Maxi-Vorbereitung aller Plasmide durchzuführen, um die Endotoxinkontamination vor der Nukleofektion zu reduzieren. Die Konzentration der Plasmide sollte etwa 1 μg/μL betragen.
13. Verwenden Sie die DNA-Mischung (Volumen ~ 111 μL), um die vorbereiteten Zellen zu resuspendieren und in eine Elektroporationsküvette (im Lieferumfang des Nukleofektionskits enthalten) zu übertragen, um Blasen zu vermeiden.
14. Elektropolieren Sie die Zellen mit der Nukleofektionsvorrichtung, indem Sie die optimierten Bedingungen für menschliche pluripotente Stammzellen auswählen.
    HINWEIS: Wenn Sie das Nukleofektionskit zum ersten Mal für humane pluripotente Stammzellen verwenden, ist es notwendig, das Elektroporationsprogramm zu testen und das effizienteste auszuwählen.
15. Sofort 500 μL frisches und warmes bis 37 °C mTeSR1-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor, in die elektropolierten Zellen geben. Die Mischung wird in 2 Vertiefungen einer aus den Schritten 3.2 und 3.3 vorbereiteten 24-Well-Platte überführt.
16. Legen Sie die Platte schnell wieder in den 37 °C/5%_{CO2-Inkubator} und lassen Sie die Zellen sich erholen.
17. 12-16 h später das Zellerhaltungsmedium wechseln. Wenn die Zellen Zell-Zell-Kontakt hergestellt haben, ziehen Sie den ROCK-Inhibitor zurück, wenn nicht, ergänzen Sie das Medium weiterhin mit dem Inhibitor.
18. Überprüfen Sie zwischen 24-48 h die Effizienz der Nukleofektion, indem Sie die GFP-Expression in den Kontrollzellen untersuchen. GFP-positive Zellen sollten mindestens 30 Prozent betragen.
19. 48 h nach der Nukleofektion beginnen Sie mit der Zellselektion, indem Sie das mTeSR1-Medium mit 1 μg/ml Puromycin ergänzen.
20. 72 h nach der Nukleofektion das mTeSR1-Medium mit 0,5 μg/ml Puromycin ergänzen. Wenn die Zellkonfluenz niedriger als 30% ist, ergänzen Sie das Medium auch mit einem 10 μM ROCK-Inhibitor.
21. 4-6 Tage nach der Nukleofektion passieren Sie die Puromycin-resistenten Zellen zu 10-15 x 96-Well-Platten mit einer Konzentration von 0,8 Zellen / Well.
    HINWEIS: Es ist wichtig, das Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor und 0,5 μg / ml Puromycin zu ergänzen.
22. Halten Sie diese Zellen 10-12 Tage lang bei 37 °C / 10% CO₂ , um einzelne Zellkolonien zu bilden. Medium einmal 7 Tage nach der Aussaat auffüllen.
    HINWEIS: Ein erhöhter CO₂ -Gehalt hilft einzelnen hPSCs, Kolonien zu bilden.
23. Markieren Sie Vertiefungen, die eine einzelne Kolonie enthalten, und ersetzen Sie das Medium durch frisches mTeSR1-Medium, das 0,5 μg/ml Puromycin, aber keinen ROCK-Inhibitor enthält.
    HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt werden die Zellen unter 37 °C/5%_CO2 gezüchtet.
24. Zwei Tage später wechseln Sie das Medium für Brunnen mit undifferenzierten Kolonien. Ergänzen Sie das Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor und 0,5 μg/ml Puromycin.
    HINWEIS: In einigen Vertiefungen haben sich die Zellen möglicherweise differenziert und müssen verworfen werden.
25. Verwenden Sie P2-Pipettenspitzen, um die Kolonien sanft abzukratzen. Übertragen Sie die von einer Kolonie abgeleitete Zellsuspension in 2 neue Vertiefungen auf separaten 96-Well-Platten und verwenden Sie eine für die Genotypisierung und eine für die Wartung.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Kolonien sorgfältig zu pflegen und das spontane Differenzierungsniveau auf ein Minimum zu beschränken.
26. Nehmen Sie die Platte mit Zellen zur Genotypisierung heraus, sobald der Konfluenz in den meisten Vertiefungen 50% oder mehr erreicht hat. Entsorgen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die Zellen dann einmal mit DPBS.
27. Lysieren Sie die Zellen mit Bradley-Lysepuffer gut und isolieren Sie genomische DNA aus jeder Vertiefung in der Platte nach zugehörigem Protokoll (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).
28. Verwenden Sie eine Drei-Primer-Junction-PCR-Methode, um sowohl linke als auch rechte Homologiearme unabhängig voneinander zu genotypisieren¹⁰.
    HINWEIS: Ein Schema, das die PCR-Methode zeigt, ist in Abbildung 2 dargestellt.
29. Senden Sie die Junction-PCR-Produkte für beide Homologiearme von 4-5 Kolonien zur Sanger-Sequenzierung und erhalten Sie die Sequenzen.
    HINWEIS: Das Sequenzierungsergebnis von 2 etablierten Kolonien ist in Abbildung 3A dargestellt.
30. Halten Sie Kolonien mit dem richtigen Genotyp und werfen Sie den Rest weg.
31. Erweitern Sie die richtigen Kolonien unter kontinuierlicher Puromyklektion und frieren Sie sie so früh wie möglich ein.

4. Entfernung von Transposon aus gezielten humanen pluripotenten Stammzellen

1. Pflegen Sie eine Kolonie mit korrektem Genotyp unter 0,5 μg / ml Puromycin-Selektion.
2. Nucleofect 8 x 10 5 bis 1 x 10⁶ Zellen mit⁵ μg hyperaktiver Transposase (pCMV-hyPBase) wie oben beschrieben (Abschnitt 3, Schritte 3.4-3.18). Führen Sie parallel eine GFP-Kontrollnukleofektion durch.
   HINWEIS: Puromycin sollte unmittelbar nach der Nukleofektion dieser Zellen aus dem mTeSR1-Medium entfernt werden.
3. Züchten und Screening auf Zellen, wobei die Puro-deltaTK-Auswahlkassette nach veröffentlichten Verfahren entfernt wurde¹⁰.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die ursprünglichen Verfahren sorgfältig zu befolgen. FIAU, oder 1-(2-Desoxy-2-fluor-β-d-arabinofuranosyl)-5-iodouracil), wurde als Thymidin-Analogon für Herpes-simplex-Virus-abgeleitete Thymidinkinase (HSV-tk)-basierte negative Selektion verwendet.
4. Sequenzieren Sie den modifizierten Bereich, um die Entfernung des Transposon zu bestätigen.
   HINWEIS: Das Sequenzierungsergebnis von 3 etablierten Kolonien ist in Abbildung 3B dargestellt.
5. Halten Sie Kolonien mit dem richtigen Genotyp und erweitern Sie sie für die weitere Verwendung.
6. Führen Sie eine Charakterisierung von Pluripotenzmarkern in den ausgewählten Kolonien durch, bevor Sie sie für die weitere Analyse verwenden.
   HINWEIS: Die Charakterisierung von zwei etablierten Kolonien ist in Abbildung 4 dargestellt.

Results

Vektorbasierte Knock-in-Strategie im Visier
Das Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Gen (HNF4α) wurde für die gezielte Genom-Editierung ausgewählt, um Zwei-Punkt-Mutationen in Exon 8 einzuführen. Ein Paar Cas9n-sgRNA mit 11 bp Offset wurde in der Nähe der zu modifizierenden Stelle entworfen. Der piggyBac-basierte Zielvektor diente als homologiegesteuerte Reparaturvorlage für die Einführung der gewünschten Punktmutationen. Ein 967 bp 5'-HA und ein 1142 bp 3'-HA mit synonymen Nukleotidsubstitutionen oder den gewünschten Punktmutationen wurden amplifiziert und in den endgültigen Zielvektor kloniert. Die piggyBac-Insertionsstelle war 16 bp und 22 bp von den beiden gewünschten Punktmutationen entfernt. Kolonien, die die Puro-deltaTK-Selektionskassette enthielten, wurden in der ersten Runde mit Puromycin selektiert. Nachdem die Selektionskassette in der zweiten Runde durch Transposase-Exzision entfernt wurde, wurde die Zielstelle nahtlos modifiziert, wobei nur die gewünschten Punktmutationen in das Gen eingebaut wurden (Abbildung 1).

Genetische Editierung in humanen pluripotenten Stammzellen
Um nach korrekt anvisierten Zellen zu suchen, wurde eine drei-Primer-basierte PCR-Methode zur Genotypisierung verwendet (Abbildung 2). Zur Bestätigung der PCR-Ergebnisse wurde eine Sanger-Sequenzierung durchgeführt (Abbildung 3A). Nach der Entnahme der Selektionskassette wurde die modifizierte Region erneut sequenziert, um die korrekte Einführung der gewünschten Punktmutationen zu bestätigen (Abbildung 3B).

Koloniebildung und Charakterisierung editierter humaner pluripotenter Stammzellen
Kolonien mit dem richtigen Genotyp wurden ausgewählt und nach Bedarf erweitert. Die etablierten Kolonien müssen charakterisiert werden, bevor sie für weitere Analysen verwendet werden. Die bearbeiteten Zellen besitzen die gleiche Morphologie wie die Elternzellen (Abbildung 4A). Sie exprimieren auch repräsentative humane pluripotente Stammzellmarker, einschließlich der Transkriptionsfaktoren NANOG und OCT4 (Abbildung 4 B) sowie der Zelloberflächenmarker SSEA4 und TRA-1-60 (Abbildung 4C).

Abbildung 1: Targeting-vektorbasierte Knock-in-Strategie¹¹. Ein Paar Cas9n-sgRNA-Expressionsplasmide wurde verwendet, um DNA-Doppelstrangbruch im Exon 8 des HNF4α-Gens zu induzieren. Ein Zielvektor mit einer Auswahlkassette wurde verwendet, um vorgegebene Punktmutationen einzuführen, die 16 bp und 22 bp entfernt lagen. Diese Selektionskassette war im piggyBac-Transposon enthalten, bestehend aus einem positiv-negativen Selektionsmarker (puro-deltaTK), der von einem konstitutiv aktiven Promotor (PGK) angetrieben wurde. Über einen homologiegesteuerten Reparaturweg bauten die Zielzellen die Selektionskassette ein. Die Transposon-Exzision, die durch Transposase vermittelt wird, führt zu einer nahtlosen Modifikation, bei der nur die Punktmutationen vorhanden sind. Rotes Kreuz zeigt den Ort der gewünschten Punktmutationen an. HA = Homologiearm; PB = piggyBac; PM = Punktmutation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Drei Primer-basierte PCR-Methoden. Um Gen-zielgerichtete Zellen zu screenen, wurde PCR-basierte Genotypisierung verwendet. Drei Primer, LA-F1, -R1 und -R2 wurden verwendet, um die linke Homologiearmregion zu verstärken. Unabhängig voneinander wurden RA-F1, -F2 und -R1 verwendet, um die rechte Homologiearmregion zu verstärken. Basierend auf dem Ergebnis der Gelelektrophorese wurden nicht-zielgerichtete Zellen sowie heterozygote und homozygote Zellen voneinander unterschieden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Sequenzierungsergebnisse von gentechnisch veränderten Zellen¹¹. PCR-Produkte aus zwei Klonen wurden sequenziert und bestätigten das korrekte Einsetzen der Auswahlkassette am Ziellocus (A). 5' und 3' piggyBac inverted terminal repeats (ITR) wurden von den TTAA direct repeats flankiert. Drei Klone wurden nach der Transposonexzision sequenziert (B). Ein Paar Cas9n-sgRNA mit 11 bp Offset wurde verwendet, um DNA-Doppelstrangbruch einzuführen. Zwei vorgegebene Punktmutationen (A zu G und A zu C) wurden in das Gen eingebracht. Eine synonyme Mutation wurde eingeführt, um das Protospacer-benachbarte Motiv (PAM) zu mutieren, und eine weitere, um die TTAA-Stelle zu schaffen, die für die PiggyBac-Exzision notwendig ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Charakterisierung editierter humaner pluripotenter Stammzellen. Morphologie zweier editierter Zelllinien und der Elternzellen (A), Maßstabsbalken = 100 μm. Die Expression der pluripotenten Stammzellmarker NANOG und OCT4 wurde durch Immunfärbung (B, Maßstabsbalken = 50 μm) zusätzlich zu SSEA4 und TRA-1-60 mittels Durchflusszytometrie (C) in zwei modifizierten Zelllinien und den Elternzellen untersucht. IgG wurde als Negativkontrolle verwendet. DAPI wurde verwendet, um den Kern zu färben. Die Prozentsätze wurden als Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Das hierin beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um vorgegebene Punktmutationen in einen endogenen Locus in hPS-Zellen einzuführen. Die Kombination aus einem piggyBac-basierten Targeting-Vektor und gepaarten CRISPR/Cas9n-Expressionsplasmiden erwies sich als zuverlässig und effizient¹¹. Nach der HNF4α-Geneditierung wurden 12 von 43 analysierten Klonen korrekt anvisiert, wie durch Junction-PCR-Screening bestimmt. Insbesondere lag die biallelische Targeting-Effizienz bei etwa 21% (9/43) und die monoallelische Targeting-Effizienz bei etwa 7% (3/43).

Nach Targeting-Experimenten ist es entscheidend, die Puromycin-Selektion beizubehalten, um den Ziellocus während der ersten Screening-Runde für die piggyBac-Transposase zugänglich zu halten. Dies minimiert die Stummschaltung der PGK-Promotor-gesteuerten puro-deltaTK-Auswahlkassette und reduziert den Hintergrund in der zweiten Runde von Screening¹⁰. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte, dass CAG-Promotor resistenter gegen Silencing ist als PGK-Promotor in hPSCs¹⁴. Ein Wechsel des Promoters für die Auswahlkassette könnte dieses System daher in Zukunft verbessern. Es ist auch wichtig, die Anzahl der resistenten Kolonien aus hyPBase- und GFP-transfizierten Zellen zu vergleichen. Nach erfolgreicher Entfernung des Transposon sollten mehr überlebende Kolonien aus den hyPBase- als GFP-transfizierten Zellen vorhanden sein. Zusätzlich zur PCR-Analyse der Transposon-Exzision ist eine direkte Sequenzierung der modifizierten Region erforderlich, um die Exzisionstreue zu bestätigen.

Basierend auf Yusas piggyBac-Transposon-basierter Targeting-Vektor-Strategie ^9,10 konzentrierten sich die oben beschriebenen Verfahren auf die Verbesserung der hPS-Nukleofektion und der Effizienz der Klonierung einzelner Zellen. Die Zellaussaatdichte wurde optimiert, um die Wahrscheinlichkeit einer heterogenen Koloniebildung zu reduzieren. Wir verwendeten auch 10-12 Tage Kultur unter 10% CO₂, um die Kolonieproduktion für das Genotyp-Screening zu verbessern. Nach unserer Erfahrung konnten aus jeder 96-Well-Platte etwa 20 Kolonien gewonnen werden. Obwohl dieser Schritt mehr Zeit in Anspruch nehmen kann als andere Methoden, ist er zuverlässig und hocheffizient.

Je nach Bedarf können Targeting-Vektoren entworfen werden, um Punktmutationen einzuführen oder zu korrigieren, Reporterzelllinien zu erzeugen sowie Knockout-Genexpression. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination des CRISPR/Cas9(n)-Systems und eines Targeting-Vektors ein effizienter Weg ist, um verschiedene Arten von genetisch veränderten hPS-Zellen zu liefern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Human-SSEA4 PE	eBioscience	12-8843-42
Anti-Human-TRA-1-60 PE	eBioscience	11-0159-42
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
DPBS mit Calcium und Magnesium	Thermo Fisher Scientific	14040133
FIAU	Moravek	M251
Sanfte Zelle Dissoziationsreagenz	Stem Cell Technologies	07174
H9 Humane embryonale Stammzellen	WiCell	WA09
Humane NANOG-Antikörper	R& D systems	AF1997
Humaner OCT4-Antikörper	Abcam	AB19857
Humaner Stammzell-Nukleofector-Bausatz 1	Lonza	VPH-5012
Maus IgG3-Isotypkontrolle PE	eBioscience	12-4742-41
mTeSR1 Medium	Stem Cell Technologies	85850
Nukleofector 2b-Baustein	Lonza	AAB-1001
pCMV-hyPBase	Wellcome Trust Sanger Institute	N/A
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK	Wellcome Trust Sanger Institute	N/A
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)	Addgene	PX462
Puromycin dihydrochlorid	Thermo Fisher Scientific	A11138-03
QIAprep spin maxiprep kit	Qiagen	12162
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Rekombinantes Laminin 521	BioLamina	LN521
Trypanblau-Lösung, 0,4 %	Thermo Fisher Scientific	15250061
Y-27632 (Dihydrochlorid)	Millipore	SCM075