3D-Partikelverfolgung für die nicht-invasive in vivo Analyse der synaptischen Mikrotubuli-Dynamik in Dendriten und neuromuskulären Verbindungen von Drosophila

Zusammenfassung

In dieser Studie wird eine nicht-invasive intravitale neuronale Bildgebungsstrategie in Kombination mit einer neuen Softwarestrategie vorgestellt, um eine automatisierte, unvoreingenommene Verfolgung und Analyse der in vivo Mikrotubuli (MT) plus Enddynamik in den sensorischen Dendriten und den neuromuskulären Verbindungen von Drosophila zu erreichen.

Zusammenfassung

Mikrotubuli (MTs) spielen eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Entwicklung, aber es bleiben viele Fragen zu den molekularen Mechanismen ihrer Regulation und Funktion offen. Darüber hinaus ist trotz Fortschritten im Verständnis postsynaptischer MTs viel weniger über den Beitrag präsynaptischer MTs zur neuronalen Morphogenese bekannt. Insbesondere Studien zur in vivo MT-Dynamik in sensorischen Dendriten von Drosophila lieferten signifikante Einblicke in das Verhalten auf Polymerebene. Die technischen und analytischen Herausforderungen, die mit der Live-Bildgebung der neuromuskulären Verbindung (NMJ) der Fliege verbunden sind, haben jedoch vergleichbare Studien zur präsynaptischen MT-Dynamik eingeschränkt. Darüber hinaus gibt es zwar viele hocheffektive Softwarestrategien für die automatisierte Analyse der MT-Dynamik in vitro und ex vivo, aber In-vivo-Daten erfordern aufgrund des von Natur aus schlechteren Signal-Rausch-Verhältnisses in Bildern und der komplexen zellulären Morphologie oft erhebliche Bedienereingaben oder eine vollständig manuelle Analyse.  Um dies zu adressieren, wurde in dieser Studie eine neue Softwareplattform für die automatisierte und unvoreingenommene in vivo Partikeldetektion optimiert. Die multiparametrische Analyse von konfokalen Live-Zeitrafferbildern von EB1-GFP-markierten MTs wurde sowohl in Dendriten als auch im NMJ von Drosophila-Larven durchgeführt und fand auffällige Unterschiede im Verhalten der MT. Darüber hinaus wurde die MT-Dynamik nach dem Knockdown des MT-assoziierten Proteins (MAP) dTACC, einem Schlüsselregulator der Synapsenentwicklung von Drosophila, analysiert und statistisch signifikante Veränderungen in der MT-Dynamik im Vergleich zum Wildtyp identifiziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese neuartige Strategie zur automatisierten multiparametrischen Analyse der prä- und postsynaptischen MT-Dynamik auf Polymerebene die Human-in-the-Loop-Kriterien signifikant reduziert. Die Studie zeigt darüber hinaus den Nutzen dieser Methode bei der Detektion unterschiedlicher MT-Verhaltensweisen nach dTACC-Knockdown, was auf eine mögliche zukünftige Anwendung für funktionale Screens von Faktoren hinweist, die die MT-Dynamik in vivo regulieren. Zukünftige Anwendungen dieser Methode könnten sich auch auf die Aufklärung von zelltyp- und/oder kompartimentspezifischen MT-Verhaltensweisen und die mehrfarbige korrelative Bildgebung von EB1-GFP mit anderen zellulären und subzellulären Markern von Interesse konzentrieren.

Einleitung

Zellen organisieren sich durch die Koordination intra- und interzellulärer Veränderungen über die Morphogenese zu funktionellen Strukturen. Ein bemerkenswertes Beispiel für die Morphogenese ist die Entwicklung der hochspezialisierten neuronalen Struktur. Neuronen weisen eine bemerkenswerte Polarisation auf, bei der sie zwei strukturell und funktionell unterschiedliche Arten von Fortsätzen, Dendriten und Axone¹, verlängern, die immense Längen erreichen können. Die Komplexität der neuronalen Entwicklung ergibt sich nicht nur aus der schieren Größe von Dendriten und Axonen, sondern auch aus der Schwierigkeit, ihre kompliziert verzweigten Geometrien zu bilden ^2,3. Die neuronale Morphogenese und ihre Auswirkungen auf Lernen und Gedächtnis⁴ motivieren zu einer kontinuierlichen Erforschung sowohl ihrer genetischen Kontrolle als auch der zugrundeliegenden zellbiologischen Mechanismen. Zu diesen Mechanismen gehören unter anderem der intrazelluläre Membrantransport und die vielen Umlagerungen des Zytoskeletts, die für Veränderungen in der neuronalen Morphologie erforderlich sind ^1,2,3.

Studien zur neuronalen Morphogenese haben eine Vielzahl fortschrittlicher Visualisierungstechniken hervorgebracht. Statische Methoden, wie die Elektronenmikroskopie oder die Fluoreszenzmikroskopie von festen Sonden, werden häufig eingesetzt, um hochauflösende morphologische und strukturelle Analysen durchzuführen. Abgesehen von den Artefakten, die bei jeder Konservierungsmethode unvermeidlich sind, kann die statische Visualisierung jedoch die dynamischen Veränderungen, die der Morphogenese zugrunde liegen, nicht erfassen. So stammen viele entscheidende Erkenntnisse aus der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von lebendem Gewebe. Frühe Arbeiten von Lichtman und Kollegen ^5,6,7 nutzten In-vivo-Bildgebung des Nervensystems von Säugetieren, um die Axonregeneration/-degeneration, die Organisation synaptischer Komponenten und den axonalen Transport über große Entfernungen zu untersuchen. Darüber hinaus waren bahnbrechende Studien an primären neuronalen Explantaten entscheidend für die Etablierung der Bedeutung der Mikrotubuli (MT)-Dynamik für die axonale Elongation und Motilität ^8,9. Entscheidend ist, dass frühe neuronale Explantatsstudien die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Endbindungsproteinen (EBs) etablierten, um unschätzbare Einblicke in die Dynamik von MT plus Ende bei der Entwicklung von Neuronen auf der Ebene einzelner MT-Polymere zu gewinnen¹⁰. Diese Studien ergaben sich aus Beobachtungen, dass das EB-Familienmitglied EB1 bevorzugt an MT plus Enden¹¹ in S. cerevisiae¹² und in kultivierten Zellen¹³ lokalisiert. Seitdem werden EB1 und andere Plus-Tip-Tracking-Proteine (+TIPs)^14,15 in zahlreichen In-vivo-Studien zur dynamischen Instabilität der MT¹⁶ eingesetzt, auch im Zusammenhang mit der neuronalen Entwicklung¹⁷.

Drosophila ist ein leistungsfähiges Modell für in vivo bildgebende Untersuchungen der MT-Dynamik während der neuronalen Entwicklung, da umfangreiche genetische und bildgebende Werkzeuge für Fliegenstudien zur Verfügung stehen^18,19 sowie die Ähnlichkeiten in Struktur und Funktion zwischen Drosophila und Wirbeltierneuronen¹. In einer wichtigen frühen Studie der neuromuskulären Verbindung (NMJ) von Drosophila-Larven wurde wiederholte nicht-invasive Bildgebung eines fluoreszierenden Membranmarkers durch die durchscheinende Kutikula intakter Tiere durchgeführt, um die präsynaptische terminale Morphogenese zu dokumentieren²⁰. Unter Verwendung einer ähnlichen Methode zur Abbildung ganzer, lebender Drosophila-Larven wurde eine erste Demonstration der subzellulären Analyse der prozessiven Bewegung von Motorfrachten in den Axonen auf Partikelebene durchgeführt²¹. In jüngerer Zeit charakterisierten akribische Studien von Rolls und Kollegen an den sensorischen Dendriten intakter Drosophila-Larven 22,23,24,25,26,27 die postsynaptische MT plus-End-Dynamik durch Partikelverfolgung und Analyse von grün fluoreszierendem Protein (GFP)-markiertem EB1. Solche Studien an Drosophila 22,23,24,25,26,27 und anderen Systemen 28,29,30,31,32 haben das Verständnis des Einzelpolymerverhaltens von MT plus Enden in den Dendriten der sich entwickelnden Neuronen^{signifikant verbessert 33}.

Trotz der beeindruckenden in vivo-Studien der postsynaptischen MT-Dynamik 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 gab es weitaus weniger vergleichbare Studien zur präsynaptischen MT-Dynamik am sich entwickelnden Axonterminal. Die MT-Dynamik an der Drosophila-Larve NMJ wurde mittels Fluoreszenz-Speckle-Mikroskopie (FSM) und Fluoreszenz-Recovery nach Photobleaching (FRAP) ^untersucht34. Diese Techniken bewerten die gesamte Tubulinkinetik, nicht jedoch das Verhalten einzelner MT plus-Enden. Zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Artikels gab es eine einzige Untersuchung einzelner MT plus Enden am Drosophila NMJ: Diese Studie kombinierte Live-Zeitraffer-Bildgebung mit manueller Analyse von Kymographen, um eine Population dynamischer, EB1-GFP bezeichneter "Pionier-MTs" zu charakterisieren, die sich von einer breiteren Population stabilisierter MTs^{zu unterscheiden schienen 35}. Dieser Mangel an Forschung zur präsynaptischen MT-Dynamik könnte zumindest teilweise auf die Anatomie zurückzuführen sein: Während es aufgrund ihrer Nähe zur Kutikula der Larve relativ einfach ist, Bilder von Dendriten zu erhalten, werden NMJs durch andere Gewebe behindert, was es schwierig macht, Bilder mit ausreichendem Signal-Rausch-Verhältnis für die Analyse auf Partikelebene aufzunehmen. Nichtsdestotrotz dürfte die Überbrückung dieser Lücke zwischen dem Verständnis prä- und postsynaptischer MTs für die synaptische Morphogenese und Stabilisierung³⁶ sowie ihrer Verbindungen zu neurologischen Entwicklungsstörungen und neurodegenerativen Störungen³⁷ zu unschätzbaren Erkenntnissen führen.

Eine zusätzliche Herausforderung für die Analyse der Dynamik von in vivo MT im Allgemeinen im Gegensatz zur in vitro oder ex vivo Analyse sind die begrenzten automatisierten Softwaretools, die Dynamikparameter aus in vivo-Daten extrahieren können. Derzeit ist plusTipTracker^38,39 eine der beliebtesten und leistungsfähigsten Techniken zur Analyse von +TIP-gekennzeichneten MT plus-Enden, eine MATLAB-basierte Software, die die automatisierte Verfolgung und Analyse mehrerer Dynamikparameter ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass plusTipTracker nicht nur das Wachstum von MT, sondern auch Schwund und Rettungen misst: Während +TIP-Labels wie EB1-GFP nur mit wachsenden Pluspunkten in Verbindung gebracht werden, kann plusTipTracker algorithmisch auf Schrumpfungsraten und Rettungsereignisse schließen. Obwohl plusTripTracker jedoch sehr erfolgreich in vielen Kontexten eingesetzt wurde, einschließlich früherer multiparametrischer Analysen der ex vivo MT-Dynamik in Drosophila S2-Zellen⁴⁰, ist plusTipTracker aufgrund ihres geringeren Signal-Rausch-Verhältnisses nicht optimal für die Analyse von in vivo-Daten. Infolgedessen stützten sich In-vivo-Studien der Plus-End-Dynamik an den Dendriten 22,23,24,25,26,27 und am NMJ³⁵ von Drosophila auf die manuelle Generierung und Analyse von Kymographen unter Verwendung von Software wie ImageJ 41 oder auf halbautomatische Strategien, die zahlreiche Human-in-the-Loop-Komponenten einbeziehen.

Diese Studie stellt einen experimentellen und analytischen Arbeitsablauf vor, der den experimentellen und analytischen Aufwand reduziert, der für die Durchführung einer nicht-invasiven Analyse der präsynaptischen MT-Dynamik auf Polymerebene sowohl in sensorischen Dendriten als auch im motorischen Axonterminal von Drosophila-Larven im dritten Stadium erforderlich ist. Das Protokoll verwendet immobilisierte, intakte Larven und vermeidet daher Verletzungen, von denen bekannt ist, dass sie Stressreaktionen auslösen, sowie andere nicht-physiologische Bedingungen, die die Dynamik der In-vivo-MT stören könnten. Um dynamische MT-Plus-Enden zu markieren, wird EB1-GFP panneuronal exprimiert, wobei das Gal4/UAS-System ⁴² verwendet wird, was die Visualisierung von MTs sowohl an Dendriten als auch an NMJ mit einem einzigen Treiber ermöglicht. Während einige frühe Schritte unweigerlich der menschlichen Entscheidungsfindung unterliegen, wie z. B. die Auswahl von Tierproben und die Identifizierung der abzubildenden Regionen, sind die Schritte nach der Datenerfassung weitgehend automatisiert. Entscheidend war, dass die Optimierung einer neuen Software eine automatisierte, unvoreingenommene Analyse mit minimalem menschlichem Aufwand ermöglichte. Während andere Partikelverfolgungsmethoden verfügbar sind 43,44,45, verwendet diese Studie eine proprietäre Software, da sie algorithmisch gut geeignet war, um die besonderen Herausforderungen dieses speziellen Datensatzes zu bewältigen. Die Software steht den Anwendern nun für eine Vielzahl von Anwendungen zur Verfügung. Insbesondere ist die Verwendung der kohärenzsteigernden Diffusionsfilterung⁴⁶ integraler Bestandteil der automatisierten Segmentierung und Hintergrundentfernung, und benutzerdefinierte Algorithmen werden speziell zur Automatisierung der Partikelerkennung und -verfolgung implementiert. Diese Strategie könnte das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis, das den Daten in dieser Studie innewohnt, sowie andere Herausforderungen, wie z. B. die Bewegung von EB1-GFP-Kometen durch verschiedene Fokusebenen, effektiv bewältigen. Obwohl es nicht möglich ist, die Leistung dieser Software im Vergleich zu allen anderen Partikelanalysesoftware erschöpfend zu testen, entsprach die Leistung der vorliegenden Strategie der Standardleistung des Menschen oder näherte sich ihr an. Darüber hinaus gibt es nach Kenntnis der Autoren keine andere Software, die speziell mit In-vivo-Daten von sensorischen Dendriten und dem präsynaptischen Terminal trainiert wurde. Angesichts der Tatsache, dass die Leistung von Bildanalysealgorithmen oft sehr spezifisch für die Daten ist, für die sie entwickelt wurden, und dass verallgemeinerte Computer Vision noch nicht möglich ist, wird erwartet, dass das Training der beschriebenen Software auf die spezifischen in vivo-Daten von Interesse der algorithmisch einwandfreiste Ansatz ist.

Angesichts der umfangreichen Arbeiten an den dendritischen MTs 22,23,24,25,26,27 sowie der gleichbleibenden Qualität der Daten, die mit diesem System erfasst werden können, wurde die Bildaufnahme- und Softwareanalysestrategie zunächst an sensorischen Dendriten von Drosophila validiert. Wichtig ist, dass in Dendriten festgestellt wurde, dass die Verwendung unterschiedlicher neuronaler Gal4-Treiber, selbst bei ansonsten identischen Wildtyp-Hintergründen, zu signifikanten Unterschieden in der EB1-GFP-Dynamik aufgrund von Unterschieden im genetischen Hintergrund führt, was die Bedeutung der Verwendung eines einzigen Gal4-Treibers für konsistente Ergebnisse unterstreicht. Diese Strategie wurde als nächstes für die multiparametrische Analyse der EB1-GFP-Dynamik am präsynaptischen Ende des NMJ verwendet. Um den Untersuchungswert dieser Methode weiter zu veranschaulichen, wurde diese Bildgebungs- und Softwarestrategie verwendet, um sowohl die prä- als auch die postsynaptische EB1-GFP-Dynamik nach dem Knockdown von dTACC, dem Drosophila-Homolog der hochkonservierten TAC-Familie (Transforming Acidic Coiled Coil)^47,48, zu bewerten. Frühere Arbeiten an Drosophila S2-Zellen⁴⁰ sowie Arbeiten von Lowery und Kollegen am Xenopus-Wachstumskegel 49,50,51 haben gezeigt, dass Mitglieder der TAC-Familie die MT plus-End-Dynamik regulieren. Darüber hinaus zeigten kürzlich berichtete Erkenntnisse aus konfokalen und superauflösenden Immunfluoreszenz-Bildgebungen, dass dTACC ein Schlüsselregulator präsynaptischer MTs während der neuronalen Morphogenese^{ist 52}, was die Frage aufwirft, ob dTACC die Dynamik von Live-MTs reguliert. Dieser Bericht demonstriert eine Methode, mit der tatsächlich Unterschiede im Verhalten von Live-MT beim dTAC-Knockdown erkannt werden können. Daher stellt diese Studie eine in vivo Methode vor, die Schlüsselregulatoren der MT-Dynamik innerhalb des sich entwickelnden Neurons, insbesondere im präsynaptischen Kompartiment, effektiv identifizieren und charakterisieren kann.

Protokoll

1. Erzeugung von Drosophila-Exemplaren

1. Wählen Sie einen geeigneten MT plus-End-Markierer aus. In dieser Studie wurde GFP-markiertes EB1 verwendet, ein gut charakterisierter Plus-End-Marker mit einem starken, klaren Signal^11,12. Zu den Alternativen gehören andere +TIPs wie EB3^10,13, CLASP/Orbit⁵³ und CLIP-170⁵⁴.
2. Gewinnung oder Generierung von Fliegen mit dem MT-Marker unter Kontrolle eines UAS-Promotors (z. B. UAS-EB1-GFP).
3. Wählen Sie den passenden gewebespezifischen Gal4-Treiber. In dieser Studie wurde der panneuronale Treiber elaV-Gal4^58,59 verwendet, um die Expression sowohl in sensorischen Dendriten als auch am NMJ und 221-Gal4^60,61 für die Dendriten-spezifische Expression zu steuern.
4. Fliegen mit Standard-Fliegenhaltungstechniken^{aufziehen 55,56}. Es wird empfohlen, Fliegen in befeuchteten Inkubatoren bei 25 °C zu halten, um eine optimale Gal4/UAS-Expression zu gewährleisten.
5. Unter Verwendung genetischer Standardtechniken^{für Fliegen 55,56} werden Kreuzungen durchgeführt, um Fliegen zu erzeugen, die den MT plus-End-Marker in den gewünschten Zellen/Geweben exprimieren.
   HINWEIS: Für jede Kombination aus Gal4-Treiber und -Transgen sollte das Versuchsdesign Proof-of-Concept- und Validierungsexperimente umfassen, um das System zu charakterisieren und Artefakte durch Überexpression zu vermeiden.

2. Einrichtung der Ausrüstung

1. Richten Sie einen Arbeitsplatz ein, einschließlich der Fliegen, der Anästhesiereagenzien, der Objektträgerbaumaterialien, des Stereomikroskops und der Beleuchtungsquelle, in der Nähe des konfokalen Mikroskops (d. h. im selben Raum), um die Zeit zwischen Probenvorbereitung und Bildgebung zu minimieren und die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Larven zu verlängern.
2. Bereiten Sie das Anästhetikum vor, indem Sie eine 9%ige Chloroformmischung (0,1 mL Chloroform und 1,0 mL Halogenkohlenwasserstofföl) in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Um eine Trennung zu vermeiden, mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen umdrehen, bevor Sie jeden neuen Objektträger vorbereiten.
3. Objektträger vorbereiten: Schneiden Sie vier Streifen doppelseitiges Klebeband (~15 mm breit) ab. Richten Sie zwei der Teile auf der Glasschiene aus und lassen Sie zwischen den Streifen einen Abstand von ~5 mm. Schichten Sie die restlichen zwei Stücke auf die ersten beiden, um die Dicke des Klebebandes zu verdoppeln (Abbildung 1C).
4. Geben Sie einen großen Tropfen (~100 μL) Chloroform/Öl-Gemisch in den 5-mm-Abstand zwischen den Klebebandstücken auf den Objektträger (Abbildung 1C).

3. Vorbereitung der Larvenproben für die Bildgebung

1. Füllen Sie einen Behälter (z.B. eine 6-Well-Platte) mit 1x PBS.
2. Sammeln Sie 3. Larven aus dem Fliegenfläschchen mit einer Pinzette oder einem ähnlichen Instrument. Identifizieren Sie die Larven im richtigen Stadium anhand ihres Krabbelverhaltens und des Vorhandenseins von 9–12 markanten, gezackten Maulhaken. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Larven zu stadien (Abbildung 1D).
3. Legen Sie eine Larve in das PBS und bewegen Sie sie vorsichtig, um Speisereste oder andere Ablagerungen abzuwaschen. Trocknen Sie die Larve vorsichtig auf einem zarten Tuch.
4. Betäuben Sie die Larve, indem Sie sie in einen Chloroform-/Öltropfen auf dem Objektträger aus Abschnitt 2 legen (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Die dorsale/ventrale Ausrichtung der Larve ist nicht kritisch, da sowohl sensorische als auch motorische Neuronen durch die durchscheinende Kutikula hindurch nachgewiesen werden können, indem der Mikroskoptisch auf die richtige Fokusebene eingestellt wird, unabhängig von der Ausrichtung der Probe.
5. Legen Sie ein Deckglas #1,5 darauf. Kleben Sie das Deckglas mit leichtem Druck auf das Klebeband und fixieren Sie so die Larve, ohne sie zu beschädigen (Abbildung 1C).
6. Versiegeln Sie die Kammer mit Vaseline oder Nagellack.

4. Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von lebenden Proben

1. Bereiten Sie das konfokale Mikroskop und die 60-fach-Objektivlinse mit Ölimmersion vor. Legen Sie die Probe auf den Tisch (Abbildung 1A,B).
2. Verwenden Sie die Erfassungssoftware, um Experimente zu konfigurieren.
   HINWEIS: Für diese Studie wurde jede Bildserie in einer einzigen Fokusebene und nicht in einem Z-Stapel aufgenommen.
   1. Legen Sie die Zeitrafferdauer auf 30 s in einem Intervall von 2 s fest, also insgesamt 16 Frames.
   2. Stellen Sie die Laserbelichtung und -intensität ein, um ein ausreichendes Signal zu gewährleisten und gleichzeitig Sättigung und Photobleichung zu vermeiden.
   3. Für die EB1-GFP-Bildgebung wurde der 488-nm-Laser auf eine Belichtungszeit von 100 ms und eine Intensität von 30 % eingestellt. Diese Werte können je nach Verwendung dieses Protokolls variieren und sollten empirisch modifiziert werden.
3. Verwenden Sie die Okulare des Mikroskops, um die Larve in weitfeldgrüner Beleuchtung zu finden. Finden Sie die Dendriten oder NMJs, indem Sie das Stadium langsam anpassen. Setzen Sie die Larve nicht länger als nötig einer Beleuchtung (Weitfeld oder Konfokal) aus.
   1. Dendriten erscheinen als dünne, hellgrüne Nervennetze, die leicht von dicken langen Axonbündeln zu unterscheiden sind (Abbildung 1E).
   2. NMJs erscheinen als Gruppen von hellgrünen einzelnen Boutons mit einem Durchmesser von etwa 5 μm an den Enden dicker langer Axonbündel, die vom Nervenstrang abweichen (Abbildung 1F).
4. Mit dem Live-Kamera-Feed können Sie mit einer 488-nm-Beleuchtung schnell auf den gewünschten Bereich fokussieren. Stoppen Sie die Beleuchtung sofort, sobald der richtige Fokus gefunden wurde, um Phototoxizität zu vermeiden.
5. Starten Sie die Bildaufnahme. EB1-Kometen sind als helle, bewegliche Punktuierte zu erkennen.
6. Weitere Informationen und Richtlinien zur Fluoreszenz-Live-Bildgebung finden Sie in den zuvor veröffentlichten Protokollen⁵⁷.

5. Softwarebasierte Bildverarbeitung und -analyse

1. Analysieren Sie jede Videodatei einzeln. Wählen Sie in der Software (Benutzeroberfläche in Abbildung 2 dargestellt) Datei | Importieren | Bildsequenz und ziehen Sie TIF-Dateien in das angezeigte Feld. Zeigen Sie eine Vorschau des Videos an.
2. Passen Sie im Menü " Erkennungsparameter " die Softwareparameter an, um sicherzustellen, dass nur deutlich sichtbare Punkte erkannt werden und die Erkennung von unerwünschten Objekten vermieden wird. So führt beispielsweise die Reduzierung der Partikelintensität zu einer höheren Empfindlichkeit der Software gegenüber Punkten, erhöht jedoch das Potenzial für Fehlalarme. Die genauen Werte der Parameter variieren empirisch. Beschreibungen der Erkennungs- und Tracking-Parameter sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.
3. Wenden Sie das Rezept für die Neuron-Partikelverfolgung an, um das Bild mit der Schaltfläche Von Anfang an zu analysieren (blauer Pfeil, Abbildung 2B). Die Software gibt die Ergebnisse für die in Tabelle 1 aufgeführten Tracking-Parameter in der Ergebnistabelle aus (grüner Kasten, Abbildung 2B). Um die spätere Analyse und Interpretation zu erleichtern, können die Ergebnisse in einer Tabellenkalkulationssoftware gespeichert werden, indem die Exportfunktion im Abschnitt "Ergebnistabelle " verwendet wird.
4. Navigieren Sie mit dem Cursor zu puncta, das im vorherigen Schritt erkannt wurde , und klicken Sie mit der linken Maustaste , um die Auswahl zu aktivieren oder aufzuheben. Mehrere Punkte können gleichzeitig mit Strg + Linksklick ausgewählt werden.
   HINWEIS: Abhängig von den Projektzielen und Anwendungen können zusätzliche Heuristiken verwendet werden, um die Interpunktionen zu filtern. So können z.B. Punctae mit einer Lebensdauer von weniger als 8–10 s (4–5 Frames) weggelassen werden, weil sie keine ausreichenden Informationen über das gesamte Wachstumsereignis liefern. Der Bedarf an solchen Heuristiken wird empirisch unterschiedlich sein. Weitere Details zur Funktionalität der Software erhalten Sie auf Anfrage von den Autoren.

Ergebnisse

Fliegen wurden aus stabilen Stämmen gezüchtet, die das UAS-EB1-GFP-Transgen konstitutiv entweder panneuronal (elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP^)58,59 oder in sensorischen Neuronen (221-Gal4; UAS-EB1-GFP)^60,61. EB1 wurde für diese Studie ausgewählt, weil es spezifisch an den Wachstumsenden lokalisiert und sofort nach Pause und Schrumpfung dissoziiert^14,15

Diskussion

In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Durchführung einer nicht-invasiven intravitalen Bildgebung der MT-Dynamik in den Dendriten und am NMJ während der Entwicklung diskutiert. Während der Versuchsschritte ist menschlicher Input erforderlich, z. B. bei der Auswahl der Tiere für die Abbildung, und kann zu Verzerrungen im Datenerfassungsprozess führen, die nicht vernünftig beseitigt werden können. Daher besteht ein Hauptziel des Protokolls darin, Verzerrungen so weit wie möglich zu minim...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	21008-959	Probenvorbereitung
1000 µ L TipOne Pipettenspitzen	USA Scientific	1111-2721	Probenvorbereitung
200 & Mikro; L TipOne Pipettenspitzen	USA Scientific	1120-8710	Probenvorbereitung
221-Gal4 fliegt	Bloomington Drosophila Stock Center (US)	26259	Drosophila genetics/kreuzungen
60x Objektiv	Nikon	Plan Apo 60x Öl	Bilderfassung
6-Well-Platte	BD Falcon	353224	Probenvorbereitung
Agar	MoorAgar	41084	Drosophila-Nahrung
Aivia	DRVision LLC		Optimiert im Rahmen dieser Studie
Chloroform (stabilisiert mit Amylenen)	Sigma-Aldrich	C2432	Probenvorbereitung
CO2-Blaspistole (für die Auswahl von Fliegen für Kreuzungen)	Genesee	54-104	Drosophila Genetik/Kreuzungen
CO2 Bubbler (für die Auswahl von Fliegen für Kreuzungen)	Genesee	59-180	Drosophila Genetik/Kreuzungen
Gekühlte CCD-Kamera	Hamamatsu	ORCA-R2	Bilderfassung
Maismehl	Genesee	62-101	Drosophila-Lebensmittel
Destilliertes Wasser			Drosophila-Lebensmittel
Doppelseitiges Klebeband	Scotch		Probenvorbereitung
Drosophila-Fläschchen	Genesee	32-109	Drosophila-Lebensmittel
Droso-Plugs (Schaumstoffstopfen für Fläschchen)	Genesee	59-200	Drosophila food
Dumont #5 Biologie Inox Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Probenvorbereitung
elaV-Gal4; UAS-EB1-GFP; UAS-Dcr2 Fliegen	Gift of Melissa Rolls (Penn State University)	N/A	Drosophila Genetik/Kreuzungen
Ethanol (95%)	VWR	75811-022	Drosophila food
Faseroptische Beleuchtung/Lichtquelle für Stereomikroskop	Nikon	NI-150	Probenvorbereitung
Flypad (zur Auswahl von Fliegen für Kreuzungen)	Genesee	59-172	Drosophila Genetik/Kreuzungen
Forma Klimakammer/Inkubator	ThermoFisher	3940	Drosophila Genetik/Kreuzungen
Halogenkohlenwasserstofföl 700	Sigma-Aldrich	H8898	Probenvorbereitung
Immersionsöl	Nikon	MXA22168	Bilderfassung
Kimwipe Delicate Wipes	Fisher Scientific	34120	Probenvorbereitung
Laser Merge Module	Spectral Angewandte Forschung	LMM-5	Bildaufnahme
Lichtquelle für konfokale	Lumencor	SOLA 54-10021	Bildaufnahme
MetaMorph Mikroskopie Automatisierung & Bildanalyse-Software	Molekulare Bauelemente		Bildaufnahme
Micro Cover Glasses, quadratisch, Nr. 1 1/2 (#1.5)	VWR	48366-205	Probenvorbereitung
Motorisiertes inverses Mikroskop mit Perfect Focus System	Nikon	TI-ND6-PFS-S	Bildaufnahme
Motorisierter Tisch und Verschlüsse	Prior	Proscan III	Bilderfassung
Mehrzweckschere	Scotch	MMM1428	Probenvorbereitung
Nagellack	Sally Hansen	784179032016 074170382839	Probenvorbereitung
Optischer Filter	Chroma	ET480/40m	Bilderfassung
P1000 Pipetman	Gilson	F123602	Probenvorbereitung
P200 Pipetman	Gilson	F123601	Probenvorbereitung
PBS (10X) ph 7.4	ThermoFisher	70011044	Probenvorbereitung
Propionsäure	Fisher	A258-500	Drosophila Lebensmittel
Konfokale Spinning-Disk-Scannereinheit	Yokagawa	CSU-X1	Bildaufnahme
Stereomikroskop	Nikon	SMZ800N	Probenvorbereitung
Zucker (Saccharose)	Genesee	62-112	Drosophila food
Superfrost Slide	VWR	48311-600	Probenvorbereitung
Tegosept	Genesee	20-258	Drosophila food
UAS-dtacc-RNAi fliegt	Wien Drosophila Resource Center (Wien, Österreich)	VDRC-101439	Drosophila Genetik/Kreuzungen
Vaseline Vaseline	WB Mason	DVOCB311003	Probenvorbereitung
Winsor & Newton Brush Regency Gold 520, Größe 0	Klammern	5012000	Drosophila Genetik/Kreuzungen
Hefe	VWR	Torula Hefe IC90308580	Drosophila Lebensmittel
Yokogawa dichroitischer Strahlteiler Semrock		Di01-T405/488/568/647-13x15x0,5