Methodenartikel

Isolierung von Geweben des Zentralnervensystems und zugehörigen Hirnhäuten für die nachgeschaltete Analyse von Immunzellen

DOI:

10.3791/61166

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19. Mai 2020

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1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Arbeit werden zwei optimierte Protokolle für die Untersuchung von residenten und peripher abgeleiteten Immunzellen innerhalb des zentralen Nervensystems, einschließlich des Gehirns, des Rückenmarks und der Hirnhäute, vorgestellt. Jedes dieser Protokolle trägt dazu bei, die Funktion und Zusammensetzung der Zellen zu bestimmen, die diese Kompartimente unter stationären und entzündlichen Bedingungen besetzen.

Zusammenfassung

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Das zentrale Nervensystem (ZNS) besteht aus Gehirn und Rückenmark und wird von den Hirnhäuten umhüllt, membranösen Schichten, die als Barriere zwischen der Peripherie und dem ZNS dienen. Das ZNS ist eine immunologisch spezialisierte Stelle, und unter stationären Bedingungen ist das Immunprivileg im ZNS-Parenchym am deutlichsten. Im Gegensatz dazu beherbergen die Hirnhäute eine Vielzahl von residenten Zellen, darunter angeborene und adaptive Immunzellen. Bei entzündlichen Erkrankungen, die durch ZNS-Verletzungen, Autoimmunitäten, Infektionen oder sogar Neurodegeneration ausgelöst werden, können peripher gewonnene Immunzellen in das Parenchym eindringen und sich in den Hirnhäuten einnisten. Es wird angenommen, dass diese Zellen während der Pathogenese der ZNS-Erkrankung sowohl nützliche als auch schädliche Wirkungen ausüben. Trotz dieses Wissens werden die Hirnhäute bei der Analyse des ZNS-Kompartiments oft übersehen, da herkömmliche ZNS-Gewebeextraktionsmethoden die Hirnhautschichten auslassen. Dieses Protokoll stellt zwei unterschiedliche Methoden für die schnelle Isolierung von murinem ZNS-Gewebe (d. h. Gehirn, Rückenmark und Hirnhäute) vor, die für die nachgeschaltete Analyse mittels Einzelzelltechniken, Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierungsmethoden geeignet sind. Die beschriebenen Methoden bieten eine umfassende Analyse von ZNS-Geweben, ideal für die Beurteilung des Phänotyps, der Funktion und der Lokalisation von Zellen, die das ZNS-Kompartiment unter homöostatischen Bedingungen und während der Krankheitspathogenese besetzen.

Einleitung

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Das Zentralnervensystem (ZNS) ist ein immunologisch spezialisiertes Zentrum. Das ZNS-Parenchym, mit Ausnahme des Liquorraums, der Hirnhäute und des Gefäßsystems, wird klassischerweise als immunprivilegierte Stelle angesehen 1,2,3,4,5 und ist unter homöostatischen Bedingungen relativ frei von Immunzellen 2,6,7. Im Gegensatz dazu sind die Hirnhäute, bestehend aus Dura-, Arachnoidal- und Pia-Schichten, entscheidende B....

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Protokoll

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Für die gesamte Tierarbeit werden Protokolle verwendet, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Geisel School of Medicine in Dartmouth überprüft und genehmigt wurden.

1. Aufbereitung von Hirn- und Rückenmarksproben zur Entkalkung

  1. Isolierung von Gehirn- und Rückenmarksproben
    1. Euthanasie der Maus durch CO2 - Inhalation. Stellen Sie sicher, dass die CO2 - Durchflussmenge 10 % bis 30 % des Käfigvolumens pro Minute verdrängt.
    2. Heben Sie mit einer Pinzette den Processus xiphoideus an und schneiden Sie die Bauchdecke seitlich direkt unter dem Brustkorb mi....

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Ergebnisse

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Dieses repräsentative Experiment zielte darauf ab, B- und T-Zellen zu quantifizieren und die Lokalisation von B- und T-Zellen in den meningealen und parenchymalen ZNS-Kompartimenten unter homöostatischen Bedingungen sowie in einem murinen progredienten MS-Modell (d.h. TMEV-IDD) zu beschreiben. TMEV-IDD wurde in 5 Wochen alten weiblichen SJL-Mäusen durch intrakranielle Infektion mit 5 x 106 plaquebildenden Einheiten (PFU) von TMEV BeAn induziert, wie zuvor beschrieben29.

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Diskussion

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Methoden zur Bewertung der zellulären Zusammensetzung im ZNS-Kompartiment während der Homöostase und Krankheit sind essentiell für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Zustände des ZNS. Obwohl sie als wichtige Barriere im ZNS dienen und eine Vielzahl von Immunzellen beherbergen, werden die Hirnhäute oft von der Analyse ausgeschlossen, da viele herkömmliche Gewebeentnahmemethoden für Gehirn und Rückenmark die Entnahme dieser Membranen nicht zulassen. Diese Auslassung ist eine entscheidende Einschränkung .......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Die Autoren danken den Mitarbeitern des Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) in Dartmouth für die fachkundige Betreuung der Mäuse, die für diese Studien verwendet wurden. Der Bornstein Forschungsfonds förderte diese Forschung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AluminiumfoliebeliebigN/A
Rinderserum AlbuminThermoFisher Scientific37002D
ZentrifugeBeckman CoulterAllegra X-12R Zentrifuge
Kollagenase IWorthingtonLS004196
konisches Röhrchen, 15 mLVWR525-1069
konisches Röhrchen, 50 mLVWR89039-658
DeckglasHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Gebogene PinzetteFine Science Tools11003-14
Einweg-Polystyrolröhrchen, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
Einweg-SkalpellFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
TrockeneisAirgasN/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA Dinatriumsalz DihydratAmresco0105-500g
Ethanol, 100%anyN/A
Fötales Rinderserum (FBS)HyklonSH30910.03
Filteroberrohr, 5 mLVWR352235
Fixierbarer Viabilitätsfleck 780Becton Dickinson565388
DurchflusszytometerBeckman CoulterGallios
GlukoseFisher ChemicalD16-500
Ziege Anti-Maus IgG (488 Konjugat)Jackson immunoresearch115-546-146
Ziege Anti-Maus IgG (594 Konjugat)Jackson Immunforschung115-586-146
Ziege Anti-Kaninchen 488Jackson Immunforschung111-545-144
Ziege Anti-Ratte 594Jackson Immunforschung112-585-167
Ziege Anti-Ratte 650Jackson Immunforschung112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
HämazytometerAndwin Scientific02-671-51B
HemostatFine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chemikalieBP366-500
KH2PO4 (wasserfrei)Sigma AldrichP5655-100G
Flüssiger StickstoffAirgasN/A
Maus FC-Block (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (wasserfrei)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Nadel, 25 gaugeBecton Dickinson305122
Normales MausserumThermoFisher Scientific31881
Nylon-NetzsiebVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldehyd, 20%Elektronenmikroskopie Sciences15713-SVerdünnt auf 4% mit 1 x PBS
Pasteur-Pipette, 9 Zoll, unpluggedFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Ratte Anti-Maus CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Ratte Anti-Maus CD19Becton Dickinson562329
Percoll DichtegradientenmedienGE healthcare17-0891-01
PerCP-CY5.5 Ratte Anti-Maus CD45Becton Dickinson550994
Petrischale, 100 mmVWR353003
pH-MessgerätFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipette 200 & Mikro; lGilsonFA10005M
Pipettenspitzen, 1 mLUSA Scientific1111-2831
Pipettenspitzen, 200 & Mikro; lUSA Scientific1111-1816
Pipette, 1 mLGilsonFA10006M
Prolong Diamond Eindeckmittel mit DAPIThermoFisher ScientificP36962
Gereinigtes Ratten-Anti-Maus-CD16/CD32Becton Dickinson553141
Kaninchen Anti-Maus-CD3 (SP7-Klon)Abcamab16669
Kaninchen-Anti-Maus-LamininAbcamab11575
Ratten-Anti-Maus ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
Serologische Pipette, 1 mLVWR357521
Serologische Pipette, 10 mLVWR357551
Serologische Pipette, 5 mLVWR357543
NatriumhydroxidFisher ScientificS318-100
SaccharoseFisher chemicalS5-500
Chirurgische SchereFine Science Tools14001-16
Chirurgische Schere, extra feinRobozRS-5882
Spritze, 10 mLBecton Dickinson302995
Spritze, 5mL Becton Dickinson309646
TrypanblauGibco15250-061
VakuumfiltersystemMillipore20207749
IsolierflascheThomas Scientific5340-2L
Vakuum-Inline-FilterPall Corporation4402
VakuumleitungCole PalmerEW-06414-20
WasserbadThermoFisher ScientificVersa Bad

Referenzen

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  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492(2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Review....

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Schlagwörter

Isolierung der MeningenExtraktion von HirngewebeExtraktion des R ckenmarksEinzelzellanalyseimmunhistochemische MethodenIn situ HybridisierungKollagenase BehandlungDichtegradientenzentrifugationCD45 Gating

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