Blockierung des Lymphflusses durch Suieren von afferenten Lymphgefäßen bei Mäusen

Die räumliche Organisation des Lymphsystems bietet strukturelle und funktionelle Unterstützung, um extrazelluläre Flüssigkeit effizient zu entfernen und Antigene und Antigen-präsentierende Zellen (APCs) zu den entwässernden LNs zu transportieren. Die ersten lymphatischen Gefäße (auch Lymphkapillaren genannt) sind aufgrund ihrer diskontinuierlichen interzellulären Verbindungen, die die effektive Sammlung von Flüssigkeiten, Zellen und anderen Materialien aus den umliegenden extrazellulären^Räumen1 erleichtern, sehr durchlässig. Die ersten lymphatischen Gefäße verschmelzen zu sammelnden Lymphgefäßen, die enge interzelluläre Verbindungen, eine kontinuierliche Kellermembran und lymphatische Muskelabdeckung haben. Das Sammeln von Lymphgefäßen ist verantwortlich für den Transport der gesammelten Lymphe zu den entwässernden LNs und schließlich die Rückkehr der Lymphe in den Kreislauf^2,3. Die sammelnden Lymphgefäße, die Lymphe in die entwässernden LN treiben, sind die afferent lymphatischen Gefäße^4,5,6,7. Die Behinderung der affektiven Lymphgefäße kann den Lymphfluss in die LNs blockieren, was eine nützliche Technik bei der Untersuchung der Funktion des Lymphflusses ist.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Lymphfluss eine wichtige Rolle beim Transport von Antigenen und APCs spielt, sowie bei der Aufrechterhaltung der LN-Homöostase. Es ist allgemein bekannt, dass gewebeabgeleitete APCs, typischerweise aktivierte migrierende dendritische Zellen (DCs), durch die affemenden Lymphgefäße zu den LN reisen, um T-Zellen zu aktivieren⁸. Die Idee, dass Freiform-Antigene, wie Mikroben oder lösliche Antigene, passiv mit Lymphe zu den LN fließen, um LN-residente APCs zu aktivieren, hat sich in den letzten zehn Jahren^{durchgesetzt 9,10,11,12}. Freiform-Antigene, die mit Lymphe reisen, dauern Minuten nach der Infektion, um zu den LN zu gelangen, und die LN-Resident-Zellaktivierung kann innerhalb von 20 min nach der Stimulation auftreten. Dies ist viel schneller als die Aktivierung von migrierenden DCs, die mehr als 8 h benötigt, um in die entwässernde LN⁹einzusteigen. Neben dem Transport von Antigenen zur Einleitung des Immunschutzes trägt die Lymphe auch Zytokine und DCs zu den LN, um ihre Mikroumgebung zu erhalten und die Immunzellhomöostase^13,14zu unterstützen. Zuvor zeigte die Blockierung des Lymphflusses durch Das Aifaktum der affepfenden Lymphgefäße, dass Lymphe erforderlich ist, um den HEV-Phänotyp aufrechtzuerhalten, der zur Unterstützung der homöostatischen T-Zelle und der B-Zelle erforderlich ist, die bis zum LN^15,16,17. CCL21 ist ein kritisches Chemokin, das die Dc- und T-Zellenpositionierung im LN^8,18leitet. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die CCL21-Expression im LN und unterbricht möglicherweise die Positionierung und/oder Interaktion von DC- und T-Zellen im LN¹⁹. So kann die Blockierung des Lymphflusses den Antigen-/DC-Zugang zu den entwässernden LN direkt oder indirekt abschaffen, indem die LN-Mikroumgebung gestört wird, die die Immunantworten in der LN reguliert. Um die Funktion des Lymphflusses besser untersuchen zu können, wird ein experimentelles Protokoll vorgestellt (Abbildung 1), um den Lymphfluss bei Mäusen zu blockieren, indem die affemenden Lymphgefäße vom Fußpad zum pLN durchnäht werden. Diese Methode kann eine wichtige Technik für zukünftige Studien über die lymphatische Funktion bei gesunden und kranken Bedingungen sein.

Alle Tierarbeit muss vom Institutionellen und staatlichen Ethik- und Tierschutzausschuss genehmigt werden.  Dies ist eine Nicht-Überlebens-Operation.

1. Herstellung von Materialien

1. Bereiten Sie 100 ml 70% Ethanol vor, indem Sie 70 ml 100% Ethanol mit 30 ml sterilem Wasser mischen. Autoclave alle chirurgischen Werkzeuge vor der Operation und halten Sie die Werkzeuge in 70% Ethanol vor und während der Operation, um die Sterilisation aufrechtzuerhalten.
2. Bereiten Sie ein Injektionsgerät vor.
   1. Schneiden Sie 30 cm Polyethylenschläuche (0,28 mm Durchmesser) ab. Schließen Sie die Spitze einer 30 G x 1/2 Nadel (Nadel A) an ein Ende der Polyethylenschläuche an. Lösen Sie vorsichtig eine weitere 30 G x 1/2 Nadel (Nadel B) und verbinden Sie die gebrochene Seite mit dem anderen Ende der Polyethylenschläuche.
   2. Nadel A an einer 1 ml Tuberkulinspritze befestigen.
      HINWEIS: Für diese Polyethylenschläuche entspricht 1,6 cm Flüssigkeit in den Schläuchen 1 l²⁰.
3. Bereiten Sie ein 10:1 Ketamin/Xylazin-Gemisch (10 mg/ml Ketamin und 1 mg/ml Xylazin) in Saline (bakteriostatisch 0,9% [w/v] Natriumchlorid) vor. Bereiten Sie die Lösung vor Gebrauch frisch vor.

2. Vorbereitung des Tieres auf die Operation

HINWEIS: Verwenden Sie Mäuse im Alter von 6 bis 10 Wochen. Sowohl weibliche als auch männliche Mäuse können verwendet werden. In dieser Studie wurden 6-10 Wochen alte, C57BL/6 weibliche Mäuse verwendet. Diese Methode kann für andere Mäusestämme angepasst werden.

1. Anästhesisieren Sie die Maus, indem Sie 250 l des Ketamin/Xylazin-Gemischs intraperitoneal injizieren. Warten Sie, bis die Maus vollständig eingeschlafen ist. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht auf eine Zehenklemme reagiert, um die vollständige Anästhesisierung zu erkennen.
2. Rasieren Sie Fell um die Beine mit Haarschneidern.
3. Tragen Sie die Enthaarungscreme um das Bein auf und warten Sie 5 min. Das Restfell und die Enthaarungscreme mit einem feuchten Gewebe abwischen und das Bein mit sterilem Wasser reinigen. Sprühen Sie 70% Ethanol um das Bein, um den Operationsbereich zu sterilisieren. Das Ethanol ist auf die Einschnittstelle beschränkt.

3. Chirurgische Naht von afferenten Lymphgefäßen

HINWEIS: Das rechte Bein ist vernärmt, und das linke Bein wird als Scheinkontrolle verwendet. Das lymphatische Nahtprotokoll (Schritte 3.1-3.8) dauert 20 bis 30 min.

1. Halten Sie die Maus an einer anfälligen Position und fixieren Sie sie mit chirurgischem Klebeband, um den Operationsbereich am rechten Bein freizulegen.
2. Intradermally injizieren 5 l von 1% Evans blauer Farbstoff oder 9 cm der Flüssigkeit des Injektionsgeräts Schläuche in das Fußpolster. Massieren Sie das Fußpolster sanft, um Evans blau in die Lymphgefäße einzudringen.
   HINWEIS: Die Insulinspritze ist für die Injektion kleiner Volumen nicht einfach zu kontrollieren. Das Volumen kann mit dem Injektionsgerät genauer gesteuert werden. Lymphgefäße werden durch blauen Farbstoff unter der Haut visualisiert. Mit umfangreichem Training können beide afferenten Lymphgefäße mit bloßem Auge als transparente Gefäße im Fettgewebe gesehen werden, parallel zur Arterie Saphenous. Mit umfangreicher Schulung ist es möglich, die Gefäße zu befestigen, ohne Evans Blue Farbstoff zu injizieren, wenn es Bedenken hinsichtlich möglicher Störungen durch den Farbstoff gibt.
3. Wählen Sie unter einem Sezieren des Mikroskops eine Schnittstelle 5 mm vom unteren Rand der poplitealen Fossa aus. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 5 mm) in der Haut mit einer Schere. Dehnen Sie den Einschnitt mit feinen Operationszangen und setzen Sie die sammelnden Lymphgefäße aus (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Bei Bedarf kann ein kleines Hautfragment entfernt werden, um die Lymphgefäße freizulegen.
4. Identifizieren Sie beide affekenden Lymphgefäße, die zu den pLNs unter dem Sezieren des Mikroskops führen (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Es gibt zwei afferent lymphatische Gefäße vom Fußpolster bis zum pLN. Beide müssen vernässt werden, um den Lymphfluss vollständig zu blockieren.
5. Mit einem Nadelhalter die Nahtnadel (0,7 metrisch oder kleiner) vorsichtig zwischen das affetische Lymphgefäß und die Arterie Saphenous einlegen und die Nadel vorsichtig um das afferent Lymphgefäß herausziehen. Ziehen Sie die Nahtschnur vorsichtig und lassen Sie ca. 2 cm der Nahtschnur zurück. Verwenden Sie den Nadelhalter, um die Schnur fest zu binden, um ein Lymphgefäß mit einem Chirurgenknoten zu verbinden (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Das Gewebe unter dem Schnitt kann bei längerer Lufteinwirkung austrocknen. Wenn der Schnitt so klein wie möglich gemacht wird und die Naht schnell (d.h. innerhalb von 5 min) durchgeführt wird, wird verhindert, dass das Gewebe austrocknet. Bewahren Sie die Gewebefeuchtigkeit, indem Sie ein kleines Volumen von Saline mit einem Wattestäbchen auftragen.
6. Massieren Sie das Fußpolster vorsichtig, um sicherzustellen, dass kein Evans Blue Farbstoff die Nahtstelle passiert und dann die überschüssige Schnur mit der Schere schneidet.
7. Führen Sie die gleichen Nahtschritte (d. h. die Schritte 3.5 und 3.6) auf dem anderen affetienten Lymphgefäß aus (Abbildung 1D). Schließen Sie den Hautschnitt mit der gleichen Naht, die verwendet wurde, um die Gefäße in Schritt 3.5 zu nähen (Abbildung 1E).
8. Für die Scheinkontrolle, intradermally injizieren 5 l von 1% Evans blauen Farbstoff am linken Fußpad und massieren das Fußpolster, um die Lymphgefäße zu visualisieren. Öffnen Sie die Haut mit einer Exzision und schließen Sie dann die Wunde, ohne das Gefäß zu nähen (Abbildung 1F).
9. Optional die betätigten Mäuse für 2 x 4 h überwachen. Die Nahtseite des Beins sollte Ödeme mit Evans Blue zeigen, die auf den Oberschenkel ausgebreitet sind, während das Kontrollbein einen eingeschränkten Evans-Blaufarbstoff im Fußpolster zeigt. Wenn Mäuse erwachen, wird eine zusätzliche Ketamin/Xylazin-Mischung injiziert, um die Anästhesie bis zur Euthanasie zu erhalten.

4. Verfolgung des Lymphflusses

1. Unmittelbar nach der Operation injizieren Sie intradermally 10 l von 2% Fluorescein isothiocyanat (FITC) im Fußpolster sowohl der Kontrolle als auch des lymphatischen genähten Beins.
2. Euthanisieren Sie die Mäuse mit 400 L Ketamin/Xylazin-Mischung und führen Sie zervikale Dislokation durch, wenn die Mäuse vollständig anästhesisiert sind.
3. Sammeln Sie pLNs aus der poplitealen Fossa und entfernen Sie vorsichtig das perinodale Fettgewebe um die pLNs unter dem Dissektionsmikroskop bei 2, 6 und 12 h nach der FITC-Injektion.
4. Die pLNs mit der medullären Sinusfläche zur Seite des Kryomolds in optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung einbetten (Abbildung 1G,H).
5. Bereiten Sie 20 m gefrorene Abschnitte mit einem Kryotom vor.
6. Stellen Sie die Kryosektionen unter einem konfokalen Mikroskop ab, um die FITC-Verteilung zu bestimmen.

Lymphgefäßnaht wurde in früheren Studien15,16,17,19verwendet, wo es als wichtiges Werkzeug diente, um die Funktion des Lymphflusses zu untersuchen, bevor die Molekularbiologie der Lymphgefäße besser verstanden wurde. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die LN-Homöostase, was dazu führt, dass HEVs die kritische Genexpression verlieren, die für eine optimale Lymphozytenhoming an die LN15,16,17benötigt wird. Seitdem hat es weitere zwei Jahrzehnte gedauert, um zu zeigen, dass DCs, die mit Lymphe reisen, entscheidend für die Aufrechterhaltung des HEV-Genexpressionsprofils und der Lymphozyten sind, die auf die LN13angehören. Die Scherspannung durch den Lymphfluss ist entscheidend, um die Chemokinexpression in der LN zu stimulieren. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die Chemokin-CCL21-Expression in der LN19, die bei der Steuerung der DC- und T-Zellpositionierung in der LN von entscheidender Bedeutung ist. Daher kann ein unterbrochener Fluss die Positionierung von DCs und T-Zellen in der LN8,18beeinträchtigen.

Unmittelbar nach der Operation wurde ein kleiner fluoreszierender Tracer mit kleinem Molekulargewicht, FITC, verwendet, um den Lymphfluss zu verfolgen. FITC (10 l von 2% FITC) wurde intradermally in das Fußpolster der Scheinkontrolle und das lymphatische Nähte beinjiziert. Die Entwässerungs-pLNs wurden 2, 6 und 12 h später gesammelt. Die entwässernden pLNs wurden in OCT eingebettet, und 20 m gefrorene Abschnitte wurden vorbereitet. Konfokale Bilder zeigten eine erheblich reduzierte FITC-Akkumulation in den pLNs nach der Naht. Der Rest-FITC in den pLNs wurde bevorzugt in den LN-Sinus angesammelt (Abbildung 2).

Wie die Lymphe durch das Fettgewebe um die LN fließt, wurde mit lymphatischer Naht untersucht. Die afferenten Lymphgefäße, die zu den pLNs führten, wurden vernäht, um den Lymphfluss zu blockieren, und es wurde festgestellt, dass das perinodale Fettgewebe eine kleine Menge Lymphfluss unterstützen konnte, wenn Lymphgefäße blockiert wurden21. Der Lymphfluss durch das Fettgewebe zur Kapsel der LN wurde kartiert; es schien in die LN-Nebenhöhlen einzufließen. Im Laufe der Zeit können kleine Mengen Lymphe in die LN-Sinus geflossen sein (Abbildung 3).

Abbildung 1: Schritte der poplitealen LN (pLN) afferent lymphatischen Gefäßnaht. Kurz nachdem Mäuse mit einer Ketamin- und Xylazin-Mischung befeuchtet wurden, wurden ihre Beine rasiert und das Restfell durch eine Enthaarungscreme entfernt. Das rechte Bein wurde für Diebe verwendet und das linke Bein war die Scheinkontrolle. Die rechte Seite des Fußpolsters wurde intradermally injiziert mit 5 l von 1% Evans Blue Farbstoff in PBS hergestellt. (A) Durch sanfte Smassierung des Fußpolsters füllte Evans Blue Farbstoff die affemenden Lymphgefäße. (B) Ein kleiner Hautschnitt wurde 5 mm von der pLN entfernt durchgeführt, um die Lymphgefäße freizulegen, die durch die beiden weißen Pfeile angezeigt werden. (C,D) Beide afferenten Lymphgefäße wurden vernässt. (E) Die Hautexzision wurde durch Nähte geschlossen. (F) Das Kontrollbein erhielt Evans blaue Injektion, Hautexzision und Nahtverschluss, ohne die Lymphgefäße zu nähren. (G) Der Erfolg der Lymphflussblockade wurde durch Evans blauer Farbstoff angezeigt, der in die pLN des Kontrollbeins, aber nicht in das genähte Bein eintrat. (H,I) Die gesammelten pLNs wurden in OCT-Verbindung mit subkapsulärem Sinus (SCS) und medullärem Sinus (MS) zur Seite des Kryomolds vor dem Einfrieren von flüssigem Stickstoff eingebettet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: FITC-Verteilung in den entleerenden pLNs des Schein- oder Beins. Konfokale Bilder von pLNs, die 2, 6 und 12 h nach der FITC-Injektion gesammelt wurden, zeigten eine erheblich reduzierte FITC-Akkumulation in den pLNs nach der Naht. Der Rest-FITC in den pLNs wurde bevorzugt in den LN-Sinus gefunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: FITC-Verteilung im perinodalen Fettgewebe (PAT), um die entwässernden pLNs des Schein- oder Santenbeins. Konfokale Bilder der PAT und der LN zeigten, dass FITC in die PAT- und LN-Nebenhöhlen eindringt, aber nicht effektiv über die LN verteilt wurde, als Lymphgefäße blockiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.