Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

Zusammenfassung

Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Zusammenfassung

Die neuronale Differenzierung embryonaler Stammzellen (mESCs) ist ein mögliches Werkzeug zur Aufklärung der Schlüsselmechanismen der Neurogenese und potenzieller Hilfe in der regenerativen Medizin. Hier haben wir eine effiziente und kostengünstige Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs in vitroetabliert, mit der Strategie des kombinatorischen Screenings. Unter den hier definierten Bedingungen ermöglicht die 2-tägige embryoide Körperbildung + 6-Tage-Retinoinsäure-Induktionsprotokoll eine schnelle und effiziente Differenzierung von mESCs in neuronale Vorläuferzellen (NPCs), wie die Bildung von gut gestapelten und neuritigen A2lox- und 129 Derivaten sieht, die Nestin-positiv sind. Der gesunde Zustand von embryoiden Körpern und der Zeitpunkt, an dem Retinsäure (RA) angewendet wird, sowie die RA-Konzentrationen sind dabei von entscheidender Bedeutung. In der anschließenden Differenzierung von NPCs in Neuronen könnte N2B27 medium II (ergänzt durch Neurobasal medium) die langfristige Erhaltung und Reifung neuronaler Zellen besser unterstützen. Die vorgestellte Methode ist hochgradig effizient, kostengünstig und einfach zu bedienen und kann ein leistungsfähiges Werkzeug für die Neurobiologie und Entwicklungsbiologieforschung sein.

Einleitung

Embryonale Stammzellen (ESCs) sind pluripotent und können sich unter bestimmten Bedingungen in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) und anschließend in Neuronen differenzieren¹. ESC-basierte Neurogenese bietet die beste Plattform, um Neurogenese zu imitieren, und dient somit als nützliches Werkzeug für Entwicklungsbiologie-Studien und potenziell Hilfe in der regenerativen Medizin^2,3. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Strategien zur Induktion der embryonalen Neurogenese berichtet, wie die transgene Methode⁴, mit kleinen Molekülen⁵, mit ei....

Protokoll

1. Maus embryonale Stammzellkultur

1. Bereiten Sie 0,1% gelatinebeschichtete Zellkultur-Gerichte oder Teller zu.
   1. 2 ml sterilisierte 0,1% Gelatine (0,1% w/v in Wasser) zu 60 mm Zellkulturschalen hinzufügen. Schaukeln Sie sanft, um eine gleichmäßige Beschichtung der Zellkulturgerichte zu gewährleisten.
   2. Die Gerichte bei 37 °C in einen 5% CO2-Inkubator geben und 1 h beschichten lassen.
   3. Entfernen Sie die 0,1% Gelatinelösung, bevor Sie die Zellen säen.
      HINWEIS: Nach dem Entfernen der Gelatine ist es nicht erforderlich, die beschichteten Gerichte zu trocknen oder zu waschen.
2. Embryonale Stammzellen der ....

Ergebnisse

2-Tage embryoide Körperbildung + 6-Tage-RA-Induktion funktioniert am besten bei der Unterscheidung von mESCs in NPCs (Phase I). Um das optimale Protokoll zu bestimmen, das die Differenzierung von mESCs in NPCs (Phase I) am besten fördert, wurden 7 Protokolle sowohl auf A2lox als auch auf 129 mESCs (Tabelle 1) getestet und der Differenzierungsstatus jeder Gruppe mit Lichtmikroskop überwacht. Wie in Abbildung 3Adargestellt, zeigten die meisten A2lox- und 129-Derivate unter "2-.......

Diskussion

In der vorliegenden Studie haben wir eine einfache und effektive Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs mit kostengünstigen und leicht zu erhaltenden Materialien etabliert. Bei dieser Methode können 2 Tage embryoiden Körperbildung gefolgt von 6 Tagen RA-Induktion die Differenzierung von mESCs in NPCs wirksam fördern (Phase I-Protokoll 3). Für die Phase-II-Differenzierung induzieren N2B27 Medium II (Phase II-Protokoll 3) am effektivsten die Differenzierung von NPCs in Neuronen. Um den Erfolg zu gewährleisten, so.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-Nestin-Antikörper [Rat-401]	Abcam	Ab11306	gelagert bei -80 ° C, wiederholtes Einfrieren und Auftauen
vermeiden Anti-β-Tubulin III-Antikörper, hergestellt in Kaninchen	Sigma Aldrich	T2200	gelagert bei -80 &de; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	gelagert bei -20 &Grad; C und vor Licht schützen
B-27 Supplement (50X), serumfreies	Gibco	17504044	bei -20 & Grad gelagert; C und vor Licht schützen
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	gelagert bei -20 &Grad; C
Deckgläser	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	gelagert bei -20 ° C und Schutz vor Licht
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	gelagert bei 4 > C
Fötales Rinderserum	HyClone	SH30084,03	gelagert bei -20 &de; C, wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden
Fluoreszenzmikroskopie	Olympus	CKX53
Gelatine	Gibco	CM0635B	bei Raumtemperatur gelagert
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	bei 4 & Grad gelagert; C
Immunol-Färbung Primärer Antikörperverdünnungspuffer	Beyotime	P0103	gelagert bei 4 ° C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	bei 4 Grad gelagert; C
KnockOut Serum Ersatz	Gibco	10828028	bei -20 & Grad gelagert; C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen
Leukämie-Hemmfaktor humanes	Sigma	L5283	gelagert bei -20 & Grad; C
Eindeckmedium mit DAPI - wässrig, Fluoroshield	Abcam	ab104139	gelagert bei 4 & deg; C und vor Licht
schützen MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140076	bei 4 &° gelagert; C
N-2 Zusatz (100X)	Gibco	17502048	bei -20 °C gelagert; C und vor Licht
schützen Normales Ziegenserum	Jackson	005-000-121	gelagert bei -20 ° C
Neurobasales Medium	Gibco	21103049	bei 4 Grad gelagert; C
Nicht adhäsive Bakterienschale	Corning	3262
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X)	HyClone	SH30256.01B	gelagert bei 4 &Grad; C
Penicillin/Streptomycin Lösung	HyClone	SV30010	bei 4 μg gelagert; C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	gelagert bei -20°; C
Retinsäure	Sigma	R2625	gelagert bei -80 ° C und vor Licht schützen
Stamm 129 embryonale Stammzellen der Maus	Cyagen	MUAES-01001	Gehalten in einem feederfreien Kultursystem
Stem-Cellbanker (DMSO-frei)	ZENOAQ	Stammzellbanker DMSO-frei	gelagert bei -20 ° C, vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen
Trypsin 0,25% (1X) Lösung	HyClone	SH30042,01	gelagert bei 4 > C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	gelagert bei 4 > C und schützen vor Licht
4% Paraformaldehyd	Beyotime	P0098	gelagert bei -20 ° C
6 - Well-Platte	Corning	3516
60 mm Zellkulturschale	Corning	430166
15 ml Zentrifugenröhrchen	NUNC	339650