Methodenartikel

Direktes Flüssigkultur-Screening zur Bewertung der Produktion heterologer Proteine unter Verwendung einer auxotrophen Mutante von Aspergillus oryzae

DOI:

10.3791/61219

⸱

12. Mai 2020

 , 
1Honda Research Institute Japan Co., Ltd.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Es wurde eine direkte Flüssigkultur-Screening-Methode (DLC) entwickelt, die den Zeitaufwand für die Protoplastentransformation des filamentösen Pilzes Aspergillus oryzae durch Polyethylenglykol (PEG) signifikant reduziert, wenn er zur Bewertung der sekretorischen Produktion heterologer Proteine eingesetzt wird. Diese Methode erhöht den Durchsatz des Auswertungsprotokolls erheblich.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus oryzae, ein filamentöser Pilz, ist einer der am weitesten verbreiteten Wirte für industrielle Anwendungen, einschließlich der großtechnischen Produktion von Proteinen. Eine durch Polyethylenglykol (PEG) vermittelte Protoplastentransformationsmethode wird im Allgemeinen für die Einführung heterologer Gene in A. oryzae verwendet. Die konventionelle Methode benötigt in der Regel drei Wochen für das Screening günstiger Transformanten. Hier wird eine neue Technik eingeführt, die direkte Flüssigkultur-Screening-Methode (DLC), die die Screening-Zeit auf sechs Tage in einem 200-ml-Kolbenformat oder auf 10 Tage in einem 24-Well-Mikroplattenformat reduziert. Die DLC-Screening-Methode gewährleistet die Gewinnung positiver Transformanten und die Bewertung der sekretorischen Produktion heterologer Proteine in einem einzigen Schritt, im Gegensatz zur herkömmlichen Screening-Methode, bei der zwei separate Schritte erforderlich sind. Das Protokoll für die PEG-vermittelte Protoplastentransformation von A. oryzae wird beschrieben und besteht aus fünf Schritten: Vorbereitung der frischen Sporensuspension, Präkultur, Aufbereitung von Protoplasten, Einführung von DNA und DLC-Screening. Für erfolgreiche Ergebnisse beim DLC-Screening ist es entscheidend, ein nährstoffreiches Medium mit optimiertem osmotischem Druck zu verwenden. Das Protokoll sollte die Verwendung von A. oryzae als bevorzugtes Mittel bei der industriellen Produktion von Proteinen weiter populär machen.

Einleitung

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Aspergillus oryzae ist ein wichtiger Mikroorganismus in der japanischen Lebensmittelindustrie, der seit über 1.000 Jahren bei der Herstellung von fermentierten Lebensmitteln wie Sake (Reiswein), Shoyu (Sojasauce) und Miso (Sojabohnenpaste) verwendet wird1,2. Es hat die Fähigkeit, eine große Menge an Proteinen wie Proteasen und Amylasen zu sezernieren3. Genomsequenzinformationen für A. oryzae sind ebenfalls verfügbar4. Darüber hinaus wurden für diesen Pilz leistungsfähige und praktisch nützliche gentechnische Verfahren etabliert 5,6,7,8,9,10. Günstige Transformanten wurden als Wirte für die sekretorische Produktion von heterologen Proteinenverwendet 11,12,13,14.

Elektroporation, Agrobacterium-vermittelte Transformation und Polyethylenglykol (PEG)-vermittelte Protoplastentransformation sind die Techniken, die zur Einführung heterologer Gene in A. oryzae verwendet werden 15,16,17. Die PEG-vermittelte Protoplasten-Transformationsmethode ist weit verbreitet, seit sie 1979 erstmals für Neurospora crassa berichtet wurde18. Bei dieser Methode werden Protoplasten präpariert und mit PEG und dem heterologen Gen, das in die Zellen eingebracht werden soll, gemischt. Die Wände der Protoplasten sind enzymatisch beeinträchtigt, was die Zellen anfällig für physischen Stress und Änderungen des osmotischen Drucks macht19,20. Die konventionelle Screening-Methode, die bei der sekretorischen Produktion heterologer Proteine angewendet wird, umfasst drei Schritte: Gewinnung positiver Transformanten (auf weicher Agarplatte), Auswahl von wahren und falschen Transformanten (auf Agarplatte) und Bewertung der sekretorischen Produktion heterologer Proteine (in Flüssigkultur); Jeder dieser Schritte dauert sieben Tage (Abbildung 1). So dauert die herkömmliche Methode in der Regel etwa drei Wochen.

Die Zeit, die für das Screening von transformierten A. oryzae-Zellen benötigt wird, ist viel länger als die für andere Mikroorganismen, die üblicherweise in der biotechnologischen Forschung verwendet werden, was den Prozess umständlicher macht. Wenn beispielsweise Escherichia coli als Wirt verwendet wird, dauert es von der Einführung der DNA bis zur Bestätigung ihrer Wirkung etwa zwei Tage21.

Um die mit der Verwendung von A. oryzae verbundene Einschränkung, wie oben erwähnt, zu umgehen, wird hierin ein neues direktes Flüssigkultur-Screening-Verfahren (DLC) eingeführt, das ein schnelleres und einfacheres Screening zur Bewertung der sekretorischen Produktion heterologer Proteine ermöglicht (Abbildung 1). Bei der DLC-Methode werden eine auxotrophe Uridin-Mutante und ein nährstoffreiches flüssiges Medium verwendet. Mit dieser Methode kann der Screening-Schritt innerhalb von sechs Tagen nach der Einführung von DNA in die Protoplasten in einem 200-ml-Kolbenformat oder innerhalb von 10 Tagen in einem 24-Well-Mikroplattenformat abgeschlossen werden. Darüber hinaus entfällt bei dieser Methode die zeit- und aufwändige Vorbereitung von Agarplattenmedien. Die Anwendung des neu beschriebenen Verfahrens ist von großem Vorteil, insbesondere wenn man bedenkt, dass das konventionelle Verfahren zwei verschiedene Medien benötigt: die weiche Agarplatte für die Gewinnung positiver Transformatoren, die eine sorgfältige Handhabung und Temperaturkontrolle erfordert, und die feste Agarplatte für die Auswahl echter Transformatoren.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der durch Polyethylenglykol (PEG) vermittelten Protoplastentransformation des filamentösen Pilzes Aspergillus oryzae.
(Oberes Feld) Konventionelle Screening-Methode. (Untere Platte) Direkte Flüssigkultur-Screening-Methode (DLC). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

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1. Herstellung der frischen Sporensuspension

  1. 20 μl einer Stammsporensuspension (1 x 107 Sporen/ml) in der Mitte einer Kulturplatte, die Czapek-Dox (CD)-Medium enthält, mit 20 mM Uridin inokulieren (20 min lang bei 121 °C autoklaviert, Tabelle 1).
  2. 7 Tage lang bei 30 °C inkubieren, um die Sporenbildung zu fördern.
  3. 1,5 ml 0,01 %ige Tween-20-Lösung (20 min lang bei 121 °C autoklaviert) in die mit den Sporen enthaltende Kulturplatte geben und die Sporen durch Schaben mit einem Zellverteiler suspendieren.
  4. Sammeln Sie die Sporensuspension mit einer Pipette in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  5. Lagern Sie die Suspension bis zur Verwendung bei 4 °C.
    HINWEIS: Verwenden Sie die Sporensuspension im folgenden Verfahren innerhalb von 2 Wochen. Um eine Brühe für die Langzeitlagerung herzustellen, geben Sie Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 15 % in die Sporensuspension und lagern Sie es bei -80 °C.

2. Vorkultur

  1. 100 ml Polypepton-Dextrin (PD)-Medium (Tabelle 2) werden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und 20 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert.
  2. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Temperatur des Mediums gesenkt ist, fügen Sie die durch Passieren eines Filters mit einer Porengröße von 0,22 μm sterilisierte Uridinlösung bis zu einer Endkonzentration von 20 mM hinzu.
  3. 200 μl der in Schritt 1.4 hergestellten Sporensuspension (1 x 107 Sporen/ml) zugeben und bei 30 ΰC unter Schütteln bei 120 U/min 36 h inkubieren.

3. Vorbereitung der Protoplasten

  1. Die in Schritt 2.3 aufbereitete Pilzbiomasse wird auf einem Glasfilter mit einer Porengröße von 30 μm geerntet (20 min lang bei 121 °C autoklaviert).
  2. Gießen Sie 100 mL destilliertes Wasser (DW) (20 min lang bei 121 °C autoklaviert) auf den Glasfilter und rühren Sie mehrmals mit einem Spatel um (20 min bei 121 °C autoklaviert).
  3. Nach dem Waschen mit DW 100 mL Natriumchlorid (NaCl)-Puffer (20 min bei 121 °C autoklaviert, Tabelle 3) auf den Glasfilter gießen und mehrmals mit einem Spatel umrühren.
  4. Übertragen Sie etwa 1-2 mL (feuchtes Volumen) der Zellen mit einem Spatel (20 min lang bei 121 °C autoklaviert) in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
  5. Nach Zugabe von 15 ml der Enzymlösung (sterilisiert durch Passieren eines 0,22 μm porengroßen Filters, Tabelle 4) in ein konisches 50-ml-Röhrchen fügen Sie NaCl-Puffer hinzu, bis das Gesamtvolumen 30 ml erreicht.
  6. Deckel schließen und mit Paraffinfolie verschließen. Inkubieren bei 30 °C und Schütteln bei 60 U/min für 2 h.
  7. Lassen Sie die resultierende Lösung durch ein 70-μm-Zellsieb fließen, das an dem konischen 50-ml-Röhrchen befestigt ist, um das nicht umgesetzte Myzel zu entfernen.
  8. Die Protoplastenlösung wird in einem konischen 50-ml-Röhrchen bei 2.150 x g und 4 °C für 20 min zentrifugiert.
  9. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, um ein Lösen der Kugel zu verhindern. 1 ml eiskalte sterilisierte Lösung B (20 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert, Tabelle 5) zugeben und die ausgefällten Protoplasten durch Pipettieren vorsichtig suspendieren.
  10. Übertragen Sie die suspendierten Protoplasten in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen.
  11. Bei 2.220 x g und 4 °C 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie dann 1 ml eiskalte Lösung B hinzu und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig durch Pipettieren.
  12. Wiederholen Sie Schritt 3.9.
  13. Messen Sie mit einem Hämozytometer die Anzahl der Protoplasten unter einem Mikroskop.
  14. Bereiten Sie eine Protoplastensuspension (1-3 x 107 Protoplasten/ml) in Lösung B vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung auf Eis.
    HINWEIS: Verwenden Sie die Protoplast-Suspension sofort wie folgt.

4. Einführung von DNA für die sekretorische Produktion von Proteinen

  1. Unter Verwendung eines Plasmids, das eine DNA-Kassette für die sekretorische Produktion von Protein als Matrize enthält, amplifizieren Sie das DNA-Fragment, das für die sekretorische Produktion durch PCR erforderlich ist.
  2. Bereiten Sie die DNA-Probe für die Transformation vor, indem Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Aufreinigungskit verarbeiten.
  3. Geben Sie 1 ml der Protoplastenlösung, 200 μl Lösung C (20 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert, Tabelle 6) und 50 μl der DNA-Probe (0,5-1 μg/μl) in ein steriles, vorgekühltes konisches 15-ml-Röhrchen und mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Pipettieren.
    HINWEIS: Lösung C ist hochviskos und kann schwierig zu handhaben sein; Sorgen Sie für ein gründliches Mischen durch Pipettieren.
  4. Inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis.
  5. Fügen Sie 1,5 ml Lösung C hinzu, mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und lassen Sie die Lösung dann 20-30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

5. Direktes Screening von Flüssigkulturen

HINWEIS: Wählen Sie das Kultursystem mit Erlenmeyerkolben (Abschnitt 5.1) oder Mikrotiterplatten (Abschnitt 5.2).

  1. Kultursystem mit einem 200 mL Erlenmeyerkolben
    1. 50 ml PD-Medium mit 0,8 M Sorbit werden in einen 200-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und durch Autoklavieren bei 121 °C für 20 min sterilisiert.
    2. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Temperatur des Mediums gesunken ist, geben Sie die in Schritt 4.5 hergestellte Protoplastensuspension in eine Endkonzentration von 1 x 105 Protoplasten/ml.
    3. Inkubieren Sie die Kultur 6 Tage lang bei 30 °C und schütteln Sie sie bei 120 U/min.
    4. 1 ml des Mediums auffangen und in einem 1,5-ml-Röhrchen bei 4 °C lagern. Lagern Sie die Kulturprobe bei -20°C, wenn sie nicht sofort analysiert wird.
    5. Mischen Sie 20 μl Kulturprobe und 20 μl Natriumdodecylsulfat (SDS)-Probenpuffer (Tabelle 7) in einem 1,5-ml-Röhrchen und kochen Sie es 5 Minuten lang bei 95 ° C.
    6. Nach dem Abkühlen auf Eis werden 20 μl der gekochten Probe und 5 μl des vorgefärbten Proteinstandards auf ein vorgefertigtes Gel geladen und die sekretorische Produktion des heterologen Zielproteins mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)10 analysiert.
  2. Kultursystem mit einer 24-Well-Mikroplatte
    1. Die in Schritt 4.5 hergestellte Protoplastensuspension zu sterilisiertem 0,8 M Sorbit-haltigem PD-Medium bis zu einer Endkonzentration von 1 x 105 Protoplasten/ml geben und durch Pipettieren vorsichtig mischen.
    2. 1 ml der in Schritt 5.2.1 hergestellten Lösung in drei Vertiefungen in einer 24-Well-Mikroplatte geben.
    3. Den Deckel aufsetzen und bei 30 °C und Schütteln bei 175 U/min 10 Tage lang inkubieren.
    4. Sammeln Sie 1 mL des Mediums und lagern Sie es in einem 1,5 mL Röhrchen bei 4 ° C. Lagern Sie die Kulturprobe bei -20 ° C, falls nicht sofort analysiert.
    5. Mischen Sie 20 μL der Kulturprobe und 20 μL SDS-Probenpuffer in einem 1,5 mL Röhrchen und kochen Sie es bei 95 ° C für 5 min.
    6. Nach dem Abkühlen auf Eis werden 20 μl der gekochten Probe und 5 μl des vorgefärbten Proteinstandards auf ein vorgefertigtes Gel geladen und die sekretorische Produktion des heterologen Zielproteins mittels SDS-PAGE10 analysiert.

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Ergebnisse

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Die Ergebnisse für die Einführung der DNA-Expressionskassette, die für Talaromyces cellulolyticus cellobiohydrolase (CBH: GenBank Accession Number E39854) kodiert, in eine Uridin-Auxotrophe des A. oryzae-Stammes HO422 und das Screening auf die sekretorische Produktion des heterologen Proteins werden im Folgenden beschrieben.

Herstellung der frischen Sporensuspension

Die endgültige Ausbeute an Sporensuspensio...

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Diskussion

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Wir haben ein System entwickelt, das das Screening von A. oryzae-Transformanten schneller als mit der herkömmlichen Methode ermöglicht, indem eine Flüssigkultur der Protoplasten durchgeführt wird. Der kritischste Aspekt dieser Methode ist der osmotische Druck des flüssigen Mediums. Der osmotische Druck, der für die Flüssigkultur geeignet ist, wurde mit Sorbit optimiert. Das Wachstum des A . oryzae-Stammes HO4 war in Gegenwart von 0,8 M Sorbit am aktivsten (

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Rinkei Okano für seine Hilfe bei den Experimenten. Die Autoren danken Professor Katsuya Gomi von der Tohoku Universität und Professor Masayuki Machida vom Kanazawa Institute of Technology für die wertvollen Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom Honda Research Institute Japan Co., Ltd. finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 M NaOHNACALAI TESQUE, INC.37421-05
1 M Tris-HCl (pH 7,5)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation318-90225
1 M Tris-HCl (pH 6,8)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation2106-100
1,5-ml-MikrozentrifugenröhrchenAS ONE Corporation1-1600-03
15-ml-Konisches ZentrifugenröhrchenBecton, Dickinson and Company352196
2- MercaptoethanolBio-Rad Laboratories, Inc.
24-Well-MikroplatteAGC TECHNO GLASS CO., LTD.3820-024
Konisches 50-ml-ZentrifugenröhrchenBecton, Dickinson and Company352070
70-& micro; m ZellensiebBecton, Dickinson and Company352350
AgarFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation010-15815
AutoklavTOMY SEIKO CO.,LTD.LSX-700
BromphenolblauFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation021-02911
CaCl2FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation038-24985
CasaminosäureFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation393-02145
Cellulase R-10Cosmo Bio Co., Ltd.16419
DextrinhydratFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation044-00585
D-SorbitFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation191-14735
e-PAGELATTO CORPORATIONE-T/R1020LWird für vorgefertigtes Gel in SDS-PAGE
Elektrophoresegerätverwendet ATTO CORPORATIONWSE-1150Wird für SDS-PAGE
verwendetFeSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation098-01085
Glasfilter 17G3Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.
GlycerinFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation070-04941
HämozytometerFunakoshi Co., Ltd.521-10
Kühlzentrifuge mit hoher GeschwindigkeitKUBOTA CORPORATION7780Wird zum Zentrifugieren von Proben in konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen
verwendet InkubatorTAITEC CORPORATION.G· BR-200Wird für die Flüssigkultur des Kolbens und die Vorbereitung von Protoplasten
verwendet InkubatorTAITEC CORPORATION.BR-43FLVerwendet für Mikrotiterplatten-Flüssigkulturen und Plattenkulturen
KClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-03545
KH2PO4NACALAI TESQUE, INC.28721-55
Lysing-EnzymSigma-AldrichL1412-10G
MgSO4· 7H2OFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation131-00405
MikrokühlzentrifugeKUBOTA CORPORATION3740Wird zum Zentrifugieren von Proben in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen verwendet
MikroskopLeica MicrosystemsDMI6000 B
NaClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation190-13921
NaH2PO4· 2H2ONACALAI TESQUE, INC.31718-15
NaNO3FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation195-02545
Parafilm MBemis Company, IncPM-996
PCR-AufreinigungskitQIAGEN K.K28104
PetrischaleSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-11900Verwendet als Kulturplatte
PolyethylenglykolSigma-AldrichP3640-500G
Polypepton PeptonBecton, Dickinson and Company211910
ProteinleiternBio-Rad Laboratories, Inc.161-0377Wird als Molekulargewichtsmarker in SDS-PAGE
Natriumdodecylsulfatverwendet Bio-Rad Laboratories, Inc.
SterilfilterMerck KGaASLGP033RB
SaccharoseNACALAI TESQUE, INC.30404-45
Tween 20Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0543
UridinSigma-AldrichU3750-25G
YatalaseTakara Bio Inc.Nr. T017
161071000000941471610301

Referenzen

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