Dieses Protokoll beschreibt die Bewertung des subzellulären Kompartiment-spezifischen Redoxstatus innerhalb der Zelle. Eine redoxempfindliche Fluoreszenzsonde ermöglicht eine komfortable ratiometrische Analyse in intakten Zellen.
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Methodenartikel
Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Messung des intrazellulären Oxidations-/Reduktionsgleichgewichts bietet einen Überblick über den physiologischen und/oder pathophysiologischen Redoxstatus eines Organismus. Thiole sind besonders wichtig für die Beleuchtung des Redoxstatus von Zellen über ihre reduzierten Dithiol- und oxidierten Disulfidverhältnisse. Entwickelte cysteinhaltige fluoreszierende Proteine eröffnen eine neue Ära für Redox-empfindliche Biosensoren. Eines davon, redoxsensitives grünes fluoreszierendes Protein (roGFP), kann leicht in Zellen mit adenoviraler Transduktion eingeführt werden, so dass der Redoxstatus subzellulärer Kompartimente ausgewertet werden kann, ohne zelluläre Prozesse zu stören. Reduzierte Cysteins und oxidierte Zystiker von roGFP haben Anregungsmaxima bei 488 nm bzw. 405 nm, mit Emission bei 525 nm. Die Beurteilung der Verhältnisse dieser reduzierten und oxidierten Formen ermöglicht die bequeme Berechnung des Redox-Gleichgewichts innerhalb der Zelle. In diesem Methodenartikel wurden verewigte menschliche dreifach-negative Brustkrebszellen (MDA-MB-231) verwendet, um den Redoxstatus innerhalb der lebenden Zelle zu bewerten. Die Protokollschritte umfassen MDA-MB-231 Zelllinientransduktion mit Adenovirus zur Exprimierbarkeit von Zytosol-RoGFP, Behandlung mit H2O2und Bewertung des Cystein- und Cystin-Verhältnisses mit Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie.
Einleitung
Oxidativer Stress wurde 1985 von Helmut Sies als "Störung des prooxidant-antioxidativen Gleichgewichts zu Gunsten des ersten"definiert,und es wurde eine Fülle von Forschungsarbeiten durchgeführt, um einen krankheits-, ernährungs- und alterungsspezifischen Redoxstatus von Organismen1,2,3zu erhalten. Seitdem ist das Verständnis von oxidativem Stress breiter geworden. Das Testen der Hypothesen der Verwendung von Antioxidantien gegen Krankheiten und/oder Alterung hat gezeigt, dass oxidativer Stress nicht nur Schaden verursacht, sondern auch andere Rollen i....
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Protokoll
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für 70 % –80 % konfluente MDA-MB-231-Zellen optimiert. Bei anderen Zelllinien sollten die Anzahl der Zellen und die Vielzahl der Infektionen (MOI) neu optimiert werden.
1. Vorbereitung der Zellen (Tag 1)
- MDA-MB-231 Zelllinie in 75 cm2 Kolben mit 10 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) zu halten, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einer 5%CO2 befeuchteten Atmosphäre.
HINWEIS: DMEM, ergänzt durch 10% FBS, 37 °C und eine 5%CO2 befeuchtete Atmosphäre, werden für alle Befestigungs- und Behandlungsinkubationen während des gesamten Protokoll....
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Ergebnisse
Der Redoxzustand von CyS/CySS lässt sich leicht mit transduzierten RoGFPs überprüfen. Die fluoreszierende Sonde quantifiziert das Verhältnis zwischen den reduzierten und oxidierten Formen (Erregungswellenlängen 488 nm bzw. 405 nm). Fluoreszenzdaten können sowohl durch Durchflusszytometrie als auch durch Mikroskopie ermittelt werden.
Eine große Anzahl von Zellen kann konsistent und bequem mit Durchflusszytometrie erfasst werden. Die Analyse besteht aus 3 Hauptschritten: 1) Wählen Sie die von In.......
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Diskussion
Das Thiol/Disulfid-Gleichgewicht in einem Organismus spiegelt den Redoxstatus von Zellen wider. Lebende Organismen haben Glutathion, Cystein, Proteinthiole und niedermolekulare Thiole, die alle von der Oxidation betroffen sind und den Redoxstatus der Zellen4wiedergeben. Technische ROGFPs ermöglichen die unterbrechungsfreie Quantifizierung des Thiol/Disulfid-Gleichgewichts über ihre CyS-Rückstände7. Die ratiometrische Eigenschaft von roGFP liefert zuverlässige Redoxmessungen.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Das Konstrukt und rekombinante Adenovirus zur Exdinierung von Cytosol-spezifischem RoGFP in Zellen wurden im Labor von Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University und ViraQuest Inc. erzeugt. Diese Studie wurde vom Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy Grant P20GM109005 durch das NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program Grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor es Awards AWD00053484. Die Durc....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin-EDTA | Gibco von Life Sciences | 25200-056 | Zellkultur |
| 4-Well-Kammer-Objektträger | Thermo Scientific | 154526 | Cell Seeding-Material für die Fluoreszenzbildgebung |
| 5-ml-Röhrchen mit Zellsiebkappe | Falcon | 352235 | Einzelzell-Suspensionsröhrchen für die Durchflusszytometrie-Analyse |
| 6-Well-Platte | Corning | 353046 | Zellaussaatmaterial für die Durchflusszytometrie-Analyse |
| 15 ml konische Röhrchen | MidSci | C15B | Zellkultur |
| 75 cm2 belüftete Kappen-Gewebekulturflaschen | Corning | 4306414 | Zellkultur |
| Adenovirales Zytosol-spezifisches roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP-Konstrukt freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Schumaker |
| Klasse II, Typ A2 Sicherheitshaubenschrank | Thermo Scientific | 1300 Serie A2 | Zellkultur |
| Countess automatisierter Zellzähler | Invitrogen | C10227 | Zellzählung |
| Countess Zellzähler Objektträger | Invitrogen | C10283 | Zellzählung |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Zellkultur |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Zellkultur |
| Gefilterte Pipettenspitzen, steril, 20 & Mikro; l | Fisherbrand | 02-717-161 | Zellkultur |
| Gefilterte Pipettenspitzen, steril, 1000 & Mikro; l | Fisherbrand | 02-717-166 | Zellkultur-Durchflusszytometer |
| BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument ausgestattet mit FITC- und BV510-Bandpassfiltern für Durchflusszytometrie-Analysen | |
| Fluoreszenzmikroskop | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluoreszenzbildgebung |
| Wasserstoffperoxid 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positivkontrolle |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluoreszenzbildgebung von roGFP-exprimierenden Zellen (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluoreszierende Bildgebung von roGFP-exprimierenden Zellen (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | der humanen epithelialen Brustkrebszelllinie |
| , 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Zellkultur |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | |
| Pipettierhilfe | Drummond | Hood Mate Model 360 | |
| Serologiepipette für Zellkulturen, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | |
| Serologiepipette für Zellkulturen, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| Serologiepipette für Zellkulturen, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 Inkubator für Zellkulturen | |
| Trypanblau-Färbung 0,4% | Invitrogen | T10282 | Zellzählung |
Referenzen
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P. Redefining Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).
- Pizzino, G., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
