Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus ausgereiften Adipozyten, zur Reinigung durch fluoreszenzaktivierte Sortierung und zur einzelligen Transkriptomik.
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Methodenartikel
Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Braunes und beiges Fett sind spezialisierte Fettgewebe, die Energie für die Thermogenese durch UCP1 (Uncoupling Protein-1) abhängige und unabhängige Wege ableiten. Bis vor kurzem galten thermogene Adipozyten als homogene Population. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass es mehrere Subtypen oder Subpopulationen gibt, die sich in Entwicklungsherkunft, Substratverwendung und Transkriptom unterscheiden. Trotz der Fortschritte in der einzelligen Genomik war die unvoreingenommene Zersetzung von Fettgeweben in zelluläre Subtypen aufgrund der zerbrechlichen Natur von lipidgefüllten Adipozyten eine Herausforderung. Das vorgestellte Protokoll wurde entwickelt, um diese Hindernisse durch eine effektive Isolierung einzelner Kerne aus Fettgewebe für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich der RNA-Sequenzierung, zu umgehen. Die zelluläre Heterogenität kann dann durch RNA-Sequenzierung und bioinformatische Analysen analysiert werden.
Einleitung
Studien haben gezeigt, dass braunes Fettgewebe (BAT) eine bemerkenswerte Fähigkeit hat, Energie abzuleiten. Zwei Arten von thermogenen Adipozyten mit unterschiedlichen Entwicklungsmerkmalen existieren sowohl bei Nagetieren als auch beim Menschen: Beige-Adipozyten und klassische braune Adipozyten. Während sich klassische braune Adipozyten meist in interscapularen BVT-Depots befinden, entstehen beige adipozyten sporadisch in weißem Fettgewebe (WAT) als Reaktion auf bestimmte physiologische Hinweise, wie chronische Kälteexposition, ein Prozess, der als "Browning" oder "Beiging" bezeichnet wird. Durch den Einsatz von fortgeschrittener Bildgebung ist nun klar, dass erwachs....
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Protokoll
Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der Albert Einstein College of Medicine genehmigt wurden.
1. Vorbereitung von Gewebeverdauungs- und Lysepuffern
- Bereiten Sie den Gewebeverdauungspuffer vor.
- Bereiten Sie für jedes Gramm Fettgewebe einen Verdauungspuffer von 1 ml vor.
- 1,5 U/ml Kollagennase D und 2,4 U/ml Dispase II abwägen und Phosphatgepufferte Saline (PBS) hinzufügen.
- Vorbereiten des Kernvorbereitungspuffers (NPB).
- Bereiten Sie 10 mM HEPES, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid, 250 mM S....
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Ergebnisse
Unsortierte Adipozytenkerne enthalten Trümmer und Doublets, die bei der nachgeschalteten einzelzelligen RNA-Sequenzierung Rauschen und hohen Hintergrund erzeugen. Die repräsentative FACS-Gate-Strategie ist in Abbildung 1dargestellt. Die Kerne wurden zuerst auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) (A) ausgewählt, dann wurden nur Singlets auf der Grundlage der Kombination von Breite und Höhen von SSC (B
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Diskussion
Es wird eine einfache und robuste Methode zur Isolierung einzelner Kerne und zur Untersuchung der Heterogenität des Fettgewebes vorgestellt. Im Vergleich zur Sequenzierung der gesamten Gewebe-RNA bietet dieser Workflow einen unvoreingenommenen Blick auf die zelluläre Heterogenität und populationsspezifische Marker. Dies ist signifikant und innovativ für die Weiterentwicklung der Adipozytenbiologie, des molekularen Stoffwechsels und der Adipositasforschung.
Dieses Protokoll ist speziell für die.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken David Reynolds vom Albert Einstein Genomics Core und Jinghang Zhang vom Flow Cytometry Core für die technische Unterstützung. Wir würdigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) (DK110426) und Pilot- und Machbarkeitsstipendien vom Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) und dem New York Obesity Research Center (DK026687) (alle nach K.S.). Wir danken auch Albert Einstein Cancer Center (CA013330) für die Kernunterstützung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| autoMACS Spüllösung | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS mit EDTA; sterilfiltriert |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Küvettenfilter 100 μ m | Corning | 431752 | |
| Zellenfilter 40μ m | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μ m) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Kollagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automatisierter Zellzähler | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fischer | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 & Mikro; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stapelbare Filter |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Zellsortierer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Saccharose | Fisher | S5-3 |
Referenzen
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in....
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Nachdrucke und Genehmigungen
