Methodenartikel

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

DOI:

10.3791/61236

⸱

6. Mai 2020

 ,  , 
1Department of Biology, Emmanuel College, 2Department of Chemistry and Physics, Emmanuel College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschrieben wird eine hochparallele Methode zur Messung der standortspezifischen DNA-Spaltung auf einzelmolekülebene. Dieses Protokoll demonstriert die Technik mithilfe der Einschränkung endonuklease NdeI. Die Methode kann leicht modifiziert werden, um jeden Prozess zu untersuchen, der zu einer standortspezifischen DNA-Spaltung führt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standortspezifische DNA-Spaltung (SSDC) ist ein wichtiger Schritt in vielen zellulären Prozessen, und es ist entscheidend für die Genbearbeitung. Diese Arbeit beschreibt einen kinetischen Assay, der sSDC in vielen einzelnen DNA-Molekülen gleichzeitig messen kann. Bead-tethered Substrat DNAs, die jeweils eine einzige Kopie der Zielsequenz enthalten, werden in einem mikrofluidischen Durchflusskanal hergestellt. Ein äußerer Magnet wendet eine schwache Kraft auf die paramagnetischen Perlen an. Die Integrität von bis zu 1.000 einzelnen DNAs kann überwacht werden, indem die Mikroperlen unter Dunkelfeld-Bildgebung mit einem Breitfeld-Objektiv mit geringer Vergrößerung visualisiert werden. Die Injektion einer Restriktionsendonuklease, NdeI, löst die Spaltungsreaktion aus. Die Videomikroskopie wird verwendet, um das genaue Moment jeder DNA-Spaltung aufzuzeichnen, indem der Rahmen beobachtet wird, in dem sich die zugehörige Perle auf und ab der Brennebene des Objektivs bewegt. Frame-by-Frame-Perlenzählung quantifiziert die Reaktion, und eine exponentielle Anpassung bestimmt die Reaktionsgeschwindigkeit. Diese Methode ermöglicht die Erfassung quantitativer und statistisch signifikanter Daten über Einzelne Molekül-SSDC-Reaktionen in einem einzigen Experiment.

Einleitung

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Standortspezifische DNA-Spaltung (SSDC) ist ein wichtiger Schritt in vielen genomischen Transaktionen. Beispielsweise schützen bakterielle Restriktionsmodifikationssysteme (RM)1 und CRISPR2 Zellen vor Angriffen durch Phagen und Plasmide, indem sie fremde DNA in bestimmten Sequenzen erkennen und spalten. In Typ II RM erkennen Restriktionsendonukleasen (REs) kurze 4–8 Basenpaarsequenzen (bp) über Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen3. CRISPR-assoziierte Endonukleasen, wie Cas9, binden über die Hybridisierung des Zielstandorts an Standorte mit crRNAs, die an die Endonukleases4gebunden sind. Die Erstellung von ortsspezifischen Doppelsträngigenbrüchen (DSBs) ist auch der erste Schritt bei vielen DNA-Rekombinationsereignissen5. Beispielsweise erfordert die Vielfalt der Durch V(D)J-Rekombination geschaffenen Antigenbindungsbereiche die Erkennung und Spaltung bestimmter Zielstandorte6. Einige Transposons sind dafür bekannt, bestimmte DNA-Sequenzen anzusprechen, sowie7. Es überrascht nicht, dass viele standortspezifische Nukleasen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, wie Cas9, eine Schlüsselkomponente von Gen-Editing-Technologiensind 8. Darüber hinaus wurden auch neuartige ortsspezifische Endonukleasen (d. h. Zinkfingernukleasen9 und TALENS10) entwickelt, um Genome zu bearbeiten.

Viele Methoden wurden eingesetzt, um die Kinetik der standortspezifischen Spaltung von Nukleinsäuren zu messen. Dazu gehören Gelanalyse, Fluoreszenz11,12und Sequenzierung basierende Methoden13. Ein großer Fortschritt wurde mit dem Ankleben von Mikroperlen erreicht, wodurch DSBs in einzelnen DNA-Molekülen durch die Bewegung einer Perle nach der Strangtrennung nachgewiesen werden können. Bei diesen Methoden werden verschiedene Arten von Kräften eingesetzt, um die Strangtrennung und Bewegung der Perle nach der Spaltung zu gewährleisten. In einem Fall wurden optische Fallen verwendet, um die Spaltung der DNA durch EcoRV14zu messen. In diesen Experimenten ist die Zielsuche das Ziel der Untersuchung, wobei die Bedingungen so optimiert sind, dass die standortspezifische Bindung der Schritt zur Preisbegrenzung ist. Ein Nachteil optischer Fallen ist, dass jeweils nur eine einzige DNA beobachtet werden kann. Darüber hinaus muss eine periodisch große Zugkraft angewendet werden, um die Strangtrennung zu testen.

Eine andere Technik verwendet eine Kombination aus Strömung und schwachen magnetischen Kräften, um die Perle kontinuierlich zu ziehen15. Auf diese Weise wird die Diffusionsbegrenzte Spaltung durch NdeI gemessen. Die angewandte Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung von mehreren hundert DNAs auf einmal, so dass die statistische Signifikanz in einem einzigen Experiment erreicht werden kann. Experimente auf Basis magnetischer Pinzetten wurden ebenfalls verwendet. In einer solchen Studie wurde ein retrovirales Integras untersucht, indem ein DSB in das Insertionsoligonukleotid16eingebunden wurde. Eine erfolgreiche Integration führte zur Einbindung von DSB in die gebundene DNA und zum Verlust der angehängten Perle. In einer ähnlichen Studie der ATP-abhängigen Typ-III-Beschränkung Endonuklease EcoPI wurden Dutzende von DNAs in einem einzigen Experiment beobachtet17. Magnetische Pinzette haben den Vorteil, dass Spannung, sowie DNA-Looping, während der Reaktion gesteuert und überwacht werden können.

Hier wird eine hochparallele Einzelmolekülmethode zur Messung der SSDC-Kinetik vorgestellt, die die jüngsten Verbesserungen bei der großflächigen Tethering von DNAs nutzt. Diese Methode ist eine Verbesserung und Erweiterung der bisherigen Methoden zur Messung der DNA-Replikation18, Konturlänge von DNA19und Spaltung durch REs15. Bei dieser Technik werden lineare DNAs, die eine einzige Kopie der Erkennungssequenz enthalten, mit Biotin an einem Ende und Digoxigenin am anderen Ende hergestellt. Das Biotin bindet Streptavidin, das kovalent an einer paramagnetischen Mikroperle befestigt ist. Die DNA-Perlenkomplexe werden in einen mikrofluidischen Kanal injiziert, der mit Anti-Digoxigenin-FAB-Fragmenten funktionalisiert wurde. Die DNA bindet sich dann über die Bindung des Digoxigenins an die adsorbierten FAB-Fragmente an die Oberflächenbefestigungspunkte. Schwache magnetische Kräfte, die mit einem Permanentmagneten aufgebracht werden, halten die Perle davon ab, nicht spezifisch an der Oberfläche zu kleben. Proben können schnell (<30 s) in den Durchflusskanal injiziert werden, um die Spaltreaktion zu aktivieren. Der Flow wird während der Datenerfassung deaktiviert. Da jede DNA spaltet wird, kann der genaue Zeitpunkt der Spaltung bestimmt werden, indem der Rahmen aufgezeichnet wird, in dem sich die Perle nach oben und aus dem Brennplan des Objektivs bewegt und somit aus dem Videoaufgenommen verschwindet. Eine Frame-by-Frame-Anzahl der verbleibenden Perlen kann verwendet werden, um den Reaktionsfortschritt zu quantifizieren.

Im Folgenden wird das komplette Protokoll sowie Beispieldaten dargestellt, die mit NdeI gesammelt werden. Als Beispiel dafür, wie die Technik angewendet werden kann, werden die Spaltraten für eine Reihe von Proteinkonzentrationen in zwei verschiedenen Konzentrationen von Magnesium, einem essentiellen Metallkofaktor, gemessen. Obwohl diese Anwendung des Protokolls NdeI verwendet, kann das Verfahren für die Verwendung mit jeder standortspezifischen Nuklease angepasst werden, indem das DNA-Substratdesign variiert wird.

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Protokoll

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1. Herstellung der Durchflusszelle

  1. Waschen der Abdeckungen
    1. Deckelinen in Färbegefäße geben und mit Ethanol (EtOH) beschallen, dann mit 1 M KOH (jeweils 30 min). Um KOH-Fällung in EtOH zu vermeiden, spülen Sie gründlich mit ddH2O zwischen den Wärjahren.
    2. Wiederholen Sie sowohl EtOH als auch die KOH-Waschschritte 1x für insgesamt vier Waschungen (zwei EtOH und zwei KOH). Gereinigte Deckelinen in ddH2O in Färbegefäßen aufbewahren.
  2. Be- und Austrittsrohre (8 cm lang) mit einem sauberen Rasiermesser schneiden und in Löcher in einem sauberen Glasschlitten einfügen. Verwenden Sie PE-20 für Einlass und PE-60 für Auslass. Epoxy für 5 min, um Schläuche zu sichern und überschüssige Schläuche abzuschneiden.
    HINWEIS: Glasschlitten messen 2'' x 3'' x 1 mm. Die Löcher werden paarweise im Abstand von 15 mm gebohrt. Jedes Paar bildet entweder das Ende eines einzelnen Kanals. Für den Einlass werden die Schläuche mit der kleineren ID verwendet, da dadurch das vorgeschaltete Totvolumen und damit die benötigte Mischzeit reduziert wird (Abbildung 1).
  3. Line up und tragen vorgeschnittene doppelseitige Klebeband mit Kanalmuster über Löcher auf der Glasrutsche geschnitten. Glätten Sie mit Kunststoffzangen, um eine gute Dichtung zu erreichen.
    HINWEIS: Das in diesem Experiment verwendete doppelseitige Band ist 120 m dick, und die Kanäle sind 2 mm breit und 15 mm lang. Die Kanäle werden mit einem Messerdrucker (Tabelle der Materialien) geschnitten. Es ist möglich, bis zu vier Kanäle auf einem einzigen Coverslip zu montieren. Siehe Abbildung 1 für ein Bild der Durchflusszelle.
  4. Nach dem Abschälen der Unterlage einen sauberen Deckelschlupf (mit Druckluft getrocknet) über das Band auftragen und mit Kunststoffzangen für eine gute Abdichtung wieder glätten.
  5. Epoxy die Kante aus dem Deckelrutsch, um die Durchflusszelle zu versiegeln und lassen Sie es aushärten.

2. Herstellung von markierter DNA zum Tethering

  1. Bereiten Sie in einer PCR-Röhre einen PCR-Reaktionsmix von 50 l vor, der 0,02 U/L-DNA-Polymerase mit hoher Genauigkeit, 200 M dNTPs, 0,5 M Vorwärtsprimer, 0,5 -M-Reverseprimer und 250 ng M13mp18-Vektor-DNA enthält.
    HINWEIS: Hier wurden der Vorwärtsprimer (Biotin-CCAACTTAATCGCCTTGC) und der Reverse Primer (digoxigenin-TGACCATTAGATACATTTCGC) ausgewählt, um eine Region von etwa 1.000 bp Länge zu verstärken, die sich von den Positionen 6338 bis 107 im kreisförmigen Genom der M13mp18 DNA erstreckt. Es gibt einen einzigen NdeI-Standort in der Mitte der verstärkten Region. Die Vordergrundzahl ist 5ʹ mit Digoxigenin beschriftet, das das Anti-Digoxigenin auf dem Coverslip bindet. Die Reverseprimer ist 5ʹ mit Biotin beschriftet, das die mit Streptavidin beschichteten Perlen bindet.
  2. Setzen Sie die PCR-Röhre in thermocycler ein und folgen Sie dem Zyklus, wie in Tabelle 1dargestellt.
  3. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Bereinigungskit nach dem Herstellerprotokoll.
    ANMERKUNG: Mit dem in der Materialtabelleangegebenen Kit beträgt die typische DNA-Ausbeute 2 g.

3. Tethering von DNA und Perlen

  1. 10 ml Puffer A vorbereiten (1 M Tris-HCl [pH = 7,5], 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mg/ml β-Casein, 1 mg/ml Pluronisch F-127). Degas in einem Vakuum-Austrocknungor für mindestens 1 h.
  2. Um die Durchflusszelle zu funktionalisieren, injizieren Sie 25 L Anti-Digoxigenin-FAB-Fragmente (20 g/ml) in PBS in den Durchflusskanal. Verwenden Sie Gel-Ladespitzen, um in die PE-60-Schläuche zu passen. Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 30 min.
  3. Nach der Inkubation spülen Sie den Kanal, indem Sie 0,5 ml Puffer A mit einer Spritze durch den Kanal ziehen. Achten Sie darauf, keine Luft in den Kanal einzuführen.
  4. Montieren Sie die Durchflusszelle nach der Funktionalisierung auf einem invertierten Mikroskop. Schließen Sie das Auslassrohr an eine Spritzenpumpe an und legen Sie das Einlassrohr in ein Mikrozentrifugenrohr mit Puffer A.
  5. Ziehen Sie manuell mindestens 0,5 ml Puffer A, um das System zu spülen und die Pumpe zu grundieren. Lassen Sie die Pumpe mindestens 5 min bei 10 l/min laufen, um das System auszustatten.
  6. Zur Herstellung der Perlen (Tabelle der Materialien), Wirbel die Lagerflasche von Perlen und Pipette 1,6 l der 10 mg/ml Stockperlen in 50 l Puffer A, dann Wirbel.
  7. Mit einem magnetischen Separator, Pipette aus dem Puffer und resuspend in 50 l Puffer A, dann Wirbel.
  8. Wiederholen Sie Schritt 3.7 2x für insgesamt drei Wähbe. Für die letzte Wäsche in 100 l Puffer A und Wirbel wieder aufsetzen, um eine Endkonzentration von 160 g/ml zu erreichen.
  9. Um die DNA und Perlen zu komplexieren, bereiten Sie zunächst 480 l 0,5 pM markiertes DNA-Substrat in Puffer A vor. Dann, Pipette in 20 l von 160 g/mL Perlensuspension, um sicherzustellen, dass die Perlen vor dem Pipetieren wirbeln. Legen Sie auf einen Rotator für 3 min.
  10. Nach 3 min sofort in den Kanal mit einer Durchflussrate von 10 l/min für ca. 15 min oder bis eine ausreichende Perlentethering beobachtet wird.
    HINWEIS: Perlen sollten nicht so dicht gepackt sein, dass sie auf der Oberfläche miteinander interagieren (siehe Diskussionsabschnitt).
  11. Um den Kanal aller freien Perlen zu waschen, schalten Sie das Einlassrohr auf ein frisches Rohr von Puffer A und fließen sie mindestens 10 min in 50 l/min ein oder bis keine losen Perlen beobachtet werden.

4. Datenerhebung und -analyse

  1. Zur Vorbereitung der Datenerfassung legen Sie ein Einlassrohr in ein Mikrozentrifugenrohr, das mindestens 100 l NdeI (0,25–4,00 U/ml) enthält, in Puffer A. Senken Sie den Permanentmagneten über dem Strömungskanal, und positionieren Sie die Lichtquelle von der Achse für die Dunkelfeld-Bildgebung.
    HINWEIS: Zwei ringförmige Seltenerdmagnete, die zusammen vereist sind, werden während der Datenerfassung mit einem freischwingenden optischen Pfosten 8 mm über der aktiven Oberfläche des Strömungskanals gehalten. Für den Off-Axis-Lichtkurs wird eine Gänsehalslampe verwendet.
  2. Verwenden Sie ein kommerzielles Mikroskop, eine Videokamera und eine Datenerfassungssoftware(Materialtabelle). Klicken Sie in der Software auf die Registerkarte "Belichtung" und legen Sie "Belichtungszeit" auf 10 ms fest. Klicken Sie auf "Timelapse" Tab und setzen Sie "Image Count" auf 600, "Duration" auf 20 min, und "Interval" auf 2 s. Klicken Sie auf "Ausführen", um die Datensammlung zu starten.
  3. Stellen Sie an einer Spritzenpumpe den Durchfluss auf 150 l/min und das Injektionsvolumen auf 80 l ein. Drücken Sie"Run" bei 1 min in die Datenerfassung. Schalten Sie nach dem Einspritzen die Pumpe aus und schließen Sie das Ventil, um den Fluss während der Datenerfassung zu verhindern.
  4. Sobald Daten gesammelt sind, öffnen Sie bildanalysesoftware (Tabelle der Materialien). Wählen Sie unter der Registerkarte "Datei" "Importieren | "Bildsequenz". Suchen Sie die Bilddateien im Popup-Menü und klicken Sie auf "Öffnen".
  5. Legen Sie den Schwellenwert fest, indem Sie "Thesholdanpassen " unter dem Pulldown-Menü "Image" auswählen. Verwenden Sie die Schiebereglerleiste, um den Schwellenwert festzulegen, um helle Flecken zu identifizieren, die Perlen im Bild entsprechen.
  6. Zählen Sie die hellen Flecken in jedem Frame, indem Sie im Pulldown-Menü "Analysieren" auf "Partikel analysieren" klicken. Klicken Sie auf "OK", und wählen Sie dann "Ja", um alle Bilder zu verarbeiten. Speichern Sie die Ergebnisdatei.
    HINWEIS: Dadurch wird eine Datendatei gespeichert, die die Anzahl der Perlen in jedem aufgezeichneten Videorahmen enthält.
  7. Öffnen Sie die Datenanalysesoftware (Tabelle der Materialien) und importieren Sie die Ergebnisdatei, indem Sie im Pulldown-Menü "Datei" auf "Aus Textdateiimportieren " klicken. Zeichnen Sie die Daten zur Anzahl der Perlen im Vergleich zur Zeit.
  8. Passen Sie die Anzahl der Perlen vs. Zeit an, indem Sie im Pulldown-Menü "Analysieren" auf "Kurvenanpassung" klicken. Wählen Sie die "Natural Exponent" Gleichung und klicken Sie auf "Try Fit" | "OK".
    HINWEIS: Nur die Daten, die nach der Injektion der Probe aufgezeichnet wurden, sollten in den Anpassungsbereich einbezogen werden. Der Anpassungsparameter im Exponenten der Fitting-Funktion ist die Dekolletérate.

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Ergebnisse

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Mit dieser Technik wurden die SSDC-Raten von NdeI für eine Reihe von Proteinkonzentrationen (0,25–4,00 U/ml) bei zwei verschiedenen Magnesiumkonzentrationen (2 mM und 4 mM) gemessen. Jede dieser Bedingungen wurde mindestens zweimal repliziert, mit ein paar hundert bis 1.000 gebundenen DNAs pro Experiment. Abbildung 2 beschreibt den experimentellen Entwurf. Abbildung 3 zeigt Beispiele für Datenerfassungs- und Analysedetails. Abbildung 4

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Diskussion

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Das Protokoll kann verwendet werden, um die Kinetik jedes SSDC-Systems zu messen, vorausgesetzt, dass die Strangtrennung während des Experiments beobachtet wird. Der Nachweis der Spaltung wird durch die Beobachtung der Ablösung der gefesselten Perle beeinflusst und markiert somit den Moment der Strangtrennung. Alle vorhergehenden Schritte erfolgen vor der Detektion der Spaltung; somit wird nur die gesamte Transitzeit erfasst.

Der Flow Cell Coverslip wird durch unspezifische Adsorption von Anti...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Stipendium MCB-1715317 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5 Minuten EpoxyDevcon14250
Anti-Digoxigenin FAB-FragmenteRoche Diagnostics11214667001
Kamera und SoftwareJenoptikGRYPHAX SUBRA
DatenanalysesoftwareVernier Inc.
doppelseitiges KlebebandGrace BiolabsSA-S-1L
Dulbeccos Phosphat gepufferte KochsalzlösungCorning21-031-CV
Ethanol 95%VWR89370-082
Vorwärts Primer: Digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGCIntegrated DNA Technologiesn/a
BildanalysesoftwareNational Institutes of HealthImageJ
inverses MikroskopNikonTE2000
MesserdruckerSilhouette
M13mp18 DNANew England BiolabsN4040S
MyOne Streptavidin-KügelchenThermo Fisher Scientific65601
NdeI-EnzymNew England BiolabsR0111S
PCR-ReinigungskitQiagen28104
pluronic F-127AnatraceP305
Polyethylenschlauch PE-20BD Intramedic427406
Polyethylenschlauch PE-60BD Intramedic427416
Q5 MastermixNew England BiolabsM0492S
Seltenerdmagnet 0,5" OD 0,25" IDNationale ImporteNSN0814
Seltenerdmagnet 0,75" OD 0,5" IDNationale ImporteNSN0615
Reverse Primer: Biotin-TGACCATTAGATACATTTCGCIntegrated DNA Technologiesn/a
SpritzenpumpeKent ScientificGenie Plus
β-Casein aus RindermilchSigma-AldrichC6905
LP

Referenzen

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Perlengebundene DNAmikrofluidischer FlusskanalDunkelfeldabbildungVideomikroskopieRestriktionsendonuklease NdeIexponentielle Fit Analysemagnetische PerlenbindungVorbereitung der Flusszelle

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