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Methodenartikel

Forward Genetic Screen Mit transgenem CalciumReporter Aequorin, um neuartige Ziele bei der Calciumsignalisierung zu identifizieren

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DOI:

10.3791/61259

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1. August 2020

 ,  ,  , 
1National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein vorwärtsgerichteter genetischer Screen, der auf der Ca2+-Höhe als Auslese basiert, führt zur Identifizierung genetischer Komponenten, die an kalziumabhängigen Signalwegen in Pflanzen beteiligt sind.

Zusammenfassung

Vorwärtsgenetische Screens waren wichtige Werkzeuge bei der unvoreingenommenen Identifizierung genetischer Komponenten, die an mehreren biologischen Pfaden beteiligt sind. Die Grundlage des Bildschirms ist es, eine mutierte Population zu erzeugen, die mit einem Phänotyp von Interesse gescreent werden kann. EMS (Ethylmethansulfonat) ist ein häufig verwendetes Alkylierungsmittel zur Induktion zufälliger Mutation in einem klassischen Vorwärts-Genbild, um mehrere Gene zu identifizieren, die an einem bestimmten Prozess beteiligt sind. Zytosololische Kalzium (Ca2+) Höhe ist ein wichtiger früher Signalweg, der bei der Stresswahrnehmung aktiviert wird. Die Identität von Rezeptoren, Kanälen, Pumpen und Transportern von Ca2+ ist jedoch in vielen Studiensystemen noch immer schwer fassbar. Aequorin ist ein zelluläres Kalziumreporter-Protein, das aus Aequorea victoria isoliert und stabil in Arabidopsis exprimiert wird. Unter Ausnutzung dieser, haben wir einen vorwärts genetischen Bildschirm entworfen, in dem wir EMS-mutagenisiert die Aequorin transgen. Die Samen der mutierten Pflanzen wurden gesammelt (M1) und screening für den Phänotyp von Interesse wurde in der Segrekung (M2) Population durchgeführt. Mit einem 96-Well-High-Throughput Ca2+ Messprotokoll können mehrere neuartige Mutanten identifiziert werden, die eine unterschiedliche Kalziumantwort haben und in Echtzeit gemessen werden. Die Mutanten mit dem Phänotyp von Interesse werden gerettet und vermehrt, bis eine homozygote mutierte Pflanzenpopulation gewonnen wird. Dieses Protokoll bietet eine Methode für vorwärtsgerichtete genetische Bildschirme im Ca2+-Reporterhintergrund und identifiziert neuartige Ca2+ regulierte Ziele.

Einleitung

Eine Veränderung der zytosolischen Kalziumkonzentration (Ca2+)bei wahrnehmungsgemäßem biotischem oder abiotischem Reiz ist ein gut untersuchtes frühentwickeltes Signalereignis, das viele Signalwege1,2,3,4aktiviert. Eine Zelle in ihrem basalen Ruhezustand behält eine niedrigere Ca2+-Konzentration im Cytosol und Sequester-Überschuss Ca2+ in verschiedenen intrazellulären Organellen und extrazellulären Apoplasten bei, was zu einem steilen Ca2+ Gradienten5,6führt. Bei der Signalwahrnehmung steigen ca2+-Spiegel im Cytosol aufgrund eines Zustroms von Ca2+ aus extrazellulären und/oder intrazellulären Quellen und erzeugen eine Reize spezifische Calciumsignatur7,8,9. Ca2+ Höhen im Cytosol werden durch viele Reize aktiviert, aber spezifität wird durch verschiedene Speicher, die Ca2+,eine einzigartige Ca2+ Signatur und geeignete Sensorproteine10,11.

Die Verwendung von Alkylierungsmittel, Ethylmethansulfonat (EMS) für die Mutagenese, ist ein leistungsfähiges Werkzeug in klassischen vorwärtsgenetischen Bildschirmen, um mehrere unabhängige Gene zu identifizieren, die an einem Prozess beteiligt sind. EMS ist ein chemisches Mutagen, das hauptsächlich C bis T und G zu A überführt, nach dem Zufallsprinzip im gesamten Genom übergeht und eine Veränderung von 1 bp in jedem 125 kb des Genoms erzeugt. Die EMS-Mutagenese induziert 1000 Einzelbasispaaränderungen, entweder Insertion/Deletionen (InDel) oder Single Nukleotide Polymorphism (SNP) pro Genom12. EMS-induzierte Mutationen sind mehrfache Punktmutationen mit einer Mutationshäufigkeit von 1/300 bis 1/30000 pro Ort. Dies reduziert die1 Anzahl der M 1-Pflanzen, die benötigt werden, um eine Mutation in einem bestimmten Gen zu finden. Ein M 1-Saatgut-Bevölkerungsbereich von 2000-3000 wird in der Regel verwendet, um Mutationen von Interesse in Arabidopsis thaliana13,14zu erhalten.1

Aequorin-Transgenen sind Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) Ökotyp-Pflanzen, die p35S-Apoaequorin (pMAQ2) im Cytosol15exdrücken. Aequorin ist2+ ein Ca 2+-Bindungsprotein, das aus Apoprotein und einer prothetischen Gruppe besteht, die aus Luziferinmolekül Coelenterazin besteht. Die Bindung von Ca2+ an Aequorin, das drei Ca2+ bindende EF-Hands-Standorte hat, führt dazu, dass Coelenterazin oxidiert und gecyclt wird, um das Dioxetanon-Zwischenprodukt zu erhalten, gefolgt von einer konformen Veränderung des Proteins, begleitet von der Freisetzung von Kohlendioxid und Singlet-erregtem Coelenteramid16. Das so erzeugte Coelenteramid strahlt einmaxblaues Licht aus, das durch das Leuchtkraftmesser17erfasst werden kann. Die extrem schnellen Ca2+ Höhen können so in Echtzeit gemessen und für schnelle vorwärts gerichtete genetische Abschirmungen genutzt werden. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Spezifität der Kalzium-Antwort zu nutzen, um neue Schlüsselakteure zu identifizieren, die an der Ca2+-Signatur beteiligt sind. Um diese Aufgabe zu erfüllen, verwenden wir EMS-Mutagenese in transgenem Aequorin und identifizieren die SNPs, die mit veränderter Ca2+-Signalisierung verbunden sind. Das Protokoll identifiziert Mutanten, die keine oder reduzierte Ca2+-Höhen bei Anuleaddition aufweisen. Diese Mutanten können dann kartiert werden, um die Gene zu identifizieren, die für die Ca2+-Antwort verantwortlich sind. Die Methode ist auf jede Art von flüssigen Reizen in Pflanzen anwendbar, die zu einer Ca2+ Höhe führt. Da ca2+ Höhe eine der ersten Reaktionen in der Pflanzenabwehr Signalweg ist, kann die Identifizierung von vorgelagerten Reaktionskomponenten Kandidaten für die Gentechnik liefern, um widerstandsfähige Pflanzen zu entwickeln.

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Protokoll

1. EMS-Mutagenese und Einzelstammbaum-basierte Saatgutsammlung (1-3 Monate)

  1. Wiegen Sie 150 mg Samen (7500) Aequorin für EMS-Mutagenese (M0 Samen). Wiegen Sie weitere 150 mg Samen als Kontrolle verwendet werden.
  2. Die Samen in ein 50 ml-Rohr geben und 25 ml 0,2% EMS (v/v) (VORSICHT) (zur Behandlung) oder 25 ml autoklaviertes Wasser (zur Kontrolle) hinzufügen.
    HINWEIS: Ethylmethansulfonat ist ein chemisches Mittel zur Erbeinung von Pflanzenmaterial.
  3. Versiegeln Sie das Rohr mit Parafilm und wickeln Sie es in Aluminiumfolie. Drehen Sie das Rohr Ende-über-Ende für 18 h bei Raumtemperatur.
  4. Lassen Sie die Samen absetzen. Entfernen Sie die EMS-Lösung sorgfältig und entsorgen Sie sie in einem Abfallbehälter mit 1 M NaOH in gleichen Mengen (NaOH hilft, EMS zu neutralisieren/inaktivieren, damit es sicher entsorgt werden kann). Entsorgen Sie die gebrauchten Kunststoffe in einer 1 M NaOH-Lösung.
    HINWEIS: Entsorgen Sie die Rückwürfe nach 24 h gemäß den Laborverfahren für gefährlicheS Material.
  5. Waschen Sie die mutagenisierten Samen mindestens 8 Mal mit 40 ml autoklavierten Wassers gründlich. Entsorgen Sie EMS, das Wasser in einem NaOH-Abfallbehälter enthält, wie oben erwähnt.
  6. Für die Endwäsche 40 ml 100 ml Natriumthiosulfat hinzufügen und 3 Mal ausspülen, um Emsspuren zu entfernen.
  7. Die Samen in 40 ml autoklaviertem Wasser für 1 h einweichen, um EMS aus den Samen zu diffundieren, und legen Sie sie dann auf Filterpapier, bis sie vollständig trocken sind.
  8. Die Samen in ein Mikrozentrifugenrohr geben und die Samen bei 4 °C in 40 ml autoklaviertem Wasser für 2-4 Tage schichten. Dies hilft bei der Bruch samenRuhe und sorgt für homogenes Wachstum.
  9. Übertragen Sie sowohl die mutagenisierten Samen (M0) als auch die Kontrollsamen auf den Boden (Bodenzusammensetzung: Agropet: Bodenrit, 1:1) und übertragen Sie sie in Wachstumsräume mit einer 16 h hellen/8 h dunklen Photoperiode, einer Lichtintensität von 150 molm, 2s1 und 70% relative Luftfeuchtigkeit.
  10. Um festzustellen, ob die Mutagenese erfolgreich war, achten Sie auf eine reduzierte Keimgeschwindigkeit und das Kornlingswachstum und die Chlorophyll-Sektorierung18 (Abbildung 1A). Vergleichen Sie die mutagenisierten Pflanzen mit den Kontrollpflanzen, um diese physiologischen und Entwicklungsunterschiede zu identifizieren.
    HINWEIS: Für die Ernte von Samen aus M1-Pflanzen können verschiedene Methoden verwendet werden. In diesem Protokoll haben wir die Single-Stammbaum-basierte Saatgutsammlungsmethode verwendet. Jede M1-Anlage erhält eine eindeutige Nummer, beginnend von A1 bis A3500.
  11. Bewahren Sie einzeln nummerierte Pflanzen als diskrete Anlagenlinien auf (Abbildung 1B).
  12. Nach der Reifung Samen aus diesen einzelnen mutierten Pflanzen ernten und als einzelne M1-Linien lagern (Abbildung 2). Aus der einzelnen Stammbaum-basierten Saatgutsammlung erhielten wir rund 5000 M1 Linien, von denen 3500 M1 Linien abgeschirmt wurden.

2. Hochdurchsatz-Screening zur Auswahl von Mutanten (8 Monate)

  1. Identifizieren Sie neue Mutanten basierend auf der Ca2+-Antwort auf einen ausgewählten Stimulus. Hier haben wir H2O2 als Beispiel verwendet.
  2. Zur Identifizierung von Mutanten wird die M2-Generation überprüft. Da sich rezessive Mutanten bei 1/8-Frequenz in der Generation M2 nach EMS-Mutagenese14trennen, deckt das Screening von 8-12 M2-Segrederpflanzen eine2M1-Linie ab und identifiziert einen homozygoten rezessiven Mutanten (mit 12 Sämlingen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, einen Mutanten zu finden). Testen Sie von jeder unabhängigen M1-Linie 12 M2 Sämlinge auf Ca2+-Antwort auf H2O2 (12 M2 Sämlinge pro M1 Linie).
  3. Verwenden Sie eine hochdurchsatzhohe Samensterilisation und hydroponisches Pflanzenwachstumsprotokoll19. Fast 12-15 M2 Samen pro M1 Linie in einzelne Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte legen und mit Chlorgas (40 ml 12% Natriumhypochlorit und Salzsäure, 3:1, v/v) in einem Trockenhaus für 4 h in einer Dunstabzugshaube sterilisieren. Öffnen Sie nach dem Eingriff den Trockenbau und lassen Sie ihn über Nacht, damit Chlorgas verdunstet.
  4. Nach der Sterilisation Platten nach draußen bringen und flüssige 1/2 MS-Medien (halbfeste MS ohne Agar) in einzelne Brunnen geben. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm und schichten Sie die Samen für 2-4 Tage bei 4 °C und bewegen Sie dann Dies in eine Wachstumskammer mit 10 h Licht / 14 h dunkle Photoperiode bei 20-22 °C mit 70% relativer Luftfeuchtigkeit.
  5. Sobald die Sämlinge 8-12 Tage alt sind, legen Sie 12 M2 Sämlinge aus jeder Linie einzeln in eine 96-Well-Leuchtkraftplatte. Verwenden Sie zur Messung des Ca2+-Ansprechs auf H2O2einen Luminometer-Plattenleser.
  6. Nach der Setzlingsübertragung 150 l 5-10 M Coelentrazin-Lösung (in autoklaviertem Wasser aus einem 5 mM-Bestand in Methanol verdünnt) (VORSICHT) in einzelne Brunnen in einem dunklen/schwachlichten Bereich geben und bei 21 °C 8 h im Dunkeln lagern.
    HINWEIS: Coelentrazin ist eine prothetische Gruppe, die an Apo-Aequorin bindet und es zu funktionellem Aequorin umbildet. Coelentrazin ist lichtempfindlich und wird daher in dunkel gefärbten Flaschen gelagert, die vor Licht geschützt sind.
  7. Führen Sie am nächsten Tag einen mutierten Bildschirm mit 10 mM H2O2 als Stimulus aus und messen Sie die anschließende Ca2+-Antwort.
  8. Für die gleichzeitige Messung von 24 Bohrwerten können Sie ein automatisiertes kinetisches Programm erstellen, das den Hintergrund für 1 min misst, gefolgt von Reizzugabe (40 l) und Messung für 10 min, gefolgt von einer Gesamtaquorinentladung (2 M CaCl2 in 150 l 20% Ethanol) für 1-2 min.
    ANMERKUNG: Zur Quantifizierung des gemessenen Ca2+ und als zusätzliche Kontrolle für funktionelles Aequorin ist eine Endentladung für das gesamte Aequorin erforderlich. Die Endentladung ist eine kurze Laufzeit von 1-2 min und verursacht keinen signifikanten Pflanzentod. Alternativ können die Pflanzen nach dem Entladungsschritt absterben, dann die spezifische M1-Leitung erneut abschirmen und ohne Entladung retten. Solche Mutanten können in M3- und M4-Generationen mit dem Entladungsschritt bestätigt werden.
  9. Verwenden Sie eine Scanmethode im 24-Well-Format, die jede Zeile im 7-s-Intervall mit 300 ms Integrationszeit pro Messpunkt misst. Verwenden Sie einen Wildtyp sämungsmittel als Steuerelement in jeder Zeile für den Vergleich und die Auswertung der Mutante.
    HINWEIS: Eine einzelne 96-Well-Platte mit M2 Sämlingen deckt 8 einzelne M1-Linie (8 M1*12= 96 M2) ab und kann in 2,5 h gesiebt werden und jeden Tag würden 32 M1 Linien gesiebt, 640 M1 Pflanzen pro Monat. Das gesamte Screening-Verfahren, nachdem die Pflanzen fertig sind, würde etwa 8 Monate dauern.
  10. Identifizieren Sie Mutanten basierend auf dem Verlust oder reduzierten Ca2+ Antwort mit H2O2. Retten Sie die ausgewählten Mutanten durch einen antibiotischen Waschprozess. Waschen Sie den Sämling mit 25 mg/L Cefotaxame Lösung zweimal und dann auf Rettungsmedium übertragen, das 25 mg/L Cefotaxme in 1/2 MS Agar enthält.
  11. Wachsen Sie die Platten bei einem 10 h Licht / 14 h dunkle Photoperiode, um eine mutierte Pflanze zu erhalten. Die Cefotaxame-Waschanlage hilft, schädliche Mikroorganismen am Sämling zu entfernen. Da die Sämlinge nach der Rekonstitution unversiegelt gehalten werden, minimieren Sie die Kontamination, wenn sie wieder in einen sterilen Zustand zurückversetzt werden.
  12. Übertragen Sie die mutierte Pflanze auf den Boden, um die homozygote M3-Population zu erhalten.

3. Datenanalyse und Mutantenidentifikation (1-3 Monate)

HINWEIS: Die Messwerte der obigen Methode sind in relativen Lichteinheiten (RLU) angegeben.

  1. Für die Berechnung der [Ca2+]Zytkonzentration verwenden Sie die folgende Konzentrationsgleichung20.
    pCa = 0,332588(-log (L/Lmax))+ 5,5593
    Lumineszenzzählungen () und gesamtzahlshaltig (max ).
  2. Konvertieren Sie die erhaltenen pCa-Werte in [Ca2+]Cyt-Werte in M, indem Sie mit 106multiplizieren. Dann grafisch gegen eine Aequorin (transgene Col-0 aequorin) Steuerung zur Identifizierung vonvermeintlichenH 2 O2 Mutanten auf Ca2+ Antwort.
  3. Rettungssämlinge, die einen Verlust oder eine reduzierte Reaktion auf H2O2 Anwendung gerettet zeigen.
  4. Nach der Reifung Samen von der geretteten Mutante ernten und auf H2O2 in M3 Sämlinge reagieren. Wenn alle 12 M3 Sämlinge eine Ca2+-Antwort aufweisen, die der Mutterpflanze ähnelt, betrachten Sie die Population als eine homozygote M3-mutierte Population. Wenn alle 12 Sämlinge nicht eine solche Antwort zeigen, dann nehmen Sie sie zu M4 Generation und re-screen, um homozygote Bevölkerung zu erhalten.
  5. Sobald eine homozygote Pflanzenlinie erhalten wurde, identifizieren Sie das Gen, das zu einem veränderten Phänotyp führt, indem Sie die Nächste Generation sequenzieren.

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Ergebnisse

Die EMS-Population wurde auf H2O2 induzierte Ca2+ Höhe untersucht. Wie bereits erwähnt, wurden aus jeder M1-Linie 12 einzelne M2 Sämlinge gescreent. In Abbildung 3wird eine solche M1-Linie mit jedem Panel dargestellt, das 12 einzelne M2 Sämlinge zeigt. Ein Wildtyp-Aequorin wird als Steuerung für den Vergleich und die Bewertung der mutierten Reaktion verwendet. Eine rezessive Mutante trennt sich im Verhältnis 1:7 (Mu...

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Diskussion

EMS-Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Mutationen in der Population zu erzeugen. Die klassischen Vorwärts-Gen-Screens, die EMS verwenden, waren aus zwei Hauptgründen ein wirksames Instrument, um neuartige Gene zu identifizieren: Erstens erfordern sie keine vorherigen Annahmen über die Genidentität, und zweitens führen sie keine Verzerrung ein. Es gibt mehrere Methoden, um ein Screening-Populationen wie EMS, T-DNA-Einfügungen, Strahlungen usw. zu erzeugen. Von allen Methoden hat die EMS-basierte Mutagenese n...

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Offenlegungen

Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Wir danken dem National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility for plant growth, Bombay Locale für das Videoshooting und dem Department of Biotechnology- eLibrary Consortium für den Zugang zu E-Ressourcen. Diese Arbeit wurde vom Department of Biotechnology, Indien durch das National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max-Planck Gesellschaft-India Partner Group-Programm, unterstützt; und CSIR-Junior Research Fellowship (zu D.M und S.M) und Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (zu R.P).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Well-GewebekulturplatteJetbiofil11024für den Anbau von Sämlingen
96-Well-Weiß-CliniplateThermo Scientific9502887für Luminometer-Messungen
Aequorin
AgropetLab Chem Indiafür das Pflanzenwachstum
CalciumchloridFisher Scientific12135für die Entleerung Lösung
CoelenterazinPJK55779-48-1Prothesengruppe für Aequorin
EhtylmethansulfonatSigma AldrichM0880-5Gfür die Samenmutagenese
EthanolAnalysereagenz1170für die Entladungslösung
SalzsäureMerck Life Sciences1.93001.0521Versterlungslösung
WasserstoffperoxidFisher Scientific15465als Stimulus für die Kalziumerhöhung
Luminoskan-AufstiegThermo Scientific5300172Aequorin-Lumineszenzmessung
MES-PufferHimediaRM1128-100GPflanzenwachstum
Murashige und skoog mediaHimediaPT021-25LPflanzenwachstum
NatriumhydroxidFisher Scientific27805zur Neutralisierung EMS
NatriumhypochloritMerck Life Sciences1.93607.5021Versterlungslösung
NatriumthiosulfatFisher Scientific28005zum Waschen von Saatgut in Schritt 1.6
soilriteLab Chem Indiafür das Pflanzenwachstum
QuadrattöpfeLab Chem Indiafür das Pflanzenwachstum
SaccharoseSigma AldrichS0389Pflanzenwachstum
TaximAlkem7180720zur Rettung von Sämlingen

Referenzen

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