Methodenartikel

Ein verbessertes Protokoll zur Reinigung und direkt Mono-Biotinylat Rekombinanten BDNF in einer Tube für Zelllandhandel Studien in Neuronen

DOI:

10.3791/61262

⸱

11. Juli 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinantes BDNF, das eine Avi-Sequenz (BDNFAvi) enthält, wird in HEK293-Zellen kostengünstig hergestellt und durch Affinitätschromatographie gereinigt. BDNFavi wird dann direkt mit dem Enzym BirA in einer Röhre mono-biotinyliert. BDNFavi und monobiotinyd BDNFavi behalten ihre biologische Aktivität im Vergleich zu kommerziell erhältlichen BDNF.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinantes BDNF, das eine Avi-Sequenz (BDNFAvi) enthält, wird in HEK293-Zellen hergestellt und dann kostengünstig durch Affinitätschromatographie gereinigt. Ein reproduzierbares Protokoll wurde entwickelt, um BDNFAvi direkt mit dem Enzym BirA in einer Röhre zu monobiotinylatieren. In dieser Reaktion behält monobiotinylierte BDNFAvi seine biologische Aktivität bei.

Neurotrophine sind zielorientierte Wachstumsfaktoren, die eine Rolle bei der neuronalen Entwicklung und Wartung spielen. Sie erfordern schnelle Transportmechanismen entlang des endozytischen Weges, um Fernsignale zwischen verschiedenen neuronalen Kompartimenten zu ermöglichen. Die Entwicklung molekularer Werkzeuge zur Untersuchung des Handels mit Neurotrophinen hat die präzise Verfolgung dieser Proteine in der Zelle mit Hilfe von In-vivo-Aufnahmen ermöglicht. In diesem Protokoll haben wir ein optimiertes und kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von monobiotinyliertem BDNF entwickelt. Eine rekombinante BDNF-Variante, die eine biotinylable Avi-Sequenz (BDNFAvi) enthält, wird in HEK293-Zellen im Mikrogrammbereich hergestellt und dann in einem leicht skalierbaren Verfahren mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Der gereinigte BDNF kann dann durch eine direkte In-vitro-Reaktion mit dem Enzym BirA in einer Röhre homogen mono-biotinyliert werden. Die biologische Aktivität des monobiotinylierten BDNF (mbtBDNF) kann zu Streptavidin-konjugiert werden. BDNFAvi und mbtBDNF behalten ihre biologische Aktivität, die durch den Nachweis nachgeschalteter phosphorylierter Targets unter Verwendung von Western Blot bzw. Aktivierung des Transkriptionsfaktors CREB nachgewiesen wurde. Mit Streptavidin-Quantenpunkten konnten wir mbtBDNF-Internalisierung gleichzeitig mit der Aktivierung von CREB visualisieren, die mit einem Phospho-CREB-spezifischen Antikörper nachgewiesen wurde. Darüber hinaus eignete sich mbtBDNF konjugiert zu Streptavidin-Quantenpunkten für retrograde Transportanalysen in kortikalen Neuronen, die in mikrofluidischen Kammern angebaut wurden. So ist mbtBDNF in Derröhre ein zuverlässiges Werkzeug, um physiologische Signalisierungsdynamik und Handel mit Neuronen zu untersuchen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronen sind die funktionellen Einheiten des Nervensystems, die über eine komplexe und spezialisierte Morphologie verfügen, die synaptische Kommunikation und damit die Erzeugung von koordiniertem und komplexem Verhalten als Reaktion auf verschiedene Reize ermöglicht. Neuronale Projektionen wie Dendriten und Axone sind kritische strukturelle Merkmale, die in der neuronalen Kommunikation beteiligt sind, und Neurotrophine sind entscheidende Akteure bei der Bestimmung ihrer Morphologie und Funktion1. Neurotrophine sind eine Familie von sezernierten Wachstumsfaktoren, die NGF, NT-3, NT-4 und Gehirn-abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF)2umfassen. Im Zentralnervensystem (ZNS) beteiligt sich BDNF an verschiedenen biologischen Prozessen wie Neurotransmission, dendritische Arborisierung, Reifung der dendritischen Stacheln, Langzeitpotenzierung, unter anderem3,4. Daher spielt BDNF eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der neuronalen Funktion.

Verschiedene zelluläre Prozesse regulieren die Dynamik und Funktion des BDNF. Auf der neuronalen Oberfläche bindet BDNF die Tropomyosin-Rezeptorkinase B (TrkB) und/oder den p75-Neurotrophinrezeptor (p75). BDNF-TrkB und BDNF-p75 Komplexe sind endocytosed und sortiert in verschiedenen endozytischen Organellen5,6,7,8. Korrekter intrazellulärer Handel des BDNF/TrkB-Komplexes ist für die korrekte BDNF-Signalisierung in verschiedenen neuronalen Schaltkreisen9,10,11erforderlich. Aus diesem Grund ist ein tiefes Verständnis der BDNF-Handelsdynamik und ihrer Veränderungen in pathophysiologischen Prozessen unerlässlich, um BDNF-Signale in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Die Entwicklung neuer und spezifischer molekularer Instrumente zur Überwachung dieses Prozesses wird dazu beitragen, diesen Bereich voranzubringen und ein besseres Verständnis der beteiligten Regulierungsmechanismen zu ermöglichen.

Es gibt mehrere Werkzeuge für die Studie des BDNF-Handels mit Neuronen. Eine häufig verwendete Methodik beinhaltet die Transfektion von rekombinantem BDNF, das mit fluoreszierenden Molekülen wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder der monomeren fluoreszierenden rot verschiebbaren Variante von GFP mCherry12,13getaggt ist. Jedoch, ein großes Manko der BDNF Überexpression ist, dass es die Möglichkeit der Bereitstellung bekannter Konzentrationen dieses Neurotrophin eliminiert. Auch, Es kann zu zellulären Toxizität führen, verdecken die Interpretation der Ergebnisse14. Eine alternative Strategie ist die Transfektion eines mit Epitopen markierten TrkB, wie Flag-TrkB. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der TrkB Internalisierungsdynamik15, aber es beinhaltet auch Transfektion, die zu veränderten TrkB-Funktion und zellulärer Toxizität führen könnte. Um diese methodischen Hürden zu überwinden, wurden rekombinante Varianten von NGF und BDNF mit einer Avi-Sequenz (BDNFAvi), die durch das Biotinligase-Enzym BirA monobiotinyliert werden kann,entwickelt 16,17. Biotinyliertes rekombinantes BDNF kann mit verschiedenen Streptavidin-gebundenen Werkzeugen gekoppelt werden, darunter Fluorophore, Perlen, paramagnetische Nanopartikel, unter anderem zum Nachweis. In Bezug auf die Live-Zell-Bildgebung sind Quantenpunkte (QD) häufig verwendete Fluorophore geworden, da sie wünschenswerte Eigenschaften für die Verfolgung von Einzelpartikeln haben, wie erhöhte Helligkeit und Beständigkeit gegen Photobleichungen im Vergleich zu kleinen Molekülfluorophoren18.

Die Produktion von monobiotinyliertem BDNF (mbtBDNF) mit BDNFAvi wurde durch ko-Transfektion von Plasmiden erreicht, die die Expression von BDNFAvi und BirA antreiben, gefolgt von der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Affinitätschromatographie mit einer Ausbeute von 1-2 g BDNF pro 20 ml HEK293-konditionierte Kulturmedien17. Hier schlagen wir eine Änderung dieses Protokolls vor, die eine BDNFAvi-Reinigung von 500 ml HEK293-konditionierten Medien ermöglicht, die darauf abzielt, die Proteinrückgewinnung in einem chromatographie-spaltenbasierten Protokoll zu maximieren, um die Manipulation zu erleichtern. Das verwendete Transfektionsmittel Polyethylenimimin (PEI) sorgt für ein kostengünstiges Verfahren ohne Einbußen bei der Transfektionsausbeute. Der Monobiotinylisierungsschritt wurde an eine In-vitro-Reaktion angepasst, um die Mittransfektionen zu vermeiden und eine homogene Kennzeichnung von BDNF zu gewährleisten. Die biologische Aktivität des mbtBDNF wurde durch western blot und fluorescence mikroskopische Experimente demonstriert, einschließlich der Aktivierung von pCREB und Live-Zell-Bildgebung, um retrograde axonale Transport von BDNF in mikrofluidischen Kammern zu untersuchen. Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht eine optimierte, ertragreiche Produktion homogener monobiotinylierter und biologisch aktiver BDNF.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Leitlinien von CONICYT (Chilean National Commission for Scientific and Technological Research) durchgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Protokolle wurden von den Ausschüssen für Biosicherheit und Bioethik und Tierschutz der Pontificia Universidad Catélica de Chile genehmigt. Versuche mit Wirbeltieren wurden vom Ausschuss für Bioethik und Tierschutz der Pontificia Universidad Catélica de Chile genehmigt.

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde entwickelt, um BDNFAvi von einem Gesamtvolumen von 500 ml konditioniertem Medium zu reinigen, das in HEK293-Zellen hergestellt wird. Die Menge an konditioniertem Medium, das zur Reinigung von BDNFAvi produziert und verarbeitet wird, kann bei Bedarf hoch- oder herunterskaliert werden. Unter diesen Umständen kann jedoch eine weitere Optimierung erforderlich sein. Die Zusammensetzung der Kulturmedien und Puffer, die im gesamten Protokoll verwendet werden, finden sich in ergänzenden Materialien.

1. Herstellung und Reinigung von BDNFAvi aus HEK293-konditionierten Medien

  1. Transfektion von HEK293-Zellen
    1. Wachsen Sie HEK293-Zellen bis 70% Zusammenfluss in ergänztem DMEM-Medium (10% Rinder-fetales Serum, 1x Glutamat-Ergänzung, 1x Antimycotic) in 15 cm Kulturgerichten bei 37 oC.
    2. Ändern Sie das Medium in den Transfektionspuffer.
    3. Bereiten Sie die PEI-DNA-Mischung für die Transfektion vor. Verwenden Sie zwei verschiedene 15 ml konische Röhren, um DNA bzw. PEI 25 K zu verdünnen. Verdünnen Sie 20 g Plasmid-DNA in einem Endvolumen von 500 l in einem Röhrchen. Verdünnen Sie 60 g lineares PEI 25K in einem Endvolumen von 500 l in der anderen Röhre. Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
    4. Pipette die DNA-Lösung vorsichtig in das PEI-Rohr, einmal durch Up-Down-Bewegung mischen. Bei Raumtemperatur 25 min inkubieren.
    5. 1 ml der PEI-DNA-Mischung durch jede 15 cm Schale abtropfen lassen. Inkubieren Sie die Zellen mit der PEI-DNA-Mischung für 3 h bei 37 oC.
    6. Ändern Sie den mittleren in einen neuen Inkubationspuffer.
  2. Mediensammlung und -speicherung
    1. Sammeln Sie das Medium von allen Gerichten 48 h nach der Transfektion von HEK293 Zellen. Bereiten Sie konzentrierte Bestände der Lösungen vor, die im Abschnitt "Überstand-Modifikationspuffer" der Zusatzdatei 1 beschrieben sind, und fügen Sie sie dem HEK293-Überstand hinzu, um die aufgeführten Endkonzentrationen zu erreichen.
      HINWEIS: Zellen können zur weiteren Analyse verworfen oder wiederhergestellt werden.
    2. Inkubieren Sie das Medium im Eis für 15 min.
    3. Aliquot das Medium in Zentrifugenröhren.
    4. Zentrifugieren Sie das Medium bei 10.000 x g für 45 min in einer 4 °C Zentrifuge. Dieser Schritt ermöglicht die Beseitigung von Zellablagerungen und abgestorbenen Zellen, die in den Medien ausgesetzt sind.
    5. Sammeln Sie die Überräube, fügen Sie BSA bei einer endletzten Konzentration von 0,1%. und dann bei -20 °C lagern. Die Medien können vor dem Einfrieren für ein schnelleres Auftauen während des Reinigungsschritts aliquotediert werden.
      HINWEIS: Lagerzeiten von gefrorenen konditionierten Medien von bis zu 2 Monaten haben zu positiven Ergebnissen geführt, längere Lagerzeiten wurden nicht ausgewertet.
  3. Medienkonzentration und -reinigung
    1. Das Medium in einem 37 °C thermoregulierten Bad auftauen.
    2. Aliquot die Medien in Zentrifugenröhren.
    3. Zentrifugieren Sie das Medium für 1 h bei 3.500 x g in einer 4 °C gekühlten Zentrifuge. Dieser Schritt ermöglicht die Beseitigung der verbleibenden Zellablagerungen, um einen ausreichenden Durchfluss durch die Chromatographiesäule zu gewährleisten.
    4. Verwenden Sie die Proteinkonzentratoren mit einem 10 kDa Cutoff, um die Medien von 500 ml auf 100 ml zu reduzieren. Befolgen Sie die vom Hersteller empfohlenen Zentrifugationsparameter für eine optimale Konzentration.
    5. Fügen Sie den konzentrierten Medien 500 L Ni-NTA-Agaroseperlen hinzu und in einer Wippe über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    6. Montieren Sie das Chromatographiegerät und gießen Sie die Medien hinein. Lassen Sie es für 5 min ruhen und öffnen Sie dann den 2-Wege-Stopphahn, um das Medium durchfließen zu lassen.
    7. Waschen Sie die Perlen mit 5 ml Waschpuffer für 5 min. Achten Sie darauf, die Perlen in der Säule wieder auszusetzen. Entleeren Sie den Waschpuffer, indem Sie den 2-Wege-Stopphahn öffnen. Wiederholen Sie dies 3 Mal.
    8. Fügen Sie der Spalte 1 ml Elutionspuffer hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in der Spalte erneut angehalten werden. 15 min inkubieren und dann das Eluat in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr sammeln. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal für die vollständige Elution von BDNFAvi.
    9. Laden Sie jeweils 5 l l und verschiedene Konzentrationen von handelsüblichem BDNF (40-160 ng) in ein 15% Polyacrylamid-Gel. Erkennen Sie das gereinigte Protein durch Western-Blotting mit einem Anti-BDNF-Antikörper.
    10. Bestimmen Sie die Konzentration des gereinigten BDNFAvi in jedem Eluat anhand der mit dem handelsüblichen BDNF erstellten Konzentrationskurve.
    11. Aliquot und lagern Sie den gereinigten BDNFAvi bei -80 °C.

2. In vitro In-vitro-Monobiotinylierung von BDNFAvi mit dem BirA-Enzym

  1. In vitro In-vitro-Monobiotinylierungsreaktion
    1. Bereiten Sie konzentrierte Lagerlösungen der Biotinylierungspufferreagenzien vor. Die Verwendung konzentrierter Bestände wird die Verdünnung des rekombinanten Proteins minimieren.
    2. Nehmen Sie ein Aliquot von 800 ng BDNFAvi und fügen Sie die Biotinylierungspufferreagenzien und das Enzym BirA in einem 1:1-Molaren-Verhältnis zu BDNF hinzu. Zum Beispiel für eine 200 L Endreaktionsvolumen hinzufügen; 100 l Lösung mit 800 ng BDNFAvi, 20 l Bicine 0,5 M pH 8,3, 20 l ATP 100 mM, 20 l MgOAc 100 mM, 20 l d-Biotin 500 m, 0,8-1 bis 1 l BirA-GST und komplett auf 200 l mit Ultrareinstwasser.
      HINWEIS: Erfolgreiche Biotinylierungsreaktionen wurden mit Aliquots von 400 l durchgeführt, die eine Konzentration von etwa 30 ng/L BDNFAvi enthielten, was zu einer homogen biotinylierten BDNFAvi zu einer Endkonzentration von 20 ng/l in der Endreaktion führte.
    3. Inkubieren Sie die Mischung bei 30 °C in einem Hybridisierungsofen für 1 h. Mischen Sie den Inhalt durch Rohrinversion alle 15 min.
    4. Fügen Sie das gleiche Volumen von ATP und BirA wie in Schritt 2.1.2 hinzu und wiederholen Sie Schritt 2.1.3.
    5. Bei -80 °C für zukünftige Analysen aufbewahren oder für den sofortigen Gebrauch auf Eis halten (z.B. Qualitätskontrolle der Biotinylierung).
  2. Biotinylierungsanalyse
    1. Block 30 l Streptavidin magnetische Perlen pro BDNF-Probe in 1 ml Sperrpuffer. Inkubieren Bei Raumtemperatur für 1 h in einem Mikrozentrifugenrohrrotator.
    2. Die magnetischen Perlen mit einem magnetischen Trennträger für 3 bis 5 Minuten oder bis der Puffer vollständig von den Perlen gelöscht erscheint, austreten und den Sperrpuffer entsorgen.
    3. Fügen Sie den Perlen 50 L frischen Sperrpuffer und 80 ng monobiotinylierte BDNFAvi (mbtBDNF) Probe hinzu, um sie vollständig durch Rohrleitung wieder auszusetzen.
    4. Inkubieren Bei 4 °C für 1 h in einem Mikrozentrifugenrohrrotator, der sich bei ca. 20 U/min dreht.
    5. Sammeln Sie die Perlen mit dem magnetischen Trennträger für 3 bis 5 Minuten, und sammeln Sie den Überstand, wobei ein 30 L Aliquot für die Analyse gehalten wird.
    6. Waschen Sie die Perlen einmal mit 500 L PBS, und sammeln Sie sie dann mit dem magnetischen Trennträger für 3 bis 5 Minuten. Stellen Sie den Überstand wieder her und halten Sie einen 30-L-Aliquot für die Analyse.
    7. Fügen Sie den Perlen 10 L 4x Ladepuffer hinzu.
    8. Erhitzen Sie die Proben auf 97 °C für 7 min, um den mbtBDNF zu elute.
    9. Detektieren MbtBDNF mit einem Anti-BDNF-spezifischen Antikörper19.

3. Überprüfung der biologischen Aktivität von mbtBDNF

  1. Detektion von pTrkB und pERK durch Western Blot.
    1. Samen 2 Millionen Ratte kortikale Neuronen in 60 mm Kulturgerichte.
    2. Kultur die Neuronen für 7 Tage (DIV7). Ändern Sie dann das Medium zu nicht-supplementierten neurobasalen Mediun, wenn Sie das Experiment starten.
    3. Eine Stunde nach mittlerem Wechsel, fügen Sie mbtBDNF zu einer endgültigen Konzentration von 50 ng/ml hinzu. 30 min bei 37 oC inkubieren. Bewahren Sie eine negative Kontrollschale (nicht stimuliert mit BDNF) und eine Positivkontrollschale (behandelt mit 50 ng/ml handelsüblichen BDNF).
    4. Sammeln Sie das Medium und waschen Sie jede Schale vorsichtig mit 1x PBS. Sammeln und entsorgen Sie die 1x PBS.
    5. Legen Sie die Gerichte auf Eis und fügen Sie 50-80 L LysePuffer zu jedem Gericht. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu lysieren.
      HINWEIS: Der Lyseschritt sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, um Proteindephosphorylierung und Abbau zu vermeiden. 1-2 Minuten kräftiges Kratzen reichen aus, um die Proteine von Interesse durch western Blotting zu visualisieren.
    6. Sammeln Sie den Lysepuffer und rühren Sie einen Wirbelmischer mit höchster Geschwindigkeit für 5 s.
    7. Zentrifugieren Sie den Lysepuffer bei 14.000 x g (4 °C) für 10 min. Den Überstand sammeln.
    8. Quantifizieren Sie den Proteingehalt des Überstandes durch bcA-Proteinquantifizierungsprotokoll20.
    9. Fügen Sie einen Ladepuffer zu einem Aliquot hinzu, der 30-50 g Protein pro Zustand enthält, und laden Sie es in ein 12% Polyacrylamid-Gel für die westliche Blotting. Nachweis von pTrkB und pERK mit spezifischen Phospho-Antikörpern zur Überprüfung der biologischen Aktivität von BDNFAvi.
  2. Überprüfung der biologischen BdNF-QD-Aktivität durch pCREB-Immunfluoreszenz.
    1. Samen 40.000 kortikale Minenkern in 10 mm Abdeckungen, zuvor autoklaviert und mit Poly-L-Lysin behandelt, wie zuvor beschrieben21.
    2. Kultur die Neuronen für 7-8 Tage in neuronalen Erhaltungspuffer (siehe zusätzliche Materialien) bei 37 oC.
    3. Um das Experiment zu starten, ändern Sie das Medium auf ein unkompestiertes neurobasales Medium und brüten bei 37 oC für 1 h.
    4. Bereiten Sie mbtBDNF konjugiert mit Quantenpunkten (BDNF-QD) vor, indem Sie zu einem mbtBDNF aliquot das notwendige Volumen des Quantenpunkt-Streptavidin-Konjugats (Streptavidin-QD) hinzufügen, um ein 1:1 BDNF-QD-Molar-Verhältnis zu erreichen. Dann mit neurobasalem Medium auf 20 l verdünnen. Wickeln Sie das Rohr in Aluminiumfolie, um es vor dem Licht zu schützen.
      ANMERKUNG: Bereiten Sie eine weitere Röhre mit dem gleichen Volumen von Quantenpunkt-Streptavidin-Konjugat vor und verdünnen Sie sie auf 20 l mit neurobasalem Medium als Negativkontrolle.
    5. Die mbtBDNF/ streptavidin-QD-Mischung 30 min bei Raumtemperatur in einer Wippe inkubieren.
    6. Den BDNF-QD im neurobasalen Medium auf die gewünschte Endkonzentration (200 pM und 2 nM) verdünnen.
    7. Nach 1 h Inkubation mit nicht-supplementiertem neurobasalen Medium, stimulieren Sie die Neuronen mit BDNF-QD oder Streptavidin-QD (Kontrolle) zu einer Endkonzentration von 200 pM und 2 nM BDNF für 30 min bei 37 °C.
    8. Waschen Sie die Deckellipsen dreimal mit 1x PBS (37 °C) und fixieren Sie die Zellen 15 min, indem Sie den Deckelmitrutsch mit 4% Paraformaldehydlösung behandeln, die Phosphatase-Inhibitoren enthält.
    9. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS und inkubieren Sie dann mit Blockierung/Permeabilisierungspuffer (BSA 5%, Triton X-100 0.5%, 1x Phosphatase-Inhibitor) für 1 h.
    10. Inkubieren Sie mit Anti-PCREB-Antikörper 1:500 (in 3% BSA, 0,1% Triton X-100) über Nacht bei 4 °C.
    11. Am nächsten Tag 3 mal mit 1x PBS waschen und 1 h mit dem Sekundärantikörper 1:500 (3% BSA, 0,1% Triton X-100) inkubieren.
    12. Waschen Sie 3 mal mit 1x PBS. Fügen Sie Hoechst Kernflecklösung (5 g/ml) für 7 min.
    13. Waschen Sie 3 mal mit 1x PBS und montieren.
  3. Visualisierung des retrograden axonalen Transports von BDNF-QD in lebenden Neuronen
    1. Bereiten Sie mikrofluidische Kammern und Samenneuronen wie zuvor beschrieben16.
    2. Nach 7-8 Tagen in der Kultur, ändern Sie das Medium zu nicht-supplementierten neurobasalen Medium.
    3. Bereiten Sie mbtBDNF konjugiert mit Quantenpunkten (BDNF-QD) vor, indem Sie zu einem mbtBDNF aliquot das notwendige Volumen des Quantenpunkt-Streptavidin-Konjugats (Streptavidin-QD) hinzufügen, um ein 1:1 BDNF-QD-Molar-Verhältnis zu erreichen. Dann mit neurobasalem Medium auf 20 l verdünnen. Wickeln Sie das Rohr in Aluminiumfolie, um es vor dem Licht zu schützen.
      ANMERKUNG: Bereiten Sie eine weitere Röhre mit dem gleichen Volumen von Quantenpunkt-Streptavidin-Konjugat vor und verdünnen Sie sie auf 20 l mit neurobasalem Medium als Steuerung.
    4. Die mbtBDNF/ streptavidin-QD-Mischung 30 min bei Raumtemperatur in einer Wippe inkubieren.
    5. Den BDNF-QD auf die gewünschte Endkonzentration (2 nM) verdünnen.
    6. Nach 1 h Inkubation mit nicht-supplementiertem neurobasalen Medium fügen Sie den BDNF-QD oder die Kontrollmischung in die axonalen Fächer der mikrofluidischen Kammer ein. Inkubieren Sie für 210 min bei 37 °C, um einen Netto-Retrograde-Transport von BDNF-QD zu gewährleisten.
    7. Für die Live-Zell-Bildgebung visualisieren Sie den axonalen Retrograde-Transport im Segment der Mikrogrooves, das proximal zum Zellkörperfach ist, mit einem 100-fachen Objektiv mit einem dafür geeigneten Mikroskop (37 °C und 5% CO2). Erfassen Sie Bilder mit 1 Frame/s.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verwendung eines chromatographischen säulenbasierten Protokolls ermöglicht die Verarbeitung signifikanter Volumina von HEK293 konditionierten Medien. In Abbildung 1werden die Ergebnisse der Reinigung von BDNFAvi aus 500 ml konditionierter Medien dargestellt. Konselutionen von BDNFAvi aus den Ni-NTA Agarose Perlen ergeben abnehmende Konzentrationen von BDNFAvi (Abbildung 1A). Nach vier aufeinanderfolgenden Elutionen (jeweils 15 min) wird der Großteil der von ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Artikel wird eine optimierte Methodik für die Herstellung und Reinigung von mbtBDNF in einem Affinitätschromatographie-basierten Verfahren beschrieben, basierend auf der Arbeit von Sung und Mitarbeitern17. Die Optimierungen umfassen die Verwendung eines kostengünstigen Transfektionsreagenzes (PEI) unter Beibehaltung der Effizienz teurerer Transfektionsmethoden wie Lipofectamin. Diese Optimierung führt zu einer erheblichen Kostensenkung im Protokoll, die Skalierbarkeit bei gleichzeitig ho...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung von Fondecyt (1171137) (FCB), dem Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), dem Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) und einem UK Dementia Research Foundation (GS). Diese Arbeit wurde von der Unidad de Microscopa Avanzada UC (UMA UC) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Wege-AbsperrhahnBioRad7328102Chromatographiegerät Komponente
2-MercaptoethanolSigmaM6250BDNF-Elutionspuffer
Acrylamid/BisacrylamidBioRad1610154SDS-PAGE Gelpräparation
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024BDNF-Konzentration
AmmoniumpersulfatSigmaA9164SDS-PAGE Gelpräparation
Anti-B-III-Tubulin-AntikörperSigmaT8578Western-Blot-Assays für den Nachweis der biologischen Aktivität von BDNF-Antikörpern
AlomoneAGP-021Western-Blot-Assays für die BDNF-Quantifizierung
Anti-BDNF-AntikörperAlomoneANT-010Western-Blot-Assays für die BDNF-Quantifizierung
Anti-ERK-AntikörperCell Signalweg9102Western-Blot-Assays für den Nachweis biologischer Aktivität von BDNF
anti pCREB Antikörper (S133)Cell Signaling9198Western Blot Assays für BDNF biologischer Aktivität Nachweis
von anti pERK Antikörpern (T202, Y204)Cell Signaling4370Western Blot Assays für den Nachweis biologischer Aktivität von BDNF
anti pTrkB Antikörper (Y515)Abcamab109684Western-Blot-Assays für den Nachweis der biologischen Aktivität von BDNF
Antibiotikum/AntimykotikumGibco15240-062HEK293 Erhaltungstherapie
ATPSigmaA26209BDNF Monobiotinylierungspuffer
B-27 ErgänzungGibco17504-044Neuronenerhaltung
BicineSigmaB3876BDNF Monobiotinylierungspuffer
BirA-GSTBPS Bioscience70031Enzym für BDNF AviTag Monobiotinylierung
Rinder Fetal SerumHyCloneHC. SH30396.02HEK293 Erhaltungskomponente
RinderserumalbuminJackson ImmunoResearch001-000-162BDNF-Puffermodifikationskomponente, Blockierungspuffer für Western Blot und Immunfluoreszenz
D-BiotinSigmaB4639BDNF-Monobiotinylierungspuffer
DMEM High Glucose MediumGibco11965-092Neuron Seeding
DMEM MediumGibco11995-081HEK293 Wartung
Econo SäulentrichterBioRad7310003Chromatographie Gerätekomponente
EDTAMerck108418
EZ-ECL KitBiological Industries1633664Proteinnachweis durch Western Blot
GlutamaxGibco35050-061Neuron und HEK293 Wartung
GlycerinMerck104094BDNF-Elutionspuffer, Lysepuffer für Western-Blot-Assays
Hettich Rotina 46R ZentrifugeHettichAbkündigungs-Zentrifuge zur Reinigung des Mediums von Ablagerungen
Hettich Universal 32R Zentrifuge HettichAbkündigungs-Zentrifugezur Zentrifugation von Proteinkonzentratoren
PferdeserumGibco16050-122Neuron Seeding
ImageQuant LAS 500GE Healthcare Life Sciences29005063Western Blot Bilderfassung
ImidazolSigmaI55513BDNF Puffermodifikationskomponente
KClWinklerBM-1370PBS Komponente
KH2PO4Merck104873PBS Komponente
LamininInvitrogen23017-015Deckschicht für kompartimentierte Neuronen
Luer Tubing AdapterBioRad7323245Chromatographie-Gerätekomponente
Luminata™ Forte Western HRP SubstratMilliporeWBLUF0100Proteinnachweis durch Western Blot
Mg(CH3COO)2Merck105819BDNF Monobiotinylierungspuffer
Mowiol 4-88Calbiochem475904Einbettreagenz für Immunfluoreszenzassays
MyOne C1 Streptavidin Magnetic BeadsInvitrogen65001Biotinylierungsnachweis
Na2HPO4Merck106586BDNF-Puffermodifikationskomponente
NaClWinkler BM-1630PBS-Komponente, BDNF-Puffermodifikationskomponente
NaH2PO4MerckBDNF-Puffermodifikationskomponente
Neurobasales MediumGibco21103-049Neuronenpflege
Ni-NTA Agarose KügelchenQiagen30210BDNF AviTag-Aufreinigung
Nikon Ti2-ENikonMikroskop für Fluoreszenzbildgebung
NitrozellulosemembranBioRad1620115Proteintransfer für Western Blotting
ORCA-Flash4.0 V3 Digitale CMOS-KameraHamamatsuC13440-20CUKamera für Epifluoreszenz-Bildgebung
P8340 Protease-InhibitorCocktailSigma P8340BDNF-Puffermodifikationskomponente
ParaformaldehydMerck104005Fixiermittel für Immunfluoreszenz-Assays
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122Neuronenpflege
Poli-D-LysinCorningDLW354210Deckschicht für kompartimentierte Neuronen
Poli-L-LysinMilliporeP2363Deckschicht für nicht kompartimentierte Neuronen
Poly-Prep ChromatographiesäuleBioRad7311550Chromatographie-Gerätekomponente
Polyethylenimin 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 Transfektion
Quantum Dots 655 Streptavidin-KonjugatInvitrogenQ10121MPMonobiotinyliertes BDNF AviTag-Marker für lebende und fixierte Zellexperimente
SaponinSigmaS4521Detergens für Immunfluoreszenz-Assays
Syldgard 184 Silikonelastomer-BasisPoirot4019862Mikrofluidik-Kammervorbereitung
TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE Gelpräparation
TrisWinklerBM-2000Lysepufferkomponente
Triton X100Merck108603Zellpermeabilisierung in Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Assays
Trypsin-EDTA 0,5%Gibco15400-054HEK293 Passage
für 106346

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1(2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293(2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070(2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684(2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899(2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493(2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
  24. Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77(2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

BDNF AufreinigungAffinit tschromatografieMono BiotinylierungBDNF EileiterHEK293 ZellenBirA EnzymStreptavidin Quantenpunktekortikale Neuronenmikrofluidische KammernWestern Blot

Verwandte Artikel