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Summary

Dieses Protokoll beschreibt drei Schritte zur Vorbereitung von Larven und adulten Drosophila-Sehlappen für die Bildgebung: 1) Dissektion des Gehirns, 2) Immunhistochemie und 3) Montage. Der Schwerpunkt liegt auf Schritt 3, da unterschiedliche Montageausrichtungen erforderlich sind, um spezifische Optikkeulenstrukturen sichtbar zu machen.

Abstract

Der Drosophila-Optikuslappen , bestehend aus vier Neuropilen: der Lamina, der Medulla, der Lobula und der Lobula-Platte, ist ein hervorragendes Modellsystem für die Erforschung der Entwicklungsmechanismen, die die neuronale Vielfalt erzeugen und die Assemblierung von Schaltkreisen steuern. Angesichts seiner komplexen dreidimensionalen Organisation erfordert die Analyse des Sehlappens ein Verständnis dafür, wie seine adulten Neuropilen und Larvenvorläufer relativ zueinander und zum Zentralhirn positioniert sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Dissektion, Immunfärbung und Montage von Larven- und adulten Gehirnen für die Bildgebung des Sehlappens. Besonderer Wert wird auf den Zusammenhang zwischen der Montageorientierung und der räumlichen Organisation des Sehlappens gelegt. Wir beschreiben drei Montagestrategien in der Larve (anterior, posterior und lateral) und drei in der adulten Larve (anterior, posterior und horizontal), die jeweils einen idealen Abbildungswinkel für eine ausgeprägte Optikallappenstruktur bieten.

Introduction

Das visuelle System von Drosophila, bestehend aus dem Facettenauge und dem darunter liegenden Sehlappen, ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Entwicklung und Funktion neuronaler Schaltkreise. In den letzten Jahren hat sich insbesondere der Sehlappen zu einem leistungsfähigen System entwickelt, in dem neurologische Entwicklungsprozesse wie Neurogenese und Schaltkreisverdrahtung^{untersucht werden können} 1,2,3,4,5,6,7,8. Es besteht aus vier Neuropilen: der Lamina, der Medulla, der Lobula und der Läppchenplatte (die beiden letzteren bilden den Lobula-Komplex)1,2,3,4,5,6. Photorezeptoren aus dem Auge zielen auf Neuronen der Lamina und Medulla ab, die visuelle Eingaben verarbeiten und an die Neuropilen des Lubula-Komplexes^weiterleiten 1,2,3,4,5,6. Projektionsneuronen im Lobulakomplex senden anschließend visuelle Informationen an die Verarbeitungszentren höherer Ordnung im Zentralhirn ^1,5,9. Die komplexe Organisation des Sehlappens, die durch die Notwendigkeit notwendig wird, die Retinotopie aufrechtzuerhalten und verschiedene Arten von visuellen Reizen zu verarbeiten, macht es zu einem attraktiven System, um zu untersuchen, wie ausgeklügelte neuronale Schaltkreise aufgebaut sind. Bemerkenswert ist, dass die Medulla sowohl in ihrer Organisation als auch in ihrer Entwicklung auffallende Ähnlichkeiten mit der Neuroretina aufweist, die seit langem ein Modell für die Entwicklung neuronaler Schaltkreise bei Wirbeltieren ist ^3,8.

Die Entwicklung des Sehlappens beginnt während der Embryogenese mit der Spezifizierung von ~35 ektodermalen Zellen, die die optische Plakode 2,4,5,6,7,8 bilden. Nach dem Schlüpfen der Larven wird die optische Plakode in zwei verschiedene Primordien unterteilt: 1) das äußere Proliferationszentrum (OPC), das die Neuronen der Lamina und der äußeren Medulla erzeugt, und 2) das innere Proliferationszentrum (IPC), das Neuronen der inneren Medulla und des Läppchenkomplexes^erzeugt 4,5,6,10 . In der späten Larve des zweiten Stadiums beginnen sich die Neuroepithelzellen des OPC und IPC in Neuroblasten zu verwandeln, die anschließend über intermediäre Ganglien-Mutterzellen Neuronen erzeugen 4,5,11,12. Neuroblasten des Sehlappens sind durch räumlich und zeitlich eingeschränkte Transkriptionsfaktoren strukturiert, die zusammenwirken, um neuronale Diversität in ihren Nachkommen zu erzeugen 11,12,13,14. In der Puppe werden die Schaltkreise des Sehlappens Neuropils durch die Koordination mehrerer Prozesse zusammengesetzt, darunter der programmierte Zelltod^11,15, die neuronale Migration^12,16, das axonale/dendritische Targeting^10,17, die Synapsenbildung^18,19 und die Neuropil-Rotationen^10,17.

Hier beschreiben wir die Methodik, mit der Larven und adulte Gehirne präpariert, immungefärbt und für die Bildgebung des Sehlappens montiert werden. Angesichts seiner komplexen dreidimensionalen Organisation erfordert die Analyse des Sehlappens ein Verständnis dafür, wie seine adulten Neuropilen und Larvenvorläufer relativ zueinander und zum Zentralhirn positioniert sind. Daher legen wir besonderen Wert darauf, wie sich die Ausrichtung der Montage auf die räumliche Organisation der Optikuslappenstrukturen bezieht. Wir beschreiben drei Montagestrategien für Larvenhirne (anterior, posterior und lateral) und drei für adulte Gehirne (anterior, posterior und horizontal), die jeweils einen optimalen Winkel für die Abbildung einer spezifischen Vorläuferpopulation des Sehlappens oder Neuropils bieten.

Protocol

1. Vorbereitung von Larvengehirnen für die konfokale Bildgebung

1. Sezieren
   HINWEIS: Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, bereiten Sie die Fix- (4 % Formaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)) und PBT-Lösung (0,1-0,3 % Triton in PBS) vor. Die Fixlösung sollte während der Dissektion auf Eis gelegt werden. Obwohl in diesem Protokoll Paraformaldehyd (PFA)-Fixiermittel verwendet wird, wurden alternative Fixierstrategien (unter Verwendung von PLP²⁰ oder PEM²¹) für bestimmte Epitope beschrieben. Für die Larvendissektion werden zwei Pinzettenpaare (Dumont #5 oder #55s) benötigt. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle.
   1. Beginnen Sie damit, jede Vertiefung der Präparierschale mit 400 μl 1x PBS zu füllen. Verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig wandernde Larven des dritten Stadiums zu pflücken, die auf der Innenseite des Fläschchens krabbeln. Legen Sie die Larven in die erste Vertiefung der PBS-gefüllten Schale.
   2. Nimm eine Larve und setze sie in die mittlere Vertiefung um. Halten Sie den Körper der Larve mit der nicht dominanten Hand am Boden der Vertiefung fest.
   3. Fassen Sie mit der dominanten Hand vorsichtig den Larvenmaulhaken und ziehen Sie ihn vom Körper weg. Das Larvengehirn sollte am Maulhaken und anderem akzessorischen Gewebe befestigt sein und löst sich, wenn das Gewebe weggezogen wird.
   4. Entfernen Sie die zusätzlichen Imaginal-Discs und bringen Sie das Larvengehirn in die dritte Vertiefung der Sezierschale. Die imaginalen Scheiben sind epitheliale Gewebe, die das Larvengehirn umgeben und adulte Strukturen wie Antennen, Augen, Beine und Flügel erzeugen²⁰. Wenn die imaginalen Scheiben auf dem Gewebe verbleiben, können sie die ordnungsgemäße Immunfärbung des Larvengehirns behindern.
      1. Um die imaginalen Scheiben zu entfernen, verwenden Sie eine Pinzette, um das Gehirn über den ventralen Nervenstrang fest zu greifen. Zupfen Sie die Scheiben mit einer anderen Pinzette vorsichtig ab.
      2. Entfernen Sie die Augenscheibe vorsichtig, da sie sich über die Oberfläche der Hirnlappen legt. Um die Augenscheibe zu entfernen, halte das Gehirn mit einer Pinzette gegen den Boden der Schale. Anstatt das Gehirn über den ventralen Nervenstrang zu halten, greifen Sie mit der Pinzette leicht nach dem Hirnlappen und achten Sie darauf, den Lappen nicht zu quetschen. Ziehen Sie mit einer weiteren Pinzette die Augenscheibe vorsichtig weg.
         HINWEIS: Aus der imaginalen Scheibe des Auges entstehen schließlich Photorezeptoren der Netzhaut. Für diejenigen, die an der Untersuchung der neuronalen Konnektivität zwischen Netzhaut und Sehlappen interessiert sind, kann die Augenscheibe am Gehirn belassen werden. Für diejenigen, die sich ausschließlich für die Strukturen des Sehlappens interessieren, wird jedoch empfohlen, die Augenscheibe zu entfernen, da sie aufgrund ihrer Lage auf der Oberfläche des Gehirns die Bildqualität beeinträchtigen kann.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 bis 1.4, bis eine ausreichende Anzahl von Gehirnen entnommen wurde (oder 30 Minuten Präparierzeit verstrichen sind). Die Dissektion sollte nicht länger als 30 Minuten dauern, um sicherzustellen, dass die Integrität des Gewebes nicht beeinträchtigt wird.
   6. Sobald die Dissektionsphase abgelaufen ist, verwenden Sie eine P200-Pipette, um PBS vorsichtig aus der dritten Vertiefung zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass eine kleine Menge Flüssigkeit in der Vertiefung verbleibt, um das Gehirn eintauchen zu lassen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, das Gehirn an allen Stellen des Protokolls in Flüssigkeit einzutauchen. Wenn das Gewebe austrocknet, kann die Qualität des Farbstoffs durch unerwünschte Autofluoreszenz im konfokalen Bild beeinträchtigt werden.
   7. Geben Sie 500 μl der Kaltfixierlösung in die dritte Vertiefung. Rühre die Flüssigkeit mit einer Pinzette vorsichtig um, damit das Gehirn in der Schüssel wirbeln kann. Decken Sie die Schale mit einem Glasschieber ab und stellen Sie sie für 30 Minuten auf Eis, um eine Fixierung des Gewebes zu ermöglichen.
   8. Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie das Gehirn 5 Mal mit 400 μl PBT.
      HINWEIS: Triton ist ein Reinigungsmittel in PBT, das verhindert, dass die Gehirne aneinander oder an der Schale kleben, und das Gewebe auf eine optimale Antikörperpenetration vorbereitet.
2. Immunhistochemie
   HINWEIS: Es gibt mehrere Primärantikörper von der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), die zur Markierung spezifischer Sehlappenstrukturen oder Zelltypen verwendet werden können. DE-Cadherin markiert die IPC- und OPC-Neuroepithelien, Bruchpilot (Brp) markiert das sich entwickelnde Neuropil und Dackel markiert die Lamina- und Lobula-Neuronen (sowie eine kleine Untergruppe der Medulla-Neuronen). Darüber hinaus kann Elav zur Markierung von Neuronen, Prospero zur Markierung von Ganglien-Mutterzellen und Repo zur Identifizierung von Gliazellen verwendet werden.
   1. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie PBT Antikörper bis zu einem Gesamtvolumen von 100 μl hinzufügen. Ein Blockierungsmittel (10 % normales Ziegenserum) kann verwendet werden, um eine unspezifische Bindung zwischen dem Primärantikörper und dem Gewebe zu verhindern 20,22,23. Die in diesem Protokoll verwendeten Antikörper markieren spezifisch Hirngewebe, ohne dass Blockierungsmittel erforderlich sind.
   2. Entfernen Sie die letzte Wäsche nach der Fixierung und fügen Sie die primäre Antikörperlösung hinzu. Stellen Sie sicher, dass sich nur eine kleine Menge PBT in der Vertiefung befindet, bevor Sie die Antikörperlösung hinzufügen. Rühren Sie nach der Zugabe der Lösung das Gehirn 5 bis 10 Mal vorsichtig mit einer Pinzette um. Mit einem Objektträger abdecken, mit Laborfolie verschließen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
      1. Wenn ein gekühlter Orbitalschüttler verfügbar ist, stellen Sie die Schale alternativ auf den Shaker, um die Inkubation über Nacht zu optimieren.
         HINWEIS: Die Inkubation des Primärantikörpers und alle nachfolgenden Schritte können alternativ in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt werden. Das Volumen der primären und sekundären Inkubation kann 100 μl betragen, aber die Waschschritte sollten mit 800 μl oder mehr PBT durchgeführt werden.
   3. Nach der Inkubation waschen Sie die Primärantikörper mit PBT aus, wie in Schritt 1.1.8 des vorherigen Abschnitts beschrieben.
      HINWEIS: Die primäre Antikörperlösung sollte bei 4 °C gelagert werden, da sie für nachfolgende Experimente wiederverwendet werden kann. Viele Primärantikörper können bis zu viermal wiederverwendet werden.
   4. Geben Sie 400 μl PBT in das Gehirn für eine abschließende Wäsche. Decken Sie die Schale mit einem Objektträger ab, verschließen Sie sie mit Laborfolie und stellen Sie sie bei niedriger Drehzahl (100 U/min) und Raumtemperatur (RT) für ~4 h auf einen Orbitalschüttler.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Das Gehirn kann 2 bis 3 Tage bei 4 °C gewaschen werden.
   5. Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung in einem Gesamtvolumen von 100 μl vor.
      HINWEIS: In diesem Protokoll werden alle Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:500 ohne Blockierungsmittel verwendet.
   6. Entfernen Sie die PBT-Wäsche aus der Vertiefung und fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung hinzu. Mischen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in die Lösung. Decken Sie die Schale mit einem Objektträger und einer Laborfolie ab. Stellen Sie die Schale für eine Mindestinkubationszeit von 2 Stunden auf einen Orbitalschüttler bei RT. Da Sekundärantikörper lichtempfindliche Fluorophore enthalten, decken Sie die Schale mit Alufolie ab.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Das Gehirn kann über Nacht bei 4 °C in einer sekundären Antikörperlösung belassen werden.
   7. Die Sekundärantikörper werden wie in Schritt 1.2.3 beschrieben ausgewaschen. Geben Sie 400 μl PBT in das Gehirn für eine abschließende Wäsche. Decken Sie die Schale mit einem Objektträger ab, verschließen Sie sie mit Laborfolie und Folie. Legen Sie das Gehirn für 4 h auf einen Shaker bei RT.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Das Gehirn kann 2 bis 3 Tage bei 4 °C gewaschen werden.
3. Montage
   1. Entfernen Sie die abschließende PBT-Wäsche und ersetzen Sie sie durch zwei Tropfen fluoreszenzsichere Einbettmedien. Legen Sie einen Tropfen des Montagemediums auf die Mitte einer Folie.
   2. Übertragen Sie das Gehirn mit einer Pinzette aus der Vertiefung auf den Tropfen. Um eine Beschädigung der Sehlappen zu vermeiden, kann das Gehirn während des Transfers auf den Objektträger vom ventralen Nervenstrang gehalten werden.
   3. Montieren Sie die Gehirne gemäß den folgenden Montagestrategien (Abbildung 1A).
      1. Frontseite nach oben
         HINWEIS: Für diejenigen, die an der Visualisierung des vorderen Medulla-, Lamina- oder Lobulasteckers interessiert sind, ist diese Montageausrichtung ideal. Der beste Weg, um die vorderen und hinteren Halterungen zu unterscheiden, besteht darin, die Position des ventralen Nervenstrangs relativ zu den Hirnlappen zu untersuchen.
         1. Verwenden Sie die anteriore Ausrichtung, um den ventralen Nervenstrang zu beobachten, der über die Lappen hinausragt (Abbildung 1B).
      2. Hinterseite nach oben
         HINWEIS: Diese Ausrichtung wird für diejenigen empfohlen, die an der Visualisierung der hinteren Spitzen des OPC (pOPC) oder IPC ^10,11 interessiert sind.
         1. Verwenden Sie die posteriore Ausrichtung, um den ventralen Nervenstrang zu sehen, der unter den Hirnlappen hervorragt (Abbildung 1C).
      3. Seitenansicht
         HINWEIS: Eine laterale Montageausrichtung wird verwendet, um die Sichel von Lamina-, Medulla- oder Lubula-Plug-Neuronen sowohl in der dorsal-ventralen als auch in der anterior-posterioren Achse in einer einzigen Ebene sichtbar zu machen (Abbildung 1G).
         1. Für eine seitliche Halterung spalten Sie die Hirnlappen so, dass sie flach auf die Seite fallen, wobei die Lamina und der Läppchenstopfen nach oben zeigen.
         2. Teilen Sie mit zwei Paar scharfer Pinzetten den ventralen Nervenstrang in zwei Hälften, beginnend an der Stelle, an der die Nabelschnur an den Lappen befestigt ist. Beachten Sie, dass die beiden Lappen bereits voneinander getrennt sind und der ventrale Nervenstrang sie intakt hält. Teilen Sie also den ventralen Nervenstrang von der Spaltstelle zwischen den Lappen nach unten, um sie zu trennen. Drehen Sie dann jeden Hirnlappen und den daran befestigten ventralen Nervenstrang auf die Seiten, wobei die Seitenflächen nach oben zeigen.
            HINWEIS: Für die seitliche Ansichtshalterung wird empfohlen, eine Wolframnadel mit einer feinen Spitze zu verwenden, um den Hirnlappen auf der Seite auszurichten. Um die Ausrichtung der Lappen und die Richtung des ventralen Nervenstrangs bei der Montage deutlich sichtbar zu machen, kann die Mikroskopbeleuchtung angepasst werden. Bei Verwendung einer Schwanenhals-LED-Lichtquelle sollten die Schwanenhälse parallel zur Oberfläche der Rutsche positioniert werden, um eine klare Sicht zu gewährleisten. Außerdem kann die Beleuchtungsintensität erhöht oder verringert werden, um den Kontrast zwischen den Gehirnstrukturen zu verbessern und Klarheit beim Aufsteigen zu schaffen.
   4. Geben Sie einen kleinen Tropfen PBS auf eine der beiden Seiten des Einbettmediums, das das Gehirn enthält. Legen Sie auf jeden Tropfen ein Deckglas und ein letztes Deckglas über das Gehirn. Die rechte und linke Kante des oberen Deckglases sollten auf den beiden anderen Deckgläsern aufliegen (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Bevor ein Deckglas über das Gehirn gelegt wird, muss eine Brücke gebaut werden. Das Gehirn der Larven ist etwa 200 μm dick, und um die Integrität des Gewebes zu erhalten, wird eine Brücke geschaffen, die den Abstand zwischen dem Deckglas und der Oberfläche des Objektträgers vergrößert.
   5. Versiegeln Sie die Kanten des Stegs mit Nagellack, um die montierten Gehirne zu sichern.
   6. Bilden Sie das Gehirn mit konfokaler Mikroskopie ab.

2. Vorbereitung des Gehirns von Erwachsenen auf die konfokale Bildgebung

1. Sezieren
   HINWEIS: Die Dissektion des Gehirns bei Erwachsenen ist schwieriger als die des Gehirns von Larven und erfordert eine sorgfältige Handhabung. Es wird dringend empfohlen, für diesen Teil des Protokolls mindestens ein Paar ultrafeine Pinzetten (Dumont #55) zu verwenden.
   1. Betäuben Sie Fliegen mit CO_{2 ,} entweder mit einer Nadel oder einem Flypad, und legen Sie sie auf ein Labortuch oder Papiertuch über Eis (um sie betäubt zu halten).
   2. Geben Sie 400 μl PBS in alle drei Vertiefungen der Glasschale. Greife mit einer Pinzette vorsichtig eine erwachsene Fliege an den Flügeln und setze sie in die erste Vertiefung der Schale.
   3. Verwende eine Pinzette, die du in der nicht dominanten Hand hältst, um den Thorax der Fliege gegen den Boden der Vertiefung zu halten. Ziehen Sie mit der dominanten Hand den Kopf vorsichtig vom restlichen Körper ab.
   4. Den Kopf in die zweite Vertiefung geben. Oft schwebt der Kopf im PBS und kann schwierig zu handhaben sein. Halte sie mit einer Pinzette am Rüssel gegen den Boden der Vertiefung.
   5. Ziehe mit beiden Pinzetten einen Bereich der Nagelhaut zwischen den Augen ab. Da das Gehirn direkt unter der Nagelhaut sitzt, sollten Sie so schonend wie möglich vorgehen, um eine Beschädigung des darunter liegenden Gewebes zu vermeiden. Fahren Sie fort, die Nagelhaut Stück für Stück abzuschälen, bis das Gehirn freigelegt ist. Entfernen Sie jegliches akzessorische Gewebe (z. B. Netzhaut, Luftröhre, Luftröhren), das möglicherweise am Gehirn haftet.
      HINWEIS: Die Entfernung der Netzhaut wurde in den vorangegangenen Protokollen^22,24 beschrieben, aber die Lamina kann auch vom Rest des Sehlappens getrennt werden. Dies ist nützlich für diejenigen, die das Mark oder den Lobulakomplex untersuchen möchten, da die Lamina an der Oberfläche sitzt und die Visualisierung dieser anderen Neuropilen des Sehlappens bei der Bildgebung behindern kann. Um die Lamina zu entfernen, ziehen Sie mit einer scharfen Pinzette vorsichtig an der Vertiefung zwischen der Lamina und der Medulla neuropils. Die Lamina beginnt sich langsam von der Medulla abzulösen. Wiederholen Sie diese Bewegung, bis die gesamte Lamina entfernt ist. Während dieses Prozesses ist es wichtig, das Gehirn fest im Griff zu behalten. Verwenden Sie eine weitere Pinzette, um das Gehirn gegen den Boden der Schale zu halten, indem Sie sie so positionieren, dass die Ober- und Unterseite des Zentralhirns perfekt zwischen die Spitzen der Pinzette passen. Ein fester Griff um das Zentralhirn verhindert eine unerwünschte Schädigung des Sehlappens.
   6. Übertragen Sie das saubere Gehirn in die dritte Vertiefung. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 bis 20122.1.6, bis eine ausreichende Anzahl von Gehirnen erhalten wurde oder eine maximale Präparierzeit von 30 Minuten abgelaufen ist.
   7. Entfernen Sie das PBS in der dritten Vertiefung und fügen Sie 500 μl Fixlösung hinzu. Achten Sie darauf, dass das Gehirn weder hier noch bei eventuellen Waschschritten austrocknet, da dies zu einer Hintergrundfluoreszenz in den konfokalen Bildern führt. Decken Sie die Schale mit einem Objektträger ab und lassen Sie die Gehirne 20 Minuten lang bei RT inkubieren.
   8. Waschen Sie das Gehirn nach der Fixierung 5 Mal mit 400 μl PBT.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Das Gehirn kann mit einem Objektträger und einer Laborfolie abgedeckt und 2 bis 3 Tage lang bei 4 °C gewaschen werden. Für Forscher, die das System noch nicht kennen, könnte es einfacher sein, vor und während der Fixierung akzessorisches Gewebe am Gehirn zu belassen. Dies wird es den Forschern ermöglichen, die Anzahl der Gehirnproben zu maximieren, die in einem bestimmten Sezierzeitraum entnommen wurden. Nachdem das Gewebe fixiert und gewaschen wurde, kann das Gehirn sorgfältig gereinigt werden, bevor die primäre Antikörperlösung hinzugefügt wird. Erwachsene Gehirne mit akzessorischem Gewebe neigen dazu, zu schwimmen und laufen daher Gefahr, auszutrocknen. Daher wird empfohlen, eine Pinzette zu verwenden, um alle Gehirne nach Zugabe der Fixierlösung vorsichtig in die Mitte der Schale zu gruppieren und das Gehirn sofort nach der Fixierung zu reinigen.
2. Immunhistochemie
   1. Durchführung der Immunhistochemie wie für Larvengehirne in Abschnitt 1.2 beschrieben.
   2. Zu den nützlichen Primärantikörpern aus dem DSHB gehören diejenigen, die im Protokoll der Larvenimmunhistochemie in Abschnitt 1.2 erwähnt werden. In der Materialtabelle finden Sie eine vollständige Liste der Antikörper und der entsprechenden Verdünnungen.
      HINWEIS: Bei den Waschschritten für das Gehirn von Erwachsenen ist besondere Vorsicht geboten, da diese an der Oberfläche der Waschlösung schwimmen und beim Entfernen der Lösung an den Seiten der Vertiefung austrocknen können (was zu Hintergrundfluoreszenz führt). Eine gute Praxis ist es, die Pipette in einer Hand zu halten, um Flüssigkeit hinzuzufügen oder zu ziehen, und eine Pinzette in der anderen, um das Gehirn unter Wasser zu halten.
3. Montage
   1. Führen Sie vor dem Montageschritt eine abschließende Wäsche mit PBS (anstelle von PBT) durch. PBS bewirkt, dass das Gehirn leicht klebrig wird, wodurch es während der Montage in der gewünschten Ausrichtung bleibt.
   2. Entfernen Sie die letzte Wäsche und ersetzen Sie sie durch drei Tropfen fluoreszenzsicheres Eindeckmedium. Geben Sie einen Tropfen des Eindeckmediums auf die Mitte eines Objektträgers.
   3. Übertragen Sie das Gehirn mit einer Pinzette aus der Vertiefung auf den Tropfen. Um eine Beschädigung der Sehlappen zu vermeiden und ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern, entnehmen Sie vorsichtig ein Gehirn durch Kapillarwirkung. Schließen Sie langsam eine Pinzette um ein Gehirn, bis ein kleines Volumen Flüssigkeit, das das Gehirn enthält, zwischen den Spitzen aufgezogen wird.
      HINWEIS: Achten Sie beim Übertragen des Gehirns auf den Objektträger darauf, die Pinzette nicht zu schließen, da dies das Gehirn beschädigen kann. Alternativ kann eine P200-Pipette verwendet werden, um das Gehirn zu übertragen. Schneiden Sie das Ende der Spitze ab, um die Öffnung zu erweitern, und spülen Sie es mit PBT vor, um zu verhindern, dass das Gehirn an der Innenseite der Spitze kleben bleibt.
   4. Montieren Sie das Gehirn gemäß den folgenden Strategien (Abbildung 2A).
      1. Frontseite nach oben
         HINWEIS: Um Lamina- und Medulla-Neuronen sichtbar zu machen, richten Sie das Gehirn mit der vorderen Seite nach oben aus (Abbildung 2B). Dies kann durch die Untersuchung der Anatomie und Krümmung der zentralen Antennenlappen erreicht werden.
         1. Drehen Sie das Gehirn mit einer Pinzette vorsichtig auf die Seite, um sowohl die vordere als auch die hintere Seite zu untersuchen. Beachten Sie, dass auf der vorderen Seite die Krümmung des Gehirns ausgeprägt ist und die Antennenlappen leicht aus der Mitte herausragen.
      2. Hinterseite nach oben
         1. Positionieren Sie das Gehirn mit der hinteren (flachen) Seite nach oben und den Antennenlappen nach unten (Abbildung 2C).
            HINWEIS: Dadurch werden das Läppchen und die Läppchenplatte näher an die Bildgebungsoberfläche gebracht und sind ideal für diejenigen, die an der Visualisierung komplexer Lobelneuronen interessiert sind.
      3. Horizontale Ansicht
         HINWEIS: Um alle Neuropilen des Sehlappens gleichzeitig sichtbar zu machen, verwenden Sie eine horizontale Montagestrategie (Abbildung 2G). In dieser Orientierung können neuronale Zellkörper, axonale Trajektorien und dendritische Arborisationen in derselben Ebene sichtbar gemacht werden.
         1. Richten Sie das Gehirn zunächst mit der vorderen Seite nach oben aus. Kippen Sie das Gehirn mit einer Wolframnadel vorsichtig um 90° nach oben, so dass es auf der Rückenseite sitzt und die Fühlerlappen nach außen zeigen. Vergewissern Sie sich, dass sowohl die vordere als auch die hintere Seite des Gehirns in dieser Ausrichtung sichtbar sind.
   5. Verwenden Sie anstelle einer Deckglasbrücke Ton, um das Deckglas von der Rutsche abzuheben. Die Verwendung von Ton ermöglicht es, das Gehirn nach der Bildgebung wieder zu montieren (beschrieben im Diskussionsteil).
      1. Lege ein kleines Stück Ton auf jede Ecke eines Deckglases. Stellen Sie sicher, dass jedes Stück Ton relativ gleich dick ist. Die Tonstücke sollten zwischen 0,5 und 1 mm dick sein. Legen Sie das Deckglas vorsichtig über das Gehirn und üben Sie leichten Druck auf die Ecken aus. Das Deckglas sollte die Flüssigkeit sofort auffangen und eine Versiegelung bilden. Die Folie ist nun bereit für die Bildgebung.
         HINWEIS: Für die langfristige Lagerung des Objektträgers wird empfohlen, das Deckglas mit Nagellack zu versiegeln und bei 4 °C lichtgeschützt zu lagern.

Representative Results

Discussion

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, um Larven und adulte Drosophila-Gehirne immungefärbt und in verschiedenen Orientierungen zu montieren. Während Methoden zur Färbung von Larven- und adulten Gehirnen bereits beschrieben wurden 22,23,24,27,28, haben Montagestrategien zur optimalen Visualisierung spezifischer Sehlappenstrukturen weniger Aufmerksamkeit erhalten²⁸. Es wird erwartet, dass das hier beschriebene Protokoll den Forschern ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen der Montageorientierung und den visualisierten Strukturen des Sehlappens vermitteln wird.

Zusätzlich zu den in diesem Protokoll beschriebenen Orientierungen können alternative Winkel der Visualisierung des adulten und des larvalen Sehlappens erreicht werden, indem der Sehlappen vom Zentralhirn getrennt wird. Die Sehlappen können mit einer Insektenschere, einer Pinzette oder einer Wolframnadel vom Zentralhirn abgespalten werden. Bei Erwachsenen kann dies eine nützliche Strategie sein, wenn die Krümmung des Zentralhirns eine flache Montage der Lappen verhindert, was zu ungleichmäßigen Winkeln während der Bildgebung führt. Es sollte beachtet werden, dass die Montage eines isolierten Lappens ohne die vom Zentralhirn bereitgestellten Referenzpunkte (d. h. Antennenlappen, Hirnkrümmung usw.), die zur Bestimmung der Montageausrichtung verwendet werden, schwieriger zu montieren ist. Diese Einschränkung kann durch die Analyse von Sehlappen unter einem Fluoreszenz-GFP-Mikroskop (wenn das Gehirn für den entsprechenden Fluoreszenzmarker gefärbt ist) überwunden werden, um sicherzustellen, dass die gewünschte Ausrichtung erreicht wird, bevor das Deckglas hinzugefügt wird. In ähnlicher Weise ermöglicht die Entfernung eines Hirnlappens aus dem angehängten kontralateralen Lappen und dem ventralen Nervenstrang bei der Larve die Montage des Gehirns in jeder Ausrichtung. Mit einem GFP-Mikroskop kann der Montagewinkel in Bezug auf die interessierenden Optikkolbenstrukturen bestimmt werden.

Gehirne können auch in mehreren Orientierungen abgebildet werden, indem das Deckglas nach der Bildgebung entfernt und das Gehirn wieder montiert wird. Für die Wiedermontage sollte die Originalbrücke mit Ton hergestellt und kein Nagellack aufgetragen werden. Um das Gehirn neu auszurichten, kann eine Pinzette unter das Deckglas eingeführt werden, um das Siegel zu brechen. Sobald das Deckglas angehoben ist, sollte der größte Teil des Gehirns in den Eindeckmedien verbleiben. Das Gehirn kann dann wieder montiert und ein neues Deckglas auf das Gehirn gelegt werden. Diese Technik wurde zuvor verwendet, um ein einzelnes Gehirn in mehreren Orientierungen abzubilden, um ein hochauflösendes dreidimensionales Bild der Morphologie eines Medullaneurons zu erstellen¹⁷. Während das Wiederbesteigen oft bei erwachsenen Gehirnen durchgeführt wird, kann die Technik auch bei Larvengehirnen angewendet werden, wofür die Brücke ebenfalls mit Ton gebaut werden müsste. Es ist wichtig, die Hirnproben der Larven beim Wiedereinsetzen vorsichtig zu behandeln, da sie aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit beim Entfernen des Deckglases eher reißen.

Die oben erwähnten Protokolle können auch auf puppendes Hirngewebe 10,22,24 angewendet werden. Da Puppengehirne während der Entwicklung schnelle morphogene Veränderungen erfahren, ähneln die Montageorientierungen für frühe Puppen (0 bis 30 h APF) denen der Larvengehirne, während die Puppen im mittleren bis späten Stadium (>50 h APF) näher an den Montageorientierungen des adulten Gehirns liegen. Puppengehirne sind zerbrechlicher als Gehirne von Larven und Erwachsenen und benötigen daher besondere Sorgfalt, wenn sie manipuliert werden.

Schließlich ist neben fixiertem und gefärbtem Gewebe auch ein Verständnis der Ausrichtungen der Gehirnmontage für Live-Imaging-Anwendungen wichtig. Larven und adulte Gehirne können unter lebenden Bedingungen kultiviert und abgebildet werden, um Zellteilungen und Veränderungen der neuronalen Morphologie und Aktivität im Laufe der Zeit zu verfolgen 24,27,29. Hier ist die verwendete Montageorientierung entscheidend, da die schwächere endogene Fluoreszenz erfordert, dass die interessierenden Zelltypen so nah wie möglich an der Oberfläche des Gehirns lokalisiert werden, um eine optimale Signaldetektion während der Bildgebung zu gewährleisten.

Materials

10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps – #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps – #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506