Methodenartikel

Evaluierung des Zelltods mit zellfreiem Überstand von Probiotika in dreidimensionalen sphäroiden Kulturen von Darmkrebszellen

DOI:

10.3791/61285

⸱

13. Juni 2020

 ,  ,  ,  , 
1Microbiological Analysis Team, Group for Biometrology, Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS), 2College of Pharmacy, Chungnam National University (CNU), 3Stem Cell Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), 4Convergent Research Center for Emerging Virus Infection, Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT), 5Department of Bio-Analysis Science, University of Science & Technology (UST)

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier werden Methoden vorgestellt, um die krebshemmende Wirkung von Lactobacillus cell-free superstandant (LCFS) zu verstehen. Darmkrebs-Zelllinien zeigen Zelltod, wenn sie mit LCFS in 3D-Kulturen behandelt werden. Der Prozess der Erzeugung von Sphäroiden kann je nach Gerüst optimiert werden und die vorgestellten Analysemethoden sind nützlich, um die beteiligten Signalwege zu bewerten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bewertung des Krebszelltodes in dreidimensionalen (3D) Sphäroiden mehrzelliger Krebsarten unter Verwendung von Überständen aus der Lactobacillus fermentum Zellkultur, die als Probiotika-Kulturen betrachtet werden. Die Verwendung von 3D-Kulturen zum Testen von Lactobacillus zellfreiem Überstand (LCFS) ist eine bessere Option als tests in 2D-Monoschichten, zumal L. fermentum Krebsbekämpfungseffekte im Darm hervorrufen kann. Es wurde festgestellt, dass L. fermentum-Überstand unter 3D-Kulturbedingungen eine erhöhte antiproliferative Wirkung gegen mehrere Darmkrebszellen (CRC) besitzt. Interessanterweise waren diese Effekte stark mit dem Kulturmodell verbunden, was die bemerkenswerte Fähigkeit von L. fermentum zeigte, den Tod von Krebszellen zu induzieren. Stabile Sphäroide wurden aus verschiedenen CRCs (Darmkrebszellen) unter Verwendung des unten vorgestellten Protokolls erzeugt. Dieses Protokoll zur Erzeugung von 3D-Sphäroid ist zeitsparend und kostengünstig. Dieses System wurde entwickelt, um die krebshemmenden Wirkungen von LCFS in mehreren Arten von CRC-Sphäroiden leicht zu untersuchen. Wie erwartet, induzierten CRC-Sphäroide, die mit LCFS behandelt wurden, während des Experiments stark den Zelltod und exprimierten spezifische apoptose-molekulare Marker, die durch qRT-PCR, Western Blotting und FACS-Analyse analysiert wurden. Daher ist diese Methode wertvoll für die Erforschung der Zelllebensfähigkeit und die Bewertung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Probiotika sind die vorteilhaftesten Mikroorganismen im Darm, die die Immunhomöostase und den Energiestoffwechsel verbessern1. Probiotika aus Lactobacillus und Bifidobacterium sind die fortschrittlichsten ihrer Art, die im Darm gefunden werden2,3. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Lactobacillus hemmende und antiproliferative Wirkungen auf mehrere Krebsarten hat, einschließlich Darmkrebs4. Darüber hinaus verhindern Probiotika entzündliche Darmerkrankungen, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa5,6. Die meisten Studien mit Probiotika wurden jedoch in zweidimensionalen (2D) Monoschichten durchgeführt, die auf festen Oberflächen gezüchtet werden.

Künstlichen Kultursystemen fehlen Umweltmerkmale, was für Krebszellen nicht natürlich ist. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden dreidimensionale (3D) Kultursysteme entwickelt7,8. Krebszellen in 3D zeigen Verbesserungen in Bezug auf grundlegende biologische Mechanismen wie Zelllebensfähigkeit, Proliferation, Morphologie, Zell-Zell-Kommunikation, Arzneimittelempfindlichkeit und In-vivo-Relevanz9,10. Darüber hinaus werden Sphäroide aus mehrzelligen Arten von Darmkrebs hergestellt und sind abhängig von Zell-Zell-Interaktionen und der extrazellulären Matrix (ECM)11. Unsere vorherige Studie hat berichtet, dass probiotische zellfreie Überstände (CFS), die mit Lactobacillus fermentum hergestellt wurden, krebshemmende Wirkungen auf 3D-Kulturen von Darmkrebszellen (CRC) zeigten12. Wir schlugen vor, dass CFS eine geeignete alternative Strategie zum Testen probiotischer Wirkungen auf 3D-Sphäroideist 12.

Hier stellen wir einen Ansatz vor, der mehrzellige Arten von 3D-Darmkrebs für die Analyse der therapeutischen Wirkungen von probiotischen zellfreien Überständen (CFS) auf mehrere 3D-Darmkrebs-Mimikrysysteme aufnehmen kann. Diese Methode bietet ein Mittel zur Analyse verwandter probiotischer und krebshemmenden Wirkungen in vitro.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bakterielle Zellkulturen und Herstellung von Lactobacillus zellfreiem Überstand (LCFS)

HINWEIS: Die Schritte 1.2 – 1.9 werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt.

  1. Bereiten Sie eine MRS-Agarplatte und eine Brühe mit L-Cystein vor und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren.
  2. Die MRS-Agarplatte wird in der anaerobenH2-Kammer bei 37 °C mit 20 ppm Sauerstoff vorinkubiert.
  3. Lactobacillus-Bakterienbestand auftauen und die Agarplatte mit der Bakterienkultur impfen (Abbildung 1A (i)).
  4. Inkubieren Sie Bakterien für 2 - 3 Tage in der anaerobenH2-Kammer bei 37 °C und 20 ppm Sauerstoff, bis einzelne Bakterienkolonien erhalten sind.
  5. Waschen und trocknen Sie das anerobe Kulturröhrchen vom Typ Hungate. Autoklaven Sie das Kulturröhrchen bei 121 °C für 15 min.
  6. Anschließend wird das Röhrchen in der anaerobenH2-Kammer bei 37 °C und 20 ppm Sauerstoff inkubiert, um Sauerstoff zu entfernen.
  7. 2 - 3 ml MRS-Brühe in die Tube geben. Verschließen Sie das Rohr mit einem Butylgummi-Stopfen und schrauben Sie den Verschluss.
  8. Erhalten Sie eine einzelne Kolonie mit einer Schleife und legen Sie sie in die 1,5 ml Kulturröhre mit 500 μL 1x PBS. (Abbildung 1A (ii)).
  9. Suspendieren Sie die Kolonie mit einer 1-ml-Spritze (Abbildung 1A (iii)). Führen Sie dazu die Nadel der 1-ml-Spritze in die Mitte des Röhrchendeckels ein, saugen Sie die suspendierte Kolonie an und setzen Sie sie dann wieder in das MRS-Brühemedium aus. (Abbildung 1A (iv)).
  10. Inkubieren Sie das MRS-Brühemedium in einem Shaker-Inkubator für 2 Tage (37 °C, 5% CO2,200 U/min).
  11. Messen Sie die optische Dichte (OD) mit einem Spektralphotometer, um Bakterienwachstumskurven zu überwachen, bis die Absorption bei OD620 bis 2,0 erreicht.
  12. Trennen Sie die Bakterienpellets und die konditionierten Medien durch Zentrifugieren bei 1.000 x g für 15 min. Waschen Sie die gesammelten Bakterienpellets mit 1x PBS und resuspendieren Sie in 4 ml RPMI 1640, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum. Fügen Sie keine Antibiotika in das Medium ein.
  13. Die Bakterienpellets in RPMI aufbewahren und in einem Shaker-Inkubator für 4 h bei 37 °C mit 5% CO2 bei einer Drehzahl von 100 U/min inkubieren.
  14. Zur Herstellung des probiotischen Überstandes das Bakterienpellet durch Zentrifugation bei 1000 x gfür 15 min bei 4 °C entfernen. Den zurückgewonnenen Überstand mit einem 0,22 μm Filter steril filtern und bis zur Verwendung bei −80 °C lagern.

2. Erzeugung von Sphäroiden

  1. Vorbereitung von Darmkrebs-Zelllinien
    1. DlD-1-, HT-29- und WiDr-Zelllinien als Monoschichten bis zu 70-80% Konfluenz züchten und die Platte bei 37 °C in einem 5% CO 2-Inkubator (Wachstumsmedium: RPMI mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin) züchten.
    2. Für Zellen, die in einer 100-mm-Petrischale gezüchtet werden, waschen Sie die Platte zweimal mit 4 ml 1x PBS. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie die Petrischale für 2 min bei 37 °C in einem 5% CO 2-Inkubator, um die Zellen zu dissoziieren.
    3. Überprüfen Sie nach der Inkubation die Zelldissoziation unter dem Mikroskop und neutralisieren Sie Trypsin-EDTA mit 5 ml Wachstumsmedium.
    4. Die dissoziierten Zellen in ein 15 mL konisches Röhrchen und eine Zentrifuge für 3 min bei 300 x g geben.
    5. Entsorgen Sie den Überstand und ruhen Sie ihn vorsichtig mit 3 ml Wachstumsmedium.
    6. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau, um lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer zu bestimmen. (Abbildung 1B (i))
  2. Sphäroide Bildung
    1. In einem konischen Röhrchen von 15 ml werden die Zellen von 2.1.5 verdünnt, um 1 - 2 x 105 Zellen/ml zu erhalten(Abbildung 1B (ii))
    2. Fügen Sie der Zellsuspension eine Endkonzentration von 0,6% Methylcellulose hinzu und übertragen Sie die verdünnten Zellen in ein steriles Reservoir.
      HINWEIS: Für jede Zelllinie sollte die benötigte Menge an Methylcellulose titriert und entsprechend bestimmt werden.
    3. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 μL Zellen in jede Vertiefung einer ultra-niedrigen 96-Well-Rundboden-Mikroplatte zu dosieren. (Abbildung 1B (iii))
    4. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator für 24 - 36 h.
    5. Nach 24 - 36 h beobachten Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die Sphäroidalbildung sicherzustellen.

3. Behandlung von 3D-Darmkrebszellen mit LCFS

  1. Generieren Sie Sphäroide wie in den Schritten 2 und 3 beschrieben.
  2. Bevor Sie die LCFS-Behandlung durchführen, tauen Sie das gefrorene LCFS bei Raumtemperatur (RT) für 10 - 20 min auf.
  3. Impfen Sie die LCFS-Aktienlösung in ein Wachstumsmedium. Seriell verdünnt auf 25%, 12,5% und 6% im Wachstumsmedium (d.h. 25% LCFS = 150 μL Wachstumsmedium + 50 μL LCFS).
  4. Nehmen Sie die Zellkulturplatte mit Sphäroiden aus dem Inkubator und entfernen Sie mit einer 200 μL-Pipette so viel Wie möglich aus jeder Vertiefung.
  5. Die Wachstumsmedien mit LCFS auf die Zellen geben und bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator für 24 - 48 h inkubieren.
    HINWEIS: Das zu verwendende Volumen hängt wie folgt von der Plattengröße ab: 2 ml für 6-Well-Zellkulturplatten; 200 μL für 96-Well-Zellkulturplatten.

4. Zelllebensfähigkeit für Sphäroide

  1. Bereiten Sie 8 - 10 LCFS-behandelte Darmkrebssphäroide in undurchsichtigen Multi-Well-Platten vor (Zelllebensfähigkeitstests werden 48 Stunden nach der LCFS-Behandlung durchgeführt).
  2. Das Zelllebensfähigkeitsreagenz (siehe Materialtabelle)über Nacht bei 4 °C auftauen.
  3. Gleichen Sie das Zelllebensfähigkeitsreagenz vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur aus.
  4. Bevor Sie den Assay durchführen, entfernen Sie 50% der Wachstumsmedien aus den Sphäroide.
  5. Fügen Sie 100 μL Zelllebensfähigkeitsreagenz zu jeder Vertiefung hinzu.
    HINWEIS: Das zu verwendende Volumen hängt wie folgt von der Plattengröße ab: 100 μL für 96-Well-Zellkulturplatten.
  6. Mischen Sie das Reagenz 5 minuten lang kräftig, um die Zelllyse zu fördern.
  7. 30 min – 2 h bei 37 °C inkubieren.
  8. Zeichnen Sie die Lumineszenz auf.

5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse für Sphäroide

  1. Für jede Bedingung 10 - 15 Sphäroide in einem 2 ml Röhrchen und zentrifugieren Sie für 3 min bei 400 x g.
  2. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Sphäroide zweimal in 1 ml eiskaltem 1x PBS.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Zentrifugation, lassen Sie die Sphäroide sich absetzen.
  3. Saugen Sie so viel wie möglich von dem 1x PBS ab und isolieren Sie RNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit.
  4. Synthetisieren Sie cDNA aus 1 μg RNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  5. Bereiten Sie einen Mastermix vor, um alle Proben in dreifacher Ausfertigung auszuführen (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2).
  6. Führen Sie die Verstärkung in einem 20 μL des Template-Master-Mixes in jede qPCR-Plattenbohrung durch.
  7. Mischen Sie die Reaktionen gut und drehen Sie sie bei Bedarf.
  8. Führen Sie Proben gemäß den Empfehlungen des Geräteherstellers aus (Tabelle 3).

6. Westliches Blotting von Sphäroide

HINWEIS: Verwenden Sie beim Sammeln von Sphäroide eine 200 μL-Pipette und schneiden Sie das Ende der Spitzen ab, um deren Struktur nicht zu stören.

  1. Bereiten Sie für jede Bedingung 30 - 40 Sphäroide in einem 2-ml-Röhrchen vor.
  2. Legen Sie das Rohr auf Eis und lassen Sie die Sphäroide auf den Boden des 2-ml-Rohrs absetzen.
  3. Den Überstand entsorgen und die Sphäroide zweimal in 1 mL eiskalt 1x PBS waschen
    HINWEIS: Vermeiden Sie Zentrifugation, lassen Sie die Sphäroide sich absetzen.
  4. Saugen Sie so viel wie möglich von dem 1x PBS ab und fügen Sie RIPA-Puffer mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail hinzu (10 Sphäroide = 30 μL RIPA-Puffer).
  5. Lyse der Zellen durch Pipettieren auf und ab und führt eine Beschallung für 30 s durch, wobei 30 s 10 Zyklen lang auf Eis ruhen.
  6. Zentrifuge das Protein Lysate bei 15000 x g für 15 min bei 4 °C.
  7. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration für jedes Zelllysat.
  8. Vor dem Laden jedes Zelllysat in einem Probenpuffer bei 100 °C für 10 min kochen.
  9. Laden Sie gleiche Mengen Protein in die Vertiefungen des SDS-PAGE Gels und lassen Sie das Gel für 1 - 2 h bei 100 V laufen.
  10. Übertragen Sie das Protein vom Gel auf die PVDF-Membran.
  11. Nach dem Transfer die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit einem Sperrpuffer (5% Magermilch + TBS mit 0,05% Tween-20) blockieren.
  12. Inkubieren Sie die Membran mit 1:1.000 Verdünnungen des primären Antikörpers (Tabelle 4) in 1x TBST mit 5% BSA-Puffer bei 4 °C über Nacht.
  13. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST, 15 min für jede Wäsche.
  14. Inkubieren Sie die Membran mit 1:2.500 Verdünnungen des sekundären Antikörpers im Sperrpuffer bei Raumtemperatur für 2 h (siehe Materialtabelle).
  15. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST, 15 min für jede Wäsche.
  16. Bereiten Sie die Membran für den HRP-Nachweis mit einem chemiluminineszierenden Substrat vor.
  17. Erfassen Sie chemiluminineszierende Bilder.

7. Propidiumiodid (PI) Färbung von Sphäroide

  1. Bereiten Sie 5-10 Sphäroide wie in Schritt 4.1 beschrieben vor und legen Sie die Sphäroide in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
  2. Verdünnen Sie eine 1 mg/ml Menge PI 1:100 in 1x PBS.
  3. Entfernen Sie 50% des Mediums aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte.
  4. Fügen Sie 100 μL der PI-Lösung zu jeder Vertiefung hinzu und legen Sie die Vertiefungen für 10 - 15 min in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
  5. Waschen Sie die PI-Lösung mit 1x PBS aus.
  6. Fügen Sie 200 μL Wachstumsmedium hinzu und nehmen Sie ein Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität mit Bild J, um die Lebensfähigkeit des Sphäroids zu erhalten.

8. FACS-Analyse von Sphäroiden

  1. Generieren Sie Sphäroide wie zuvor beschrieben.
  2. Bereiten Sie für jede Bedingung 30 - 40 Sphäroide in einem FACS-Röhrchen und einer Zentrifuge für 3 minuten bei 400 x g und RT vor.
  3. Saugen Sie den Überstand an und waschen Sie die Sphäroide in 3 mL 1x PBS, dann zentrifugieren Sie bei 400 x g für 3 min bei 4 °C.
  4. Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 200 μL 0,25% Trypsin-EDTA hinzu, dann inkubieren Sie es bei RT für 2 -3 min.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit ist abhängig von der Sphäroidgröße und dem Zelltyp.
  5. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu und dissoziieren Sie die Sphäroide vorsichtig mit einer 200 μL-Pipette.
  6. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 400 x g und 4 °C für 3 min.
    HINWEIS: FACS-Puffer = 1x PBS + 2,5% FBS, gefiltert mit einem 0,22 μm Top-Filter.
  7. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 7-AAD/Annexin V Reagenz (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/Probe) hinzu.
  8. Die Zellen vorsichtig durchwirbeln und 13 - 30 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
  9. Fügen Sie 500 μL FACS-Puffer hinzu und filtern Sie die Zellen mit konischen Polystyrol-Reagenzgläsern, um Aggregatzellen zu entfernen.
  10. Zentrifuge bei 400 x g und 4 °C für 3 min.
  11. 500 μL Annexin V-Bindungspuffer in jedes Röhrchen geben und wieder aufschnüssen.
  12. Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben das Protokoll der Gewinnung von Sphäroiden aus verschiedenen Darmkrebszelllinien. Eine Supplementierung mit Methylcellulose war erforderlich, um Sphäroide zu erzeugen. Wir stellen auch eine Methode der LCFS-Vorbereitung vor und präsentieren ein Modell, um die Korrelation zwischen Probiotika und Darmkrebs zu untersuchen. Sphäroidbildungs- und LCFS-Präparationsprotokolle sind schematisch in Abbildung 1A,Bdargestellt. Wie in Abbildung 2A

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Gewebemikroumgebung, einschließlich benachbarter Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM), ist grundlegend für die Gewebeerzeugung und entscheidend für die Kontrolle des Zellwachstums und der Gewebeentwicklung13. 2D-Kulturen haben jedoch mehrere Nachteile, wie die Störung zellulärer Interaktionen sowie Veränderungen in der Zellmorphologie, extrazellulären Umgebungen und dem Ansatz derDivision 14. 3D-Zellkultursysteme wurden gründlich untersucht, um In-vivo-Effekte be...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Den Autoren sind keine relevanten finanziellen Angaben vor.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde durch die "Etablierung von Messstandards für Chemie und Strahlung", Förderkennzeichen KRISS-2020-GP2020-0003, und "Entwicklung von Messstandards und -technologien für Biomaterialien und medizinische Konvergenz", Förderkennzeichen KRISS-2020-GP2020-0004 Programme, finanziert vom Korea Research Institute of Standards and Science, unterstützt. Diese Forschung wurde auch vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (MSIT), der National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), dem Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt (MOHW), dem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), dem Ministerium für Handel, Industrie und Energie (MOTIE) und dem Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350) unterstützt. ORCID ID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Wir danken Chang Woo Park für die Unterstützung bei experimenten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare

10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-Well, 15 & Mikro; l		Biorad4561036Packung mit 10
Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971100 deckt
10x Transferpufferab IntronIBS-BT031A1 L
10X Tris-Glycin (W/SDS)IntronIBS-BT0141 L
Axygen 2,0 mL MaxyClear Snaplock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, klar, unsteril, 500 Röhrchen/Packung, 10 Packungen/KartonCorningSCT-200-C500 Röhrchen/Packung, 10 Packungen/Karton
BD Difco Bacto AgarBD214010500 g
BD Difco Laktobazillen MRS BouillonBDDF0881-17-5500 g
CellTiter-Glo 3D ZellviabilitätsassayPromegaG9681100μ l/Assay in 96-Well-Platten
Complete Protease InhibitorCocktail Sigma-Aldrich11697498001Fläschchen mit 20 Tabletten
Corning Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 1X ohne Calcium und Magnesium, PH 7,4 ± 0,1Corning21-040-CV500 mL
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranesfisher ScientificIPVH0001026,5 cm x 3,75 m Rolle; Porengröße: 0,45 μm
Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Zellsieb SchnappkappeCorning352235 25/Packung, 500/Karton
Fötales Rinderserum, zertifiziert, US-HerkunftThermo Fisher Scientific16000044500 mL
iScript cDNA-Synthesekit, 25 x 20 & Mikro; l rxns #1708890Biorad170889025 x 20 µ L rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 x 1 mL
Lactobacillus fermentumKoreanische Sammlung für TypkulturenKCTC 3112
L-Cysteinhydrochlorid-MonohydratSigma-AldrichC6852-25G25 g
Methylcellulose (3500-5600mPa· s, 2% in Wasser bei 20°; C)TCIM0185500 g
MicroAmp Schnelle optische 96-Well-Reaktionsplatte mit Barcode, 0,1 mLApplied Biosystems434690620 Platten
Millex-GS Spritzenfiltereinheit, 0,22 &; Mikro; m, gemischte Celluloseester, 33 mm, Ethylenoxid sterilisiertMilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V Apoptose-Nachweiskit mit 7-AADBiolegend640934100 Tests
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140122100 ml
Propidiumiodid-IntrogenP1304MP100 mg
RIPA Lyse- und ExtraktionspufferThermo Fisher Scientific89901250 mL
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 mL
Trypsin-EDTA (0,25%), phenolrotThermo Fisher Scientific25200056100 mL
Name der Materialien/Ausrüstung/SoftwareCompanyKatalognummerKommentare/Beschreibung
anti - p-Iκ BΑ (B-9)Santa Cruzesc-8404200 µ g/mL
anti-BclxL (H-5)Santa Cruzesc-8392200 µ g/mL
anti-PARP 1 (C2-10)Santa Cruzesc-5364350 µ l Aszites
anti-β-Aktin (C4)Santa cruzesc-47778200 µ g/mL
BD FACSVerseBD BiosciencesSan Diego, CA, USA
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderBioTS1LFA
CO2-InkubatorThermo fisherHERAcell 150i
Konisches Röhrchen 15 mlSPL50015
Konisches Röhrchen 50 mlSPL50050
Corning Costar Ultra-Low Attachment Sigma-AldrichCLS7007
Corning CostarSigma-AldrichCLS3471
Costar 50 mL Reagenzreservoire, 5/Beutel, sterilCostar4870
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermofisherC10228
Countess II FL Automatisierter ZellzählerInvitrogen
EnSpire Multimode ReaderPerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus Mehrkanalpipette, 8-KanalEppendorf3122000051
FlowJo SoftwareTreeStarAshland, OR, USA
Ziege Anti-Maus IgG (H+L)Jackson immunoresearch115-035-0621,5 mL
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Jackson immunoresearch111-035-1442,0 mL
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc., San Diego, CA, USA
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmTokio, Japan
Inkubierter ShakerLaborbegleiterSIF-6000R
Multi Gauge Ver. 3.0,FujifilmTokio, Japan
Optische Dichte (OD)LAMBDA UV/Vis-SpektralphotometerPerkin ElmerWaltham, MA, USA
PhasenkontrastmikroskopOlympusTokio, Japan
SPL-Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mlSPL60015
SPL Mehrkanal-Reservoire, 12 Kanäle, PS, sterilSPL21012
StepOnePlus Real-Time-PCR-SystemThermo Fisher ScientificWaltham, MA, USA
Vibra-Cell Ultraschall-FlüssigkeitsprozessorenSONICS-vibra cellVC 505500 Watt Ultraschallprozessor
Vinyl Anaerobe KammerCOY LAB PRODUKTE
AMQAF1000

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
  2. Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
  3. Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
  4. Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
  5. Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3(2006).
  6. Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  10. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  11. Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  12. Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557(2019).
  13. Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
  14. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
  16. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  17. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886(2018).
  18. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  19. Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
  20. Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
  21. Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  22. Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
  23. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  24. Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
  25. Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016(2019).
  26. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  27. Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
  28. Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711(2019).
  29. Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Kolorektale Karzinom Sph roideLactobacillus berstand3D ZellkulturZelltodanalyseDurchflusszytometrieWestern BlottingqRT PCRMethylcellulose BehandlungUltra Low AttachmentApoptosemarker

Verwandte Artikel