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Methodenartikel

Röntgenkristallographie zur Untersuchung des oligomeren Zustandsübergangs der Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

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DOI:

10.3791/61288

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13. Mai 2020

 ,  ,  , 
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology, Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um den Dimer-Dodecamer-Übergang von TmPep1050, einer M42-Aminopeptidase, auf struktureller Ebene zu untersuchen. Es ist eine einfache Pipeline, die von der Proteinreinigung bis zur Röntgendatenverarbeitung reicht. Crystallogenese, Datensatzindexierung und molekularer Ersatz wurden durch einen Studienfall, TmPep1050H60A H307A Variante, betont.

Zusammenfassung

Die M42-Aminopeptidasen bilden funktionell aktive Komplexe aus 12 Untereinheiten. Ihr Montageprozess scheint durch ihre Metallionenkofaktoren geregelt zu sein, die einen Dimer-Dodecamer-Übergang auslösen. Bei der Metallionenbindung treten mehrere strukturelle Modifikationen am aktiven Standort und an der Interaktionsschnittstelle auf, die Drücker formen, um die Selbstmontage zu fördern. Um solche Veränderungen zu beobachten, müssen stabile Oligomere vor der Strukturuntersuchung isoliert werden. Hier wird eine Methode berichtet, die die Reinigung von stabilen Dodecamern und Dimern von TmPep1050, einer M42-Aminopeptidase von T. maritima, und deren Strukturbestimmung durch Röntgenkristallographie ermöglicht. Dimere wurden von Dodecamern hergestellt, indem Metallionen mit einem Chelatbildner entfernt wurden. Ohne ihren Cofaktor wurden die Dodecameer weniger stabil und wurden beim Erhitzen vollständig distanziert. Die oligomeren Strukturen wurden durch den einfachen molekularen Ersatzansatz gelöst. Zur Veranschaulichung der Methodik wird die Struktur einer TmPep1050-Variante, die in der Metallionenbindung völlig beeinträchtigt ist, dargestellt, die keine weitere Aufschlüsselung von Dimern zu Monomeren zeigt.

Einleitung

Oligomerisierung ist ein vorherrschender Prozess, der die biologischen Funktionen vieler Proteine diktiert. In Escherichia coliwerden nur 35% der Proteine monomer1. Einige Proteine, morpheeins genannt, können sogar mehrere oligomere Zustände mit Untereinheiten mit unterschiedlicher Struktur in jedem oligomeren Zustand annehmen2. Der Übergang zwischen ihren oligomeren Zuständen ist oft ein Mittel, um die Proteinaktivität zu regulieren, da jeder oligomere Zustand eine andere spezifische Aktivität oder Funktion haben kann. Mehrere Beispiele für Morpheeins sind in der Literatur gut dokumentiert, insbesondere die Porphobilinogen-Synthase3, HPr Kinase/Phosphatase4, Lon Protease5, Lactat-Dehydrogenase6, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase7, Pyruvatkinase8, Citratsynthase9und Ribonuclease A10. Kürzlich beschrieben wir die M42-Aminopeptidase TmPep1050, ein weiteres Beispiel für Enzym mit morpheeinähnlichem Verhalten, dessen Aktivität von seinen oligomeren Zuständenabhängt 11. Der Übergang zwischen seinen oligomeren Zuständen wird durch seine metallischen Kofaktoren vermittelt, die mehrere strukturelle Modifikationen der Untereinheiten induzieren.

Die M42 Aminopeptidase Familie gehört zum MH-Clan12,13, und ist weit verbreitet unter Bakterien und Archaea14. Die M42-Aminopeptidase sind echte denukleare Enzyme, die Peptide bis zu 35 Aminosäurerückstände in der Länge15abbauen. Sie nehmen eine eigentümliche tetraederförmige Struktur aus 12 Untereinheiten an, deren aktive Stellen auf eine innere Höhle ausgerichtet sind. Eine solche Anordnung wird oft als nano-kompartalisierung der Aktivität beschrieben, um eine unkontrollierte Proteolyse zu vermeiden. Die physiologische Funktion der M42-Aminopeptidasen kann mit den proteasom, hydrolysierenden Peptiden in Folge des Proteinabbaus16,17in Verbindung gebracht werden. Pyrococcus horikoshii besitzt vier M42-Aminopeptidasen, die jeweils unterschiedliche, aber komplementäre Besonderheiten18,19,20,21präsentieren. Singuläre, Heterokomplexe aus zwei verschiedenen Arten von Untereinheiten wurden in P. horikoshiibeschrieben, was auf die Existenz von Peptidasom-Komplexen22,23hindeutet.

Mehrere Strukturen von M42 Aminopeptidasen wurden in der Literatur beschrieben11,16,18,19,20,24,25,26. Die Untereinheit besteht aus zwei unterschiedlichen Domänen, einer katalytischen Domäne und einer Dimerisierungsdomäne. Die katalytische Domäne nimmt eine gemeinsame α/β Falte an, die im gesamten MH-Clan konserviert wird, wobei die archetypische katalytische Domäne die Aminopeptidase Ap1 von Vibrio proteolyticus27ist. Die Dimerisierungsdomäne nimmt eine PDZ-ähnliche Falte16 an und kann neben ihrer Rolle bei der Oligomerisierung eine Rolle bei der Steuerung des Substratzugangs und der Bindung in der inneren Kavität11spielen. Da der Grundbaustein ein Dimer ist, wird der Dodedekadaner oft als die Assoziation von sechs Dimeren beschrieben, wobei jeder Dimer an jeder Kante des Tetraeders16positioniert wird. Die Oligomerisierung der M42-Aminopeptidase beruht auf der Verfügbarkeit ihrer Metallkofaktoren. Divalente Metallionen, oft Zn2+ und Co2+,sind katalytisch an der Peptidbindung und Hydrolyse beteiligt. Sie befinden sich in zwei unterschiedlichen Bindungsstellen, nämlich M1- und M2-Sites. Die beiden Metallionen treiben und stimmen auch die Oligomerisierung an, wie sie für PhTET2, PhTET3, PfTET3 und TmPep105011,24,28,29demonstriert wurde. Wenn die Metallkofaktoren erschöpft sind, zerlegt sich der Dodecamer in Dimer, wie in PhTET2, PhTET3 und TmPep105011,16,28oder sogar Monomeren, wie in PhTET2 und PfTET324,29.

Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Strukturen von TmPep1050-Oligomeren vorgestellt. Dieses Protokoll ist eine Reihe von gängigen Methoden einschließlich Proteinreinigung, proteolytische Aktivität Screening, Kristallisation, Röntgenbeugung, und molekularen Ersatz. Subtilitäten im Umgang mit Metalloenzymen, Proteinoligomerisierung, Proteinkristallisation und molekularem Ersatz werden betont. Ein Fall der Studie wird auch vorgestellt, um zu zeigen, ob TmPep1050 Dodecamer sich weiter in Monomere dissoziieren können oder nicht. Um diese Frage zu beantworten, wurde eine TmPep1050-Variante, TmPep1050H60A H307A, untersucht, deren Metallbindungsstellen durch Mutation seiner-60 (M2-Site) und His-307 (M1-Site) zu Ala-Rückständen beeinträchtigt werden. Dieses Protokoll kann aufgenommen werden, um andere M42-Aminopeptidase oder Metalloenzyme mit Morpheein-ähnlichem Verhalten zu untersuchen.

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Protokoll

1. Herstellung und Reinigung des rekombinanten TmPep1050

HINWEIS: Im Folgenden werden das Klonverfahren und die Reinigung des Wildtyps TmPep1050 beschrieben, der an eine frühere Studie angepasst wurde11. Alternativ kann das Klonen mit einem synthetischen Gen erfolgen. Um TmPep1050-Varianten zu generieren, kann eine standortgesteuerte Mutagenese beispielsweise nach den Single-Primer-Reaktionen in der Parallelprotokollmethode (SPRINP)30durchgeführt werden. Das Reinigungsprotokoll kann für TmPep1050-Varianten verwendet werden. Die Verwendung von His-Tag sollte vermieden werden, da es die Metallionenbindung stört.

  1. Ausdrucksvektordesign
    1. Erwerben Sie genomische DNA von Thermotoga maritima MSB8 (ATCC 43589) oder TmCD00089984 (Joint Center for Structural Genomics).
    2. Amplify TM_1050 open reading frame (ORF) entweder mit genomischer DNA oder Template Plasmid, eine Hochtreue-DNA-Polymerase und die folgenden Primer: ocej419 (5'- TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATACCCATGAGAGAAAGCTG) und ocej420 (5'- ATCCGCCAAAACACAGCGCCAGCTGGAGACCGTTTACGCGCCAG Führen Sie das Polymerase-Kettenreaktions-Screening (PCR) nach folgendem Schema aus: 5 min bei 95 °C, 30 Zyklen mit 3 Schritten (30 s bei 95 °C, 30 s bei 55 °C, 90 s bei 72 °C) und 10 min bei 72 °C als letzten Schritt.
    3. Klonen Sie das PCR-Fragment in einen geeigneten Expressionsvektor (Materialtabelle) durch homologe Rekombination (Abbildung 1) in E. coli nach dem SLiCE-Protokoll31. Um 50 ng linearisierten Vektor, fügen Sie PCR-Fragment in einem 10:1 Molaren-Verhältnis von Fragment zu Vektor, 1 l PPY-Stammextrakt, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, und 10 mM Dithiothreitol (DTT) für ein Reaktionsvolumen von 10 l. Inkubat für 1 h bei 37 °C.
    4. Transformieren Sie chemisch kompetente E. coli XL1-Blaustamm (oder einen beliebigen recA- geeigneten Stamm) mit 1 l Rekombinationsreaktion. Die Zellen auf LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin verplatten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
    5. Pflücken Sie Kolonien auf frischen LB-Platten mit 100 g/ml Ampicillin. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für mindestens 8 h.
    6. Bildschirm für positive Kandidaten nach Kolonie PCR mit geeignetem Primerpaar (5'- ATGCCATAGCATTTTTATCC und 5'- ATTTAATCTCTATCAGGC, wenn der empfohlene Vektor in Tabelle der Materialienaufgeführt ). Mit einem Mikrospitzenende kratzen Sie eine gepflückte Kolonie und übertragen Sie die Zellen auf 20 l Reaktionsmix, der 0,5 m jeder Grundierung und 10 l eines kommerziellen Taq-DNA-Polymerase-Mixes enthält.
    7. Führen Sie das PCR-Screening nach folgendem Schema aus: 5 min bei 95 °C als Denaturierungsschritt, 30 Zyklen mit 3 Schritten (30 s bei 95 °C, 30 s bei 55 °C, 90 s bei 72 °C) und 10 min bei 72 °C als letzten Schritt.
      HINWEIS: Die PCR-Reaktionen können über Nacht in der PCR-Maschine bei 12 °C gespeichert werden.
    8. Laden Sie 10 l jeder PCR-Reaktion auf ein 0,8% Agarose-Gel, das in Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Puffer hergestellt wird. Führen Sie die Elektrophorese 25 min bei 100 V.
      HINWEIS: Es wird ein Amplikon von 1,1 kbp erwartet.
    9. Extrahieren Sie Plasmide von Kandidaten mit einem kommerziellen Kit (Tabelle der Materialien) und sequenzieren Sie sie mit dem gleichen Primerpaar, das in Schritt 1.1.6 verwendet wird.
  2. Zellkultur
    HINWEIS: Wenn ein geeigneter Kandidat durch Sequenzierung identifiziert wurde, kann der Klon direkt als Ausdruck verwendet werden, wenn der empfohlene Vektor (Materialtabelle) verwendet wird. In diesem Fall wird der Ausdruck vom arabinose-inducible PBAD Promoter32kontrolliert.
    1. Impfen Sie 10 ml LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin mit dem Kandidaten und inkubieren Sie die Präkultur über Nacht bei 37 °C unter Orbitalschütteln. Fügen Sie 5 ml der Präkultur zu 1 L LB Medium mit 100 g/ml Ampicillin hinzu. Achten Sie darauf, ein Luft-Flüssigkeits-Verhältnis von 3 zu respektieren.
    2. Lassen Sie Zellen bei 37 °C unter Orbitalschütteln wachsen. Überwachen Sie die optische Dichte bei 660 nm (OD660).
    3. Wenn OD660 0,5 bis 0,6 erreicht hat, kühlen Sie die Kultur schnell für 5 min auf Eis ab und übertragen Sie sie auf einen Brutkasten, der auf 18 °C eingestellt ist.
    4. Fügen Sie 0,2 g/L Arabinose hinzu, um die Genexpression zu induzieren, und brüten Sie für 12 x 18 h bei 18 °C.
    5. Erntezellen durch Zentrifugieren der Kultur bei 6.000 x g für 30 min bei 4 °C. Entsorgen Sie die Überstands- und Waschzellen mit 100 ml von 0,9% (w/v) NaCl.
    6. Zentrifugieren Sie bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C wieder und entsorgen Sie den Überstand.
      HINWEIS: Zellpellets können direkt zur Proteinextraktion verwendet oder bei -80 °C gelagert werden.
  3. Proteinreinigung
    1. Die Zellpellets in 40 ml mit 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2 wieder aufhängen. Fügen Sie 1 L von 25 U/L DNA/RNA-Endonuklease und eine Tablette protease-Hemmer-Cocktail hinzu, der keine EDTA enthält. Sonicate die Federung im Pulsmodus unter Kühlung für 30 min.
    2. Zentrifugieren Sie den Rohextrakt bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand und erhitzen Sie ihn in einem Wasserbad bei 70 °C für 10 min.
    3. Zentrifugieren Sie den denaturierten Zellextrakt bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand zur Reinigung.
    4. Verwenden Sie geeignetes Anionenaustauschharz (Materialtabelle), verpackt in einer Spalte mit einem Volumen von 15 ml. Lesen Sie die Empfehlungen des Herstellers für den Arbeitsdurchfluss und die Säulendruckgrenze. Das Harz mit 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2 ausstatten.
    5. Laden Sie den von Schritt 1.3.3 gesammelten Überstand in die Spalte. Überwachen Sie die Absorption des Eluats bei 280 nm. Wenn die Basislinie erreicht ist, fahren Sie mit der Elution fort.
    6. Tragen Sie einen Farbverlauf von 0 bis 0,5 M NaCl in 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2 für 5 Spaltenvolumen (CV) auf. Warten Sie, bis die Leitfähigkeit stabilisiert ist und die Absorption die Basislinie erreicht hat.
    7. Tragen Sie einen letzten Farbverlauf von 0,5 bis 1 M NaCl in 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2 für 1 CV auf.
    8. Analysieren Sie einige Fraktionen (siehe Abbildung 2A zur Orientierung) durch Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).
      HINWEIS: TmPep1050 erscheint als 36 kDa-Band nach Coomassie-Färbung. Alternativ kann das Vorhandensein von TmPep1050 durch Aktivitätstest bestätigt werden (siehe Abschnitt 2.1). Bei diesem Schritt können Fraktionen bei 4 °C über Nacht gelagert werden.
    9. Die Fraktionen, die TmPep1050 enthalten, zu bündeln und fein gemahlenes Pulver von (NH4)2SO4 hinzuzufügen, um eine Konzentration von 1,5 M (NH4)2SO4zu erhalten. Mischen Sie sanft, indem Sie das Rohr auf den Kopf bis zur vollständigen Auflösung.
    10. Verwenden Sie hydrophobes Wechselwirkungsharz (Materialtabelle), verpackt in einer Spalte mit einem Volumen von 30 ml. Lesen Sie die Empfehlungen des Herstellers für den Arbeitsdurchfluss und die Säulendruckgrenze. Das Harz mit 50 mM MOPS, 1,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2, pH 7.2.
    11. Laden Sie die Probe auf die Säule und überwachen Sie die Absorption des Eluats bei 280 nm. Wenn die Absorption die Basislinie erreicht hat, werden elute gebundene Proteine durch Anwenden eines Gradienten von 1,5 M bis 0 M (NH4)2SO4 in 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7,2 für 5 CV.
    12. Analysieren Sie einige Brüche (siehe Abbildung 2B zur Anleitung) durch SDS-PAGE.
      HINWEIS: TmPep1050 erscheint als 36 kDa-Band nach Coomassie-Färbung. Alternativ kann das Vorhandensein von TmPep1050 durch Aktivitätstest bestätigt werden (siehe Abschnitt 2.1). Bei diesem Schritt können Fraktionen bei 4 °C über Nacht gelagert werden.
    13. Die Fraktionen, die TmPep1050 enthalten, bündeln und sich mit Ultrafiltrationseinheiten mit 30 kDa Cutoff (Materialtabelle)auf 2 ml konzentrieren. Fahren Sie mit Abschnitt 1.4 fort, um das Molekulargewicht zu bestimmen.
  4. Größenausschlusschromatographie
    1. Verwenden Sie Größenausschlussharz (Materialtabelle), verpackt in einer Spalte mit einem Volumen von 120 ml. Lesen Sie die Empfehlungen des Herstellers für den Arbeitsdurchfluss und die Säulendruckgrenze. Das Harz mit 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2, pH 7.2.
    2. Laden Sie die Probe auf die Säule und überwachen Sie die Absorption des Eluats bei 280 nm. Fractionate von der Spalte Totvolumen (0,33 CV) bis zum Ende der Elution (1 CV).
    3. Messen Sie das Elutionsvolumen für jeden beobachteten Peak.
      HINWEIS: Zur Orientierung vergeht der dodecamerische TmPep1050 bei 82 ml (Abbildung 3A) unter aktuellen experimentellen Bedingungen, während dimeres TmPep1050, wie die Variante TmPep1050H60A H307A, bei 95 ml(Abbildung 3B)liegt. Einige TmPep1050 können beide oligomeren Formen annehmen, wie TmPep1050H60A (Abbildung 3C).
    4. Analysieren Sie Brüche, die den Maxima und Schwänzen der beobachteten Spitzen entsprechen, mit SDS-PAGE.
      HINWEIS: TmPep1050 erscheint als 36 kDa-Band nach Coomassie-Färbung.
    5. Bündeln Sie die Fraktionen der einzelnen Spitzen und konzentrieren Sie sich mit Ultrafiltrationseinheiten mit 30 kDa Cutoff (Materialtabelle), um eine Konzentration von 300 m zu erhalten.
    6. Messen Sie die Absorption bei 280 nm auf einem Nanovolumenspektrophotometer und berechnen Sie die Konzentration mit dem molekularen Aussterbekoeffizienten von 18.910 M-1 cm-1.
    7. Das gereinigte Protein bei -18 °C lagern.
    8. Um das Molekulargewicht zu bestimmen, kalibrieren Sie die Spalte Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung von Molekulargewichtsstandards (Materialtabelle). Analysieren Sie die Standards mit 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 mM CoCl2 pH 7.2 als Laufpuffer.

2. Aktivitätstest und Apoenzymzubereitung

HINWEIS: Ursprünglich wurde das Apo-Enzym durch Verdünnung von 1 Volumen tmPep1050 in 10 Bänden mit 2,1 M Apfelsäure-pH-Wert 7,0 hergestellt und vor der Dialyse11auf 1 Volumen konzentriert. Im Folgenden wird ein alternatives Verfahren mit 1,10-Phenanthroline, einem Metallionenchelator, vorgestellt. Dieses Verfahren reduziert den Proteinverlust und liefert die gleichen Ergebnisse wie die zuvor veröffentlichte Methode.

  1. Aktivitätstest
    1. Bereiten Sie eine Lagerlösung von 100 mM L-Leucin-p-Nitroanid (Materialtabelle) in Methanol vor.
    2. Fügen Sie 25 l von 100 mM L-Leucin-p-Nitroanlidin 965 l von 50 mM MOPS, 250 m CoCl2,pH 7,2, 10% Methanol hinzu. Den Reaktionsmix bei 75 °C in einem trockenen Bad vorbrütigen.
    3. Verdünnen Sie das Enzym in 50 mM MOPS pH-pH 7,2 auf eine Konzentration von 1 'M. Fügen Sie 10 'L in den Reaktionsmix, Wirbel, und inkubieren bei 75 °C entweder, bis es gelblich geworden ist oder für 1 h.
    4. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 1 ml 20% Essigsäure hinzufügen. Vortex gut und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen.
    5. Übertragen Sie den Reaktionsmix in eine Spektralphotometerzelle. Lesen Sie die Absorption bei 410 nm gegen eine negative Kontrolle (inkubierte Reaktionsmischung ohne Enzym).
  2. Apo-Enzym-Präparat
    1. Bereiten Sie eine Lagerlösung von 1 M 1,10-Phenanthroline in Ethanol vor. Fügen Sie 10 L 1,10-Phenanthroline-Stammlösung zu 890 l von 50 mM MOPS, 0,5 m (NH4)2SO4, pH 7,2 hinzu. Fügen Sie 100 l gereinigten TmPep1050 (300 m 1 mM Konzentration) hinzu.
    2. Überprüfen Sie den Aktivitätsverlust mit dem in Abschnitt 2.1 beschriebenen Aktivitätstest, ohne CoCl2 in den Reaktionsmix aufzunehmen.
    3. Übertragen Sie die Probe in einem Dialyserohr. Dialyse gegen 200 ml von 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7,2 bei 4 °C. Tauschen Sie dreimal das Dialysat mit frischem Puffer während der 48-H-Dialyse aus.
    4. Sammeln Sie die Probe aus dem Dialyserohr und konzentrieren Sie sich mit Ultrafiltrationseinheiten mit 30 kDa Cutoff (Materialtabelle)wieder auf 100 l. Überprüfen Sie die Konzentration, indem Sie die Absorption bei 280 nm mit einem Nanovolumenspektralphotometer ablesen.
  3. Dimer-Vorbereitung
    1. Verdünnen Sie das Apo-Enzym auf eine Konzentration von 1 m in 50 mM MOPS, 0,5 m (NH4)2SO4, pH 7,2. 2 h bei 75 °C in einem trockenen Bad bebrüten, dann die Probe auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
    2. Konzentrieren Sie die Probe auf eine Enzymkonzentration von mindestens 50 m. Überprüfen Sie das Molekulargewicht durch SEC (siehe Abschnitt 1.4). Die Elutionsspitze muss sich von 82 ml auf 95 ml (unter aktuellen experimentellen Bedingungen) verschieben.

3. TmPep1050 Kristallisation

HINWEIS: Die Proteinkristallisation bleibt eine empirische Wissenschaft, da es sich um ein multifaktorielles Phänomenhandelt 33. Während einige Parameter identifiziert und kontrolliert werden können (z. B. Temperatur, pH,- und Niederschlagsmittelkonzentration), können andere die Kristallisation (wie Protein und chemische Reinheit, Proteolyse, Probenverlauf) schwer beeinflussen. Heutzutage wird die Proteinkristallisation dank einer Reihe kommerzieller Kristallisations-Screening-Bedingungen und Automatisierung rational und systematisch bekämpft. Die Optimierung eines Kristallisationszustandes beruht jedoch meist auf einem Trial-and-Error-Ansatz. Im Folgenden werden eine Blaupause für kristallisierende Proteine und mehrere Tipps zur Optimierung der Kristallisationsbedingungen beschrieben.

  1. Kristallisations-Screening
    HINWEIS: Mit kommerziellen Kristallisationskits wurden Kristalle aus dodecamerischem TmPep1050 in 2,2 M DL-Malsäure pH 7,0, 0,1 M Bis-Tris Propan pH 7.0 und 0,18 M Tri-Ammoniumcitrat, 20% Polyethylenglykol (PEG) 3350 gewonnen. Kristalle aus dimerem TmPep1050 wurden in 0,1 M Natriumcitrat pH 5,6, 0,2 M Ammoniumacetat, 30% PEG4000 erhalten. Kristalle von Dodecamern erscheinen innerhalb einer Woche und erreichen ihre volle Größe in einem Monat. Kristalle von Dimeren erscheinen in der Regel innerhalb von 24 h und wachsen zu voller Größe in einer Woche.
    1. Erwerben Sie mehrere kommerzielle Kristallisationskits (Beispiele siehe Materialtabelle).
    2. Richten Sie Kristallisationsplatten (Materialtabelle) für die Hängende-Tropfen-Methode ein. Füllen Sie die Brunnen mit 500 l jeder Lösung eines Kristallisationssiebkits.
    3. Richten Sie für jeden Brunnen eine Kristallisationsunterstützung ein. Legen Sie auf der Stütze einen Tropfen von 1 L des gereinigten Proteins (in der Regel 10 mg/ml) ab.
    4. Sofort Pipet1 1 L Kristallisationslösung aus dem Brunnen. Fügen Sie es vorsichtig in den Proteintropfen und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren kopfüber dreimal. Der Tropfen muss halbsphärisch bleiben, ohne Blasen.
    5. Schrauben Sie die Stütze auf den entsprechenden Brunnen. Wiederholen Sie den Vorgang für das gesamte Kit.
    6. Nach dem Aufstellen der Platten, beobachten Sie jeden Tropfen mit einem Fernglas. Lesen Sie die Benutzeranleitung des Kristallisationskits für die Interpretation (klarer Tropfen, Phasentrennung, Niederschlag, Nadeln usw.).
    7. Inkubieren Sie die Platten bei 20 °C. Überprüfen Sie die Platten einmal täglich in der ersten Woche und einmal pro Woche danach.
    8. Bewerten Sie jeden gut mit dem Spielberichtsbogen und der Bedienungsanleitung, die mit den Kristallisationskits geliefert wird.
  2. Kristallisationsoptimierung
    ANMERKUNG: Die anfänglichen Kristallisationsbedingungen des dodecamerischen TmPep1050 wurden auf 2,1 M DL-Malsäure pH 6,75 und 0,18 M Tri-Ammoniumcitrat pH 7,5 optimiert, 40% (w/v) PEG3350, während der Kristallisationszustand von dimeric TmPep1050 auf 0,1 M Natriumcitrat pH 6,0, 10% (w/v) PEG3350 verschoben wurde. Ein Zyklus der Aussaat war notwendig, um die Kristallinität zu verbessern. Im Folgenden wird beschrieben, wie die Kristallisation der Variante TmPep1050H60A H307A optimiert wurde.
    1. Bereiten Sie Lagerlösungen mit 0,5 M Natriumcitratpuffer mit unterschiedlichem pH-Wert (4,5, 5,2 und 6,0) und 50 % (w/v) PEG3350-Lösung vor.
    2. Richten Sie eine Kristallisationsplatte als Matrix von pH vs. Niederschlagsmittel ein (siehe Abbildung 4A).
    3. Inkubieren Sie die Platte bei 20 °C. Beobachten Sie jeden Gut mit einem Fernglas einmal pro Tag während der Woche.
    4. Bewerten Sie jeden gut nach Kristallgröße und Form. Wählen Sie eine Bedingung aus, die Kristalle von mindestens 50 m ergibt. Fahren Sie mit Microseeding fort.
  3. Microseeding
    HINWEIS: Microseeding ist eine leistungsstarke Methode, um die Form, Größe und Kristallinität von Proteinkristallen zu verbessern34. Ein schnellerer Seeding-Ansatz ist die Streifenaussaat mit einem Katzenschnurrbart. Siehe Abbildung 4 als Beispiel, wie Kristallisationsoptimierung und Mikrosätung die Kristallform und -größe für TmPep1050H60A H307Averbessert haben.
    1. Bereiten Sie die Samen mit dem ausgewählten Brunnen in Schritt 3.2.4 vor.
    2. Erhöhen Sie das Volumen eines Tropfens, der Kristalle enthält, auf 10 l, indem Sie Kristallisationslösung aus dem Brunnen hinzufügen. Pipet den Tropfen und fügen Sie 90 L Kristallisationslösung aus dem Brunnen. Wirbel gründlich und halten Sie die Samen auf Eis.
    3. Bereiten Sie mehrere Verdünnungen der Samen vor: 1x, 10x, 25x und 100x. Wirbel gut die Samen vor dem Pipetieren. Halten Sie die Verdünnungen auf Eis.
    4. Richten Sie für jede Saatgutverdünnung eine Kristallisationsplatte als Matrix von pH vs. Niederschlagsmittel ein (siehe Abbildung 4B). Verwenden Sie die in Schritt 3.2.1 vorbereiteten Lagerlösungen.
    5. Wenn Sie den Tropfen machen, fügen Sie 0,2 l Samen für einen Tropfen von 2 L hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 20 °C. Beobachten Sie jeden Gut mit einem Fernglas einmal pro Tag während der Woche.
      HINWEIS: Die Verteilung und Form der Kristallgröße muss verbessert werden, siehe Abbildung 4C als Beispiel für TmPep1050H60A H307A. Für weitere Verwendungen können Samen bei -20 °C gelagert werden.

4. Röntgenbeugung

  1. Kristall-Picking
    HINWEIS: Die Probenvorbereitung hängt von der Röntgenquelle ab (Heimeinrichtung vs. Synchrotron). Verwenden Sie Die Speichergeräte (Fläschchen und Fläschchenhalterkorb) entsprechend. Die Zugabe von Kryoprotektoren (z. B. Glycerin) kann je nach Salz-/Fällungsmittelkonzentration erforderlich sein. Für TmPep1050 Kristalle ist ein Kryoprotektor nicht notwendig, da PEG oder Pufferkonzentration hoch genug ist, um Wasserkristalle zu vermeiden.
    1. Bereiten Sie ein Bad mit flüssigem Stickstoff gefüllt, tauchen Sie alle Fläschchen oder Korb für die Probenhandhabung verwendet.
    2. Musterkommissionierschleifen in verschiedenen Größen einrichten: 100, 150 und 200 m (Materialtabelle). Wählen Sie die Größen nach der Kristallgröße.
    3. Überprüfen Sie mit einem Fernglas den Tropfen, der Kristalle enthält, und erkennen Sie isolierte Kristalle (die einfachste Zupfung). Mit einer Schleife, wählen Sie vorsichtig einen Kristall von unten. Tauchen Sie die Schleife sofort in flüssigen Stickstoff und legen Sie die Schleife in eine geeignete Durchstechflasche.
  2. Datenerfassung
    HINWEIS: Die Datenerfassung kann je nach Röntgenquelle (Home-Einrichtung vs. Synchrotron) und Detektorempfindlichkeit stark variieren. Die Sammelstrategie kann sich auch je nach Auflösung, Spotintensität, Raumgruppe usw. stark von einer Probe zur anderen unterscheiden. Das Thema wurde von Dauter35ausführlich begutachtet.
    1. Montieren Sie die Schleife, die den Kristall auf dem Goniometerkopf des Diffraktometers trägt.
    2. Stimmen Sie den Goniometerkopf entlang der XYZ-Achsen an, um den Kristall am Röntgenstrahlpfad auszurichten.
    3. Stellen Sie die Wellenlänge auf 0,98 ° und bewegen Sie den Detektor, um 2 ° Auflösung zu erhalten.
    4. Starten Sie eine kurze Datensammlung, indem Sie Bilder in mindestens zwei verschiedenen Kristallausrichtungen erfassen. Nehmen Sie 10 Bilder (1 Bild pro 0,1°) bei 0° und 90° auf.
    5. Überprüfen Sie die gesammelten Bilder mit geeigneter Software (z.B. ADXV, XDS-Viewer oder Albula Viewer). Bestimmen Sie die Spotintensität und die höchste Auflösung, in der Spots zu sehen sind. Überprüfen Sie auch die Monokristallinität und Punkttrennung.
    6. Wiederholen Sie schließlich die Schritte 4.2.3-4.2.5, indem Sie die Detektorposition für eine höhere oder niedrigere Auflösung und die Belichtungszeit entsprechend der Beobachtung ändern.
    7. Starten Sie die Datenerfassung um 360° mit 1 Bild pro 0,1° aufgenommen. Denken Sie daran, die Detektorposition und Belichtungszeit optimal einzustellen.

5. Indexierung, molekularer Ersatz und Modellbau

  1. Indexierung
    ANMERKUNG: Die Indexierung ist eine Methode zur Messung der Beugungsfleckintensität, die die Amplituden von Strukturfaktoren36ergibt. Vier Softwarepakete werden häufig für die Verarbeitung gesammelter Bilder verwendet: Mosflm37, HKL200038, DIALS39und XDS40. Letzteres wurde zur Indizierung der Datensätze verwendet, die aus der Kristallbeugung TmPep1050 gewonnen wurden.
    1. Installieren Sie das XDS-Paket und XDSME41. Wenn Sie HDF5-Dateien verarbeiten, installieren Sie das XDS Neggia Plugin (verfügbar auf der Dectris-Website). Weitere Informationen finden Sie auf der XDS-Wiki-Webseite https://strucbio.biologie.uni-konstanz.de/xdswiki/index.php/Main_Page und der XDSME-Webseite https://github.com/legrandp/xdsme.
    2. Erstellen Sie vor der Verarbeitung von Daten einen Ordner, in dem XDS ausgeführt wird. Suchen Sie den Pfad zu den Bildern.
    3. Um XDSME auszuführen, geben Sie xdsme /path_to_images/image.extension in einem Terminalfenster ein.
    4. Nachdem XDS den Auftrag beendet hat, überprüfen Sie die KORREKTUR. LP-Datei. Beachten Sie die Wahrscheinlichkeit der Raumgruppenbestimmung, die Vollständigkeit der Daten, die höchste Auflösung, die Kristallmosaikität und die Datenqualität. Überprüfen Sie auch XDS_pointless.log, um die Wahrscheinlichkeit von Raumgruppen zu erhalten.
      HINWEIS: Siehe Abbildung 5 als Beispiel für die Ausgabe.
    5. Führen Sie XDSME mit verschiedenen Raumgruppenlösungen, die von XDS vorgeschlagen werden, in einem separaten Ordner erneut aus, um das Überschreiben des vorherigen Prozesses zu vermeiden. Typ xdsme -s space_group_name -c "unit_cell_parameters" /path_to_images/image.extension (z.B. xdsme -s P21 -c "43.295 137.812 61.118 90.000 110.716 90.000).
    6. Überprüfen Sie die KORREKT. LP-Dateien und wählen Sie die beste Lösung basierend auf Datenstatistiken.
    7. Führen Sie XSCALE aus, indem Sie xscale.py XDS_ASCII eingeben. HKL. Führen Sie XDSCONV aus, indem Sie xdsconv.py XSCALE eingeben. HKL ccp4.
      HINWEIS: In einigen Fällen kann XDSME die Raumgruppe nicht identifizieren oder den Auflösungsbereich nicht richtig schneiden oder seltsame Datenstatistiken generieren. Wenn ein solches Problem auftritt, lohnt es sich, XDS nativ auszuführen. Im XDS müssen mehrere Parameter eingeführt werden. INP-Initiativdatei (siehe XDS-Wiki-Seite). Bei Verwendung von XDS kann die Wahrscheinlichkeit möglicher Raumgruppen mit Pointless, einem Teil des CCP4-Pakets42,überprüft werden. Um die Auflösung des Datensatzes zu reduzieren, werdenR-Meas < 60% und I/σ 2 allgemein akzeptiert, um die höchste Auflösung zu bestimmen43. Der molekulare Ersatz und die Modellverfeinerung können jedoch verbessert werden, indem die Auflösung auf I/σ von 0,5 ,1,5 und CC1/2 auf 0,2 bis 0,444erweitert wird.
  2. Molekularer Ersatz
    HINWEIS: Experimentelle Daten geben Zugang zur Amplitude struktureller Faktoren, sind aber, ohne die Phase zu kennen, nutzlos. Die Phase kann experimentell mit verschiedenen Methoden bestimmt werden, die sich auf ein anomales Signal (z.B. von einem schweren Atom)45stützen. Molekularer Ersatz ist eine weitere Methode zur Bestimmung der Phase ohne anomale Streuatom46,47. Diese Methode verwendet die Koordinaten eines verwandten Moleküls, um die Phase iterativ zu finden und zu verbessern. Wir verwenden Phaser48 in Phenix GUI49 für den molekularen Ersatz.
    1. Bereiten Sie das Startmodell für den molekularen Ersatz mit 4P6Y-Koordinaten vor. Extrahieren Sie aus der pdb-Datei das Monomer A und abschneiden Sie seine Aminosäuren in Alanin mit dem PDB-Dateieditor in Phenix (unter der Registerkarte Modellwerkzeuge).
    2. Führen Sie Xtriage in Phenix (unter der Registerkarte Datenanalyse) mit der von XDSCONV (5.1.9) generierten Reflexionsdatei und der Sequenz als Eingaben aus.
    3. Überprüfen Sie die Protokolldatei von Xtriage. Beachten Sie die Vollständigkeit, die Anzahl der Untereinheiten in der asymmetrischen Einheit, die Anisotropie, das Vorhandensein von Eisringen und das Auftreten von Partnerschaften.
    4. Führen Sie Phaser-MR in Phenix (unter der Registerkarte Molekularer Ersatz) zum molekularen Ersatz mit der Reflexionsdatei, der Sequenz und dem startende 4P6Y-Modell aus, das in Polyalanin abgeschnitten ist (Schritt 5.2.1).
    5. Überprüfen Sie nach Abschluss, ob ein Modell gefunden wurde und wie hoch der molekulare Ersatz ist. Ein Übersetzungsfaktor Z-score (TFZ) von mindestens 8 gibt an, dass die Lösung definitiv korrekt ist.
  3. Modellbau
    HINWEIS: Nach der Bestimmung der Phase durch molekularen Ersatz muss das Modell gebaut und verfeinert werden. Dieses Protokoll verwendet Phenix GUI49 für automatisches Erstellen und iterative Verfeinerungen und Coot50 für manuelle Strukturerstellung und Verfeinerung.
    1. Nach dem molekularen Austausch mit Phase-MR in Phenix wählen Sie Autobuild ausführenaus. Alle erforderlichen Dateien werden automatisch hinzugefügt. Drücken Sie einfach Run, um Autobuild zu starten.
    2. Überprüfen Sie nach Abschluss das Modell in Coot. Erstellen und verfeinern Sie das Modell manuell entsprechend der Elektronendichtekarte in Coot.
    3. Verfeinern Sie das manuell kuratierte Modell in Phenix (auf der Registerkarte Verfeinerung) mit dem Modell, der Sequenz und den Beugungsdaten als Eingaben. Siehe Phenix Hilfe, um die richtige Strategie zu wählen.
    4. Überprüfen Sie nach der Verfeinerung die Ergebnisse:R-frei undR-Arbeit muss abnehmen, Molprobity51 Indikatoren müssen respektiert werden, und Ausreißer mit geringer Realraumkorrelation müssen begrenzt werden.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.2-5.3.4, bis das am besten verfeinerte Modell generiert wird.
    6. Führen Sie Molprobity auf dem Server aus: http://molprobity.biochem.duke.edu/. Überprüfen Sie alle Ausreißer, die von Molprobity identifiziert wurden.
    7. Wiederholen Sie schließlich die Schritte 5.3.2-5.3.6, bis das beste verfeinerte Modell erhalten ist.

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Ergebnisse

Um eine mögliche Dodecamer-Dissoziation in Monomere in TmPep1050 zu untersuchen, wurden die His-60 und His-307 Codons durch Alanin-Codon mit einem synthetischen Gen ersetzt. Dieses Gen wurde dann im pBAD-Vektor zur Expression und Reinigung der entsprechenden TmPep1050-Variante mit dem anschließenden Namen TmPep1050H60A H307Ageklont. Die Größenausschlusschromatographie (Abbildung 3B) zeigte, dass das gereinigte Protein ein scheinbares Molekulargewicht von 56 kDa hatte (Molekulargew...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht das Verständnis des Dimer-Dodedecamer-Übergangs von TmPep1050 auf struktureller Ebene. Die Methodik wurde bereits bei der Bestimmung der Struktur der beiden TmPep1050 Oligomere11erlebt. Der schwierigste Schritt bestand darin, Bedingungen zu finden, die die Dissoziation von Dodecamern in stabile Dimer fördern. Solche Bedingungen mussten mild genug sein, um die Wiedervereinigung von Dimern in Dodecameer zu ermöglichen, wenn der Metallionenkofaktor hinzugefü...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Martine Roovers für das Korrekturlesen dieses Papiers und die konstruktiven Kommentare. Der Zugang zu Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) erfolgte innerhalb der Block Allocation Groups 20151139.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,10-PhenanthrolinSigma-Aldrich13, 137-7
Amicon Ultra 0,5 ml Zentrifugalfilter Ultracel 30KMerck MilliporeUFC503096
Amicon Ultra 15 Zentrifugalfilter Ultracel 30KMerck MilliporeUFC903024
Benzonase NukleaseMerck Millipore70664-3
CCP4N/Avisit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-freeRoche5056489001
CootN/Avisit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen IHampton ResearchHR2-110
Crystal Screen IIHampton ResearchHR2-112
DreamTaq Green PCR MasterMix ThermoFisher ScientificK1082
EasyXtal 15-Well-ToolNeXtal132007
Escherichia coli PPY StammN/Asiehe Referenz 31
Escherichia coli XL1 blauer StammAgilent200249
Gel Filtration Calibration Kit HMWGE Healthcare Life Sciences28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMWGE Gesundheitswesen Life Sciences28-4038-41
Gel-FiltrationsstandardBiorad1511901
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermoFisher ScientificK0503
IndexHampton ResearchHR2-144
LitholoopsMolekulare Dimensionen
L-Leucin-p-NitroanilidBachem AG
Natrix 1Hampton ResearchHR2-116
Natrix 2Hampton ResearchHR2-117
Neggia pluginDectrisN/Azu https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite INeXtal130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IINeXtal130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IIINeXtal130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IVNeXtal130727
pBAD-TOPOThermoFisher ScientificK430001
PhenixN/ABesuch https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA-PolymeraseThermoFisher ScientificF-530L
Salz RX 1Hampton ResearchHR2-107
Salz RX 2Hampton ResearchHR2-109
SnakeSkin Dialyseschlauch, 3,5 K MWCOThermoFisher Scientific88242
Quelle 15PheGE Healthcare Life Sciences17014702
Quelle 15QGE Healthcare Life Sciences17094705
Superdex 200 VorbereitungsqualitätGE Healthcare Life Sciences17104301
Thermotoga maritima MSB8 StammAmerican Type Culture CollectionATCC 43589
TmCD00089984DNASU Plasmid RepositoryN/A
XDSN/ABesuch http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsmeN/ABesuch https://github.com/legrandp/xdsme
40010720025

Referenzen

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639(2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059(2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876(2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601(2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61(2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55(2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227(2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , Jan 26, 2018. Zenodo (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

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