Methodenartikel

Papierbasierte Vorkonzentration und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen

DOI:

10.3791/61292

⸱

29. April 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Präsentiert wird ein Protokoll zur Herstellung eines papierbasierten Geräts zur effektiven Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen.

Zusammenfassung

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Mikrovesikeln und Exosomen sind kleine membranöse Vesikel, die in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt und im ganzen Körper zirkuliert. Da sie verschiedene elterzellabgeleitete Biomoleküle wie DNA, mRNA, miRNA, Proteine und Lipide enthalten, sind ihre Anreicherung und Isolierung entscheidende Schritte für ihre Ausnutzung als potenzielle Biomarker für klinische Anwendungen. Herkömmliche Isolationsmethoden (z. B. Ultrazentrifugation) verursachen jedoch signifikante Verluste und Schäden an Mikrovesikeln und Exosomen. Diese Methoden erfordern auch mehrere sich wiederholende Schritte der Ultrazentrifugation, Desagung und Verschwendung von Reagenzien. Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung eines Origami-Papier-basierten Geräts (Exo-PAD), das für die effektive Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen auf einfache Weise entwickelt wurde. Das einzigartige Design des Exo-PAD, bestehend aus akkordeonartigen mehrfaltigen Schichten mit konvergenten Probenbereichen, ist in die Ionenkonzentrationspolarisationstechnik integriert und ermöglicht so eine fünffache Anreicherung der Mikrovesiken und Exosomen auf bestimmte Schichten. Darüber hinaus werden die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen durch einfaches Entfalten des Exo-PAD isoliert.

Einleitung

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Mikrovesikeln und Exosomen sind kleine Membranbläschen mit einer Größe von 0,2 x 1 m bzw. 30 bis 200 nm. Sie werden von mehreren verschiedenen Zelltypen1,2,3,4,5in die extrazelluläre Umgebung sezerniert. Sie enthalten elterliche Zellinformationen in Form von Teilmengen von DNA, mRNA, miRNA, Proteinen und Lipiden und zirkulieren im ganzen Körper über verschiedene Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Fruchtwasser und Speichel6,7,8,9. So können Techniken zur effizienten Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen aus biologischen Flüssigkeiten umfangreiche Möglichkeiten in den Bereichen Diagnose, Prognose und Echtzeitüberwachung von Krankheiten sowie bei der Entwicklung neuer Therapeutika bieten.

Die herkömmliche Isolationsmethode für Mikrovesikeln und Exosomen auf Basis der Ultrazentrifugation ist jedoch extrem zeitaufwändig und verursacht einen erheblichen Verlust und eine Kontamination der Probe. Dies liegt daran, es beinhaltet mehrere umständliche Pipettier- und Ladeschritte und das Wegwerfen verschiedener Reagenzien mit wiederholter Ultrazentrifugation5,6,10,11,12. Darüber hinaus kann die hohe Scherspannung, die durch Ultrazentrifugation induziert wird (100.000 x g), die physikalische Lyse von Mikrovesikeln und Exosomen verursachen und zu schlechten Rückgewinnungsraten (5-23%)6,13,14führen. Daher muss eine hocheffiziente, unauffällige Isolationstechnik für Mikrovesikeln und Exosomen entwickelt werden, um Schäden und Verluste zu reduzieren und so höhere Rückgewinnungsraten zu erzielen.

Ein Origami-Papier-basiertes Gerät (Exo-PAD) wurde für eine einfachere, schonendere und hocheffiziente Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen6entwickelt. Das Design des Exo-PAD ist ein mehrfaches Papier mit seriell verbundenen Probenbereichen, die allmählich im Durchmesser abnehmen. Die Ionkonzentrationspolarisationstechnik (ICP), ein nano-elektrokinetisches Phänomen, das geladene Biomoleküle vorkonzentriert, wurde in dieses einzigartige Design integriert. Der Einsatz des Exo-PAD führte zu einer fünffachen Anreicherung der Mikrovesikeln und Exosomen in bestimmten Schichten und deren Isolierung durch einfaches Entfalten des Geräts. Dieser Artikel beschreibt die Exo-PAD im Detail, von der gesamten Gerätefertigung und -bedienung bis zur Analyse ihrer Verwendung, um die Methode zu veranschaulichen und repräsentative Ergebnisse zu zeigen6.

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Protokoll

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1. Gerätefertigung

  1. Definieren Sie den Bereich, der auf Papier gedruckt werden soll, mit DerDruckersoftware (Tabelle der Materialien).
    HINWEIS: Das Design hat 12 wachsgemusterte Schichten, in denen sich die Durchmesser der kreisförmigen Probenbereiche allmählich von 5 mm bis 2 mm verengen(Abbildung 1A).
  2. Drucken Sie hydrophobes Wachs auf den ausgewiesenen Bereichen auf beiden Seiten des Zellulosepapiers (Materialtabelle) mit einem kommerziellen Wachsdrucker (Materialtabelle) (Abbildung 1B).
  3. Das wachsbedruckte Papier in einen Laborofen für 80 s bei 120 °C stellen.
    HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es dem Wachs, die Innenseite des Papiers zu erreichen, indem es einen thermischen Rückfluss des bedruckten Wachses erreicht. Bei diesem Inkubationsprotokoll beträgt die Auflösung des Musters 2 mm. Achten Sie also darauf, keine Muster von weniger als 2 mm zu drucken. Andernfalls werden die Muster durch das Wachs blockiert.
  4. Schneiden Sie das wachsbedruckte Papier mit einem Fräser, um einzelne Geräte herzustellen (Abbildung 1C).
  5. Tropfen Sie 5 l und 2 l permselektive Membran (z. B. Nafion; Materialtabelle) auf die Stichprobenbereiche in der linken bzw. rechten Schicht(Abbildung 1D).
  6. Legen Sie die mit der permselektiven Membran beschichteten Schichten 30 min bei 70 °C auf eine Kochplatte, um das permselektive Membranlösungsmittel zu verdampfen.
  7. Versiegeln Sie die äußerste Oberfläche der beschichteten Schicht gegenüber der Pufferlösung mit druckempfindlichem Klebeband und hinterlassen Sie ein kleines Loch.
  8. Falten Sie das gedruckte Einzelgerät (z.B. Exo-PAD) entlang der weißen Linien hin und her.
    HINWEIS: Durch Falten des Geräts werden alle Probenbereiche konvergend verbunden (Abbildung 1E). Dieses konvergente Design fokussiert die elektrischen Feldleitungen, wenn die Spannung für ICP angewendet wird, wodurch eine intensivere Vorkonzentration der Mikrovesiken und Exosomen erreicht wird.

2. Anreicherung und räumliche Fokussierung von Mikrovesikeln und Exosomen durch Ionenkonzentrationspolarisation

  1. Laden Sie 15 l der Mikrovesikel- und Exosomenprobe (3 x 1011 Partikel/ml in 0,1x Phosphatgepufferte Saline [PBS] mit 0,05 % Tween 20) in die konvergenten Probenbereiche durch Pipetieren und warten Sie einige Sekunden, um eine vollständige Benetzung aller Probenbereiche sicherzustellen (Abbildung 1F).
  2. Legen Sie zwei Acrylkammern an beiden Enden des Exo-PAD und klemmen Sie den Exo-PAD sicher mit kleinen Bindeklammern, um eine Entfaltung zu verhindern (Abbildung 1G).
  3. Füllen Sie die Kammern mit 110 l 0,1x PBS und setzen Sie zwei Ag/AgCl-Elektroden ein (Abbildung 1H).
  4. 30 V auf die Elektroden für 20 min mit einem Strom-Spannungs-Quellenmesssystem (Materialtabelle )auftragen.
    HINWEIS: Die angelegte Spannung erzeugt das ICP-Phänomen und konzentriert damit die Mikrovesiken und Exosomen auf die Schichten 8 und 9 des Exo-PAD.

3. Isolierung der angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen

  1. Trennen Sie den gefalteten Exo-PAD von den Acrylkammern und entfalten Sie das Gerät, um die angereicherten Mikrovesiken und Exosomen von den anderen Schichten zu isolieren (Abbildung 1I).
  2. Die Probenbereiche in den Schichten 8 und 9, in denen die Mikrovesiken und Exosomen angereichert sind, für die nachgelagerte Analyse herausstechen (Abbildung 1J).

4. Rasterelektronenmikroskopische Analyse

  1. Fixieren Sie die angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen, indem Sie die gestanzten Bereiche in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium-Cakodylat-Puffer für 1 h und in 1% Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcakodylat für 1 h eintauchen.
    VORSICHT: Osmiumtetroxid ist hochgiftig und gefährlich chemisch. Da Osmiumtetroxid in Kunststoffe eindringen kann, muss es in Glas gelagert werden. Jede Handhabung von Osmiumtetroxid muss in einer chemischen Rauchhaube mit doppelten Nitrilhandschuhen erfolgen.
  2. Dehydrieren Sie die festen Mikrovesikeln und Exosomen mit aufsteigenden Qualitäten von 200 nachgewiesenem Ethanol (d. h. 50 %, 70 %, 90 % und 100 %) für jeweils 30 min.
  3. Trocknen Sie die Probe chemisch, indem Sie sie 30 min lang in Hexamethyldisilazan in einen Trockenbaumittel eintauchen.
    VORSICHT: Hexamethyldisilazan ist eine brennbare und feuchtigkeitsempfindliche Chemikalie. Es muss in einem trockenen und gut belüfteten Bereich abseits von Zündquellen gelagert werden.
  4. Beschichten Sie die vollständig getrockneten Mikrovesiken und Exosomen mit Gold/Palladium (ca. 20 nm) über Sputtern und erfassen Sie Rasterelektronenmikroskopie (SEM)-Bilder.

5. Nanopartikel-Tracking-Analyse

  1. Stanzen Sie die Probenbereiche in den Schichten 6, 8 und 10 mit einem Biopsie-Punch nach 20 min Gerätebetrieb aus.
  2. Tauchen Sie jeden ausgestanzten Bereich in Pufferlösung ein (0,1x PBS mit 0,01% Tween 20).
  3. Wirbel für 10 min und Zentrifuge für 30 s bei 6.000 U/min, um die angereicherten Mikrovesikeln und Exosomen wieder auszusetzen.
  4. Entfernen Sie die ausgestanzten Bereiche aus der Lösung und messen Sie die Konzentration von Mikrovesikeln und Exosomen mit einem Nanopartikel-Tracking-Analyse-Analyse-Instrument (NTA)(Tabelle der Materialien).

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Ergebnisse

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Die Betriebszeit muss optimiert werden, um die maximale Rückgewinnungsausbeute der angereicherten Mikrovesiken und Exosomen zu erreichen. Unzureichende Zeit erlaubt keine ausreichende Migration der Mikrovesiken und Exosomen, was die Anreicherung verringert, während übermäßige Zeit die räumliche Fokussierung verschlechtert und somit die Mikrovesiken und Exosomen dispergiert. So kann durch den Zeitoptimierungsschritt der maximale Präkonzentrationsfaktor von Mikrovesikeln und Exosomen und der endgültige Ort, an dem Mikroves...

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Diskussion

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Obwohl der Exo-PAD erfolgreich zur Anreicherung und Isolierung von Mikrovesikeln und Exosomen eingesetzt wurde, sollten mehrere kritische Punkte sorgfältig berücksichtigt werden: 1) die Inkubationszeit und -temperatur des Ofens während der Gerätevorbereitung, 2) Verarbeitungszeit, 3) Anwendung von Spannung mit unterschiedlichen Schichtzahlen und Probenflächendurchmessern und 4) Anwendbarkeit auf klinische Proben.

Die im Protokoll angegebene Inkubationszeit und -temperatur sind optimierte Bedin...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Studie wurde von der National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444 unterstützt. J. H. Lee wurde 2019 durch ein Forschungsstipendium der Kwangwoon University unterstützt. Hyerin Kim wurde vom "Competency Development Program for Industry Specialists" des koreanischen Ministeriums für Handel, Industrie und Energie (MOTIE) unterstützt, das vom Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-Programm zur industriellen Konvergenz tragbarer Intelligenter Geräte).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ag/AgCl-ElektrodenA-M Systems, Inc.531500mit 0,15" Durchmesser
aus Rinderserum (BSA), Alexa Fluor 594 KonjugatThermo Fisher ScientificA13101BSA, konjugiert mit Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Karbonat-Bicarbonat-PufferSigma-AldrichC3041-50CAPKarbonat-Puffer
CorelDraw-Software (Coral Co., Kanada)Corel CorporationDruckersoftware zur Definition des Wachsdrucks Region
ColorQube 8870Xerox CorporationWachsdrucker
Chromatographiepapier Klasse 1Whatman3001-861Zellulosepapier, Abmessung: 20 * 20 cm
Fluoreszenzmarkierte ExosomenstandardsHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100Exosom markiert mit FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 Strom-/SpannungsquellenmessgerätKeithley Instruments, Inc.Aktuell– Spannungsquellen-Messsystem
Nafion perfluorierte HarzlösungSigma-Aldrich31175-20-9Permselektive Membran, 20 Gew.-% in der Mischung aus niederen aliphatischen Alkoholen und Wasser; enthält 34 % Wasser
NanoSight LM10NanoSight TechnologyNanoparticle Tracking Analysis (NTA) Gerät
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH7,4)Thermo Fisher Scientific10010001
Albumin

Referenzen

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Schlagwörter

Paper Based DeviceMicrovesicle IsolationExosome EnrichmentIon Concentration PolarizationWax Patterned LayersPerm Selective MembraneElectrokinetic PreconcentrationFluorescence QuantificationSEM AnalysisProtein Rich Samples

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