Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.
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Methodenartikel
Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Beitrag der Mitochondrien zur onkogenen Transformation ist ein Thema von großem Interesse und aktiver Studie. Da das Feld des Krebsstoffwechsels komplexer wird, wird das Ziel, Mitochondrien mit verschiedenen Verbindungen anzugreifen, die mitochondriale Schäden verursachen (sogenannte Mitocans), immer beliebter. Leider benötigen viele bestehende Zytotoxizitätstests, wie z. B. solche, die auf Tetrazoliumsalzen oder Resazurin basieren, funktionelle mitochondriale Enzyme für ihre Leistung. Der Schaden, der durch Verbindungen verursacht wird, die auf Mitochondrien abzielen, beeinträchtigt oft die Genauigkeit dieser Assays. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll, das auf Differentialfärbung mit zwei fluoreszierenden Farbstoffen basiert, von denen einer zellpermeant (Hoechst 33342) und der andere nicht (Propidiumiodid) ist. Der Unterschied in der Färbung ermöglicht es, lebende und abgestorbene Zellen zu diskriminieren. Der Assay ist für die automatisierte Mikroskopie und Bildanalyse zugänglich, was den Durchsatz erhöht und Verzerrungen reduziert. Dies ermöglicht auch die Verwendung des Assays in High-Throughput-Manier mit 96-Well-Platten, so dass es eine praktikable Option für Drogenentdeckungbemühungen, vor allem, wenn die betreffenden Medikamente haben ein gewisses Maß an Mitotoxizität. Wichtig ist, dass die Ergebnisse des Hoechst/PI-Färbetestes eine erhöhte Konsistenz aufweisen, sowohl mit Trypan-Blau-Ausschlussergebnissen als auch zwischen biologischen Replikationen, wenn der Test mit anderen Methoden verglichen wird.
Einleitung
Der erste Schritt zur Identifizierung wirksamer Krebsbehandlungen ist die Auswahl eines robusten, unvoreingenommenen Zytotoxizitäts-Assays, der verwendet werden kann, um die Wirkung der Behandlung zu untersuchen. Eine häufige Wahl für Versuche mit niedrigem Durchsatz ist der Ausschluss von Trypan-Blaufarbstoff enthäupfen zellendes. Diese Methode wird bevorzugt, weil sie eine relativ unvoreingenommene Methode zur Quantifizierung des Zellüberlebens ermöglicht. Trypan blau diffundiert passiv in Zellen, deren Membranen kompromittiert sind, aber es wird effektiv daran gehindert, in gesunde Zellen einzudringen1. Der Quotient der lebenden Zellen und d....
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Protokoll
1. Zytotoxizitätstest: Setup
- Herstellung von Lösungen von Verbindungen von Interesse bei gewünschten Konzentrationen in den entsprechenden Medien (serumfrei oder 1, 2,5 oder 5% FBS RPMI-1640).
- Zur Messung der Zytotoxizität einer einzelnen Verbindung (z. B. zur Bestimmung der effektiven Dosen) bereiten Sie Verbindungen in 2x Endkonzentration vor.
- Zur Messung der Zytotoxizität von zusammengesetzten Kombinationen, bereiten Sie Verbindungen in 4x Endkonzentration vor.
- Bereiten Sie nur Lösungsmittelsteuerungen vor, indem Sie die gleiche Menge Lösungsmittel mit dem entsprechenden Medium mischen. Wenn z. B. in DMSO und Methanol gelöste....
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Ergebnisse
Das oben genannte Protokoll wurde mit OCI-AML2-Zellen entwickelt, die als repräsentative akute myeloische Leukämie-Zelllinie genommen wurden. AML ist durch abnorme Proliferation undifferenzierter und nicht-funktioneller hämatopoetischer Zellen im Knochenmarkgekennzeichnet 26. Trotz der jüngsten Entwicklungen in der AML-gezielten Therapie, ist der Standard der Pflege seit mehreren Jahrzehnten unverändert geblieben, und besteht aus Induktionstherapie (in der Regel bestehend aus drei Tagen Anthracycl.......
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Diskussion
Obwohl das Protokoll für Hoechst/PI Cytotoxizität-Assay robust ist und vergleichsweise wenig Hands-on-Zeit erfordert, gibt es mehrere experimentelle Details, die sehr wichtig sind, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten. Zunächst ist darauf zu achten, dass die DMSO-Konzentration unter 0,5 % (v/v) bleibt. Es ist allgemein vereinbart, dass die Exposition gegenüber selbst niedrigen Dosen von DMSO die Morphologie und Anhaftung von Zellen wesentlich verändern und die Zellzyklusprogression signifikant verzögern kann
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
NVK, ein CPRIT-Stipendiat in der Krebsforschung, dankt dem Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) für die großzügige Unterstützung, CPRIT-Stipendium RR150044. Diese Arbeit wurde auch durch den Welch Foundation Research Grant C-1930 und von den National Institutes of Health R35 GM129294 an NVK verliehen. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-Deoxy-D-Glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-Brom-Pyruvat | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well-Platten | Greiner Bio-One | 655090 | 96-Well-Platten mit schwarzem oder klarem Flachboden |
| Alamar Blue HS Reagenz für die Zellviabilität (100 ml) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automatisierter Zellzähler | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM Lösung; Endkonzentration 1:1.000 |
| HyClone fötales Rinderserum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-Chlorphenylhydrazon/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS Tabletten | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 Tablette + 200 mL steriles Wasser = 1x PBS Lösung |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH Assay Kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidiumiodid | Thermo Fisher | 50-596-072 | Trockenes Pulver; Bestand 1 mg/mL in PBS; Endkonzentration 5 & Mikro; g/ml (Leukämiezellen), 1 & Mikro; g/mL (normale PBMCs) |
| Rotenon | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium Mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkultur | Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolylblau-Tetrazoliumbromid | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypanblau-Färbung (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Zelllinien | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML-Zelllinie |
| MOLM-13 | ATCC | AML-Zelllinie | |
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL-Zelllinie |
| OCI-AML2 | ATCC | AML-Zelllinie |
Referenzen
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
