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Methodenartikel

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

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DOI:

10.3791/61297

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15. Mai 2020

 ,  , 
1Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, 2Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin in Drosophila-Embryonen zu injizieren und die intranukleare Aktinstabsmontage nach Hitzestress abzubilden.

Zusammenfassung

Der Zweck dieses Protokolls ist es, intranukleare Aktinstäbe zu visualisieren, die sich in lebenden Drosophila melanogaster Embryonen nach Hitzestress zusammensetzen. Actin-Stäbe sind ein Kennzeichen einer konservierten, induktiven Actin Stress Response (ASR), die menschliche Pathologien begleitet, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Zuvor haben wir gezeigt, dass die ASR zu Morphogenese-Ausfällen und einer verminderten Lebensfähigkeit der sich entwickelnden Embryonen beiträgt. Dieses Protokoll ermöglicht die kontinuierliche Untersuchung der Mechanismen, die der Aktinstabbaugruppe und der ASR in einem Modellsystem zugrunde liegen, das sehr bildgebend, genetisch und biochemie geeignet ist. Embryonen werden gesammelt und auf einem Deckslip montiert, um sie für die Injektion vorzubereiten. Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin (G-ActinRed) wird verdünnt und in eine Mikronadel geladen. Eine einzige Injektion erfolgt in das Zentrum jedes Embryos. Nach der Injektion werden Embryonen bei erhöhter Temperatur inkubiert und intranukleare Aktinstäbe werden dann durch konfokale Mikroskopie visualisiert. Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) Experimente können an den Aktinstäben durchgeführt werden; und andere aktinreiche Strukturen im Zytoplasma können ebenfalls abgebildet werden. Wir stellen fest, dass G-ActinRed wie endogenes G-Actin polymerisiert und allein nicht die normale Embryoentwicklung beeinträchtigt. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass während der Injektion Vorsicht geboten ist, um eine schwere Verletzung des Embryos zu vermeiden. Jedoch, mit der Praxis, Injektion von G-ActinRot in Drosophila Embryonen ist eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit, Aktin-Stäbe zu visualisieren und kann leicht mit Fliegen jeder Art oder mit der Einführung von anderen zellulären Spannungen verwendet werden, einschließlich Hypoxie und oxidativen Stress.

Einleitung

Dieses Protokoll beschreibt, wie Man G-ActinRed injizieren, um die Montage von intranuklearen Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu visualisieren, die sich einer induzierbaren Actin-Stressreaktion (ASR)1unterziehen. Wir entwickelten dieses Protokoll, um Studien der ASR zu unterstützen, die bei Embryonen zu gestörter Morphogenese und verminderter Lebensfähigkeit führt, und bei erwachsenen menschlichen Zelltypen ist mit Pathologien wie Nierenversagen2, Muskelmyopathien3und Alzheimer und Huntington4,5,6,7,8verbunden. Dieser ASR wird durch zahlreiche zelluläre Spannungen induziert, einschließlich Hitzeschock9,10,11, oxidativer Stress4,6, reduzierte ATP-Synthese12, und abnormale Huntingtin oder β-Amyloid-Oligomerisierung4,5,6,7,9,13,14,15,16. Ein Markenzeichen der ASR ist die Montage von abnormen Aktinstäben im Zytoplasma oder Kern der betroffenen Zellen, die durch stressinduzierte Hyperaktivierung eines Aktin-interagierenden Proteins, Cofilin1,5,6,10angetrieben wird. Leider bestehen nach wie vor wesentliche Wissenslücken in Bezug auf die ASR. Beispielsweise ist die Funktion der Aktinstäbe nicht bekannt. Wir verstehen nicht, warum Sichstäbe im Zytoplasma einiger Zelltypen bilden, aber der Kern anderer. Es ist auch nicht klar, ob die ASR für Zellen oder Embryonen, die sich stressfähig befinden, schützend oder maladaptiv ist. Schließlich kennen wir immer noch nicht die detaillierten Mechanismen, die der Cofilin-Hyperaktivierung oder Aktinstab-Montage zugrunde liegen. Somit bietet dieses Protokoll einen schnellen und vielseitigen Test zur Untersuchung des ASR, indem es die Aktinstabbildung und -dynamik im hochgradig beziehbaren Versuchssystem des lebenden Fruchtfliegenembryons visualisiert.

Das Protokoll zur Mikroinjektion von G-ActinRed in lebende Drosophila-Embryonen wurde ursprünglich entwickelt, um die Dynamik normaler zytoplasmatischer Aktinstrukturen17 während gewebebildender Ereignisse zu untersuchen. In diesen Studien fanden wir heraus, dass die G-Actin-Rot-Injektion die frühen Entwicklungsprozesse im Embryo, einschließlich Zytokinese oder Gastrulation17, 18, nicht beeinträchtigte. Wir modifizierten dann das Protokoll, passten die Embryo-Handhabung und G-ActinRed Injektion an, um die Bildgebung von Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu ermöglichen, die sich dem ASR1unterziehen. Andere Methoden neben G-ActinRote Injektion kann verwendet werden, um Actin in Embryonen zu visualisieren. Diese Methoden basieren auf der Exdinsiz fluoreszierender Proteine (FPs), die mit Actin oder Domänen von Actin-bindenden Proteinen wie Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP und Moesin-GFP (rezensiert in19) markiert sind. Die Verwendung dieser FP-Sonden erfordert jedoch Vorsicht, da sie einige Aktinstrukturen stabilisieren oder stören können, nicht alle Aktinstrukturen20gleich kennzeichnen und im Falle von Actin-GFP stark überexprimiert werden – problematisch für die Analyse der Stabmontage, die nicht nur stressabhängig, sondern auch aktinkonzentrationsabhängigist 1. Somit ist G-ActinRed die bevorzugte Sonde für Stabstudien an Fliegenembryonen, und die große Größe des Embryos ermöglicht seine einfache Injektion.

Der Arbeitsablauf dieses Protokolls ähnelt anderen etablierten Mikroinjektionstechniken, die zur Injektion von Proteinen, Nukleinsäuren, Medikamenten und fluoreszierenden Indikatoren in Drosophila-Embryonen 21,22,23,24,25,26,27verwendet wurden. Nach der Mikroinjektion von G-ActinRed sind Embryonen jedoch leichtem Hitzestress ausgesetzt, um die ASR- und intranukleare Aktinstab-Montage zu induzieren. Für Labore mit Zugang zu Fliegen und einem Injektionssystem sollte diese Methode für bestimmte Studienlinien in Bezug auf die ASR leicht umsetzbar und anpassungsfähig sein, einschließlich ihrer Induktion durch unterschiedliche Spannungen oder Modulation in unterschiedlichen genetischen Hintergründen.

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Protokoll

1. Bereiten Sie Embryo-Sammelbecher und Apfelsaft-Agar-Platten vor

  1. Fünf Tage vor dem Injektionsexperiment28 konstruieren oder mindestens zwei kleine Embryo-Entnahmebecher beschaffen. Machen Sie frische 60 mm Apfelsaft Agar Teller mit kleinen Sammelbechern28verwendet werden. Platten in Plastikboxen lagern, die mit feuchten Papiertüchern bei 4 °C bedeckt sind.
    HINWEIS: Kleine Embryo-Entnahmebecher, die mit Fliegenzahlen bestückt sind, wie in Schritt 1.3 beschrieben, bieten ausreichende Embryozahlen pro Experiment und sorgen gleichzeitig dafür, dass embryonale Handhabung und Injektion in kurzer Zeit durchgeführt werden können, um die Bildgebung früher Entwicklungsstadien zu ermöglichen.
  2. Apfelsaftplatten auf 18 °C erwärmen und einen Tupfer Hefepaste in die Mitte der Platte geben. Hefepaste ist eine einfache Paste aus aktiver Hefe und destilliertem Wasser.
  3. Um die großzügigste Eiablage zu fördern, stellen Sie Sammelbecher mit Fliegen 2 Tage vor dem Experiment auf. Fügen Sie mindestens 100 Weibchen und 50 männliche Fliegen zu den Sammelbechern hinzu und oben mit einer vorbereiteten Apfelsaftplatte (Abbildung 1, Schritt 1). An den Tagen vor dem Injektionsexperiment wechseln Sie die Apfelsaftplatten mindestens zweimal täglich, einmal morgens und einmal abends.
    HINWEIS: Die besten Injektions- und Bildgebungsergebnisse werden erzielt, wenn Embryo-Entnahmebecher bei 18 °C mit einem 12-h-Licht-Ein-/Licht-Aus-Zyklus aufbewahrt werden.

2. Bereiten Sie eine Arbeitsstofflösung von G-actinRed für die Mikroinjektion vor

ANMERKUNG: Dieses Präparat macht nur 2 l eines 5 mg/ml Arbeitsbestands von G-ActinRed, also wenn Benutzer nicht an die Mikroinjektionstechnik gewöhnt sind, ist es vorteilhaft, zu Schritt 3 zu springen und die Mikroinjektionen mit einem neutralen pH-Puffer zu üben, um wertvollen Arbeitsbestand zu erhalten. Der 10-g-Bestand an G-actinRed des Herstellers kann in seiner Originalverpackung in einem 16-oz-Schraubdeckelmitglas mit einem Trocknungsmittel von 500 g bei 4 °C für bis zu 6 Monate gelagert werden.

  1. Bereiten Sie eine G-Puffer-Lagerlösung im Voraus vor: 5 mM Tris-HCl, 0,2 mM CaCl2, pH 8.0. Filtern und lagern bei Raumtemperatur.
  2. Am Tag der Injektion1 ml einer G-Puffer-Arbeitslösung in einem frischen Snap-Cap-Mikrozentrifugenrohr auf Eis mit dem G-Pufferbestand ab Schritt 2.1 vorbereiten, ergänzt mit folgenden bei den angegebenen Endkonzentrationen: 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,2 mM ATP, pH 8,0.
    HINWEIS: Das Volumen der G-Puffer-Arbeitslösung mit 1 ml ist mehr als das, was für ein Experiment benötigt wird, vereinfacht aber die Vorbereitung. Überschüssiges kann nach dem Experiment verworfen werden, oder Benutzer können nach ihren Wünschen herunterskalieren.
    1. Halten Sie den 10 g-g-Actin-Rot-Bestand auf Eis, fügen Sie zuerst 1 l gefiltertes, destilliertes Wasser an die Spitze des rosa Tröpfchens von G-ActinRed in der Röhre hinzu.
    2. Als nächstes fügen Sie 1 l der kalten, frisch zubereiteten G-Puffer-Arbeitslösung ab Schritt 2.2 hinzu. Pipetten Sie 20 Mal nach oben und unten, um sich gut mit dem auf 1 L eingestellten Pipettenvolumen zu mischen. Der G-ActinRed-Bestand wird nun bei der endgültigen Verdünnung von 5 mg/ml sein.
  3. Das vorbereitete G-ActinRot 30 min ungestört auf Eis inkubieren.
  4. Zentrifugieren Sie das präparierte G-ActinRot bei 16.000 x g für 20 min bei 4 °C in einer Mikrozentrifuge, um jeglichen Niederschlag zu entfernen.
  5. Sorgfältig Pipet 1,5 l des Überstandes in eine frische Snap Cap Mikrozentrifugenröhre auf Eis, vermeidung des dunkelrosa Pellets.
  6. Bewahren Sie den vorbereiteten G-ActinRed Überstand bis zu 6 h auf Eis auf, bis er in eine Mikronadel geladen werden kann.
    HINWEIS: Mikronadeln können vorab aus Kapillarrohren auf einem Mikropipette-Zieher gezogen und dann bei Raumtemperatur auf einem Streifen modellierenden Tons in einer 100 x 20 mm Petrischale gelagert werden. Vorgeschlagene Parameter für das Mikronadelziehen finden Sie im Pipette Cookbook29.

3. Sammeln Sie Embryonen und montieren Sie zur Injektion

  1. Lassen Sie Fliegen Embryonen für 30 min auf Apfelsaftplatten mit Hefepaste bei 18 °C legen.
  2. Während fliegen, eine Apfelsaft-Agarplatte ohne Hefepaste auf Raumtemperatur vorwärmen, einen 4 cm x 1 cm großen rechteckigen Keil aus Apfelsaft-Agar mit Rasierklinge ausschneiden und auf eine 25 mm x 75 mm Glasrutsche legen.
    1. Ernteplatte aus der 30-minütigen Sammlung und Dechorionate Embryonen durch Gießen von frischem Bleichmittel, verdünnt 1:1 mit destilliertem Wasser, auf die Platte und wirbeln die Platte für 1 min, wie in28 beschrieben (Abbildung 1, Schritt 2).
      HINWEIS: Verschiedene Bleichmarken werden in unterschiedlichen Konzentrationen verkauft. Die hier verwendete Bleiche ist 6% Natriumhypochlorit aus der Flasche und wird auf eine Endkonzentration von 3% Natriumhypochlorit verdünnt. Andere Bleichmarken mit etwas niedrigeren Konzentrationen funktionieren genauso gut.
    2. Gießen Sie die bleich-und dechorionierten Embryonen in einen Sammelkorb (ein 70-m-Zellsieb) und spülen Sie die Platte zweimal mit destilliertem Wasser aus einer Spritzflasche ab und fügen diese Wäschen in den Sammelkorb.
    3. Die dechorionierten Embryonen im Sammelkorb kräftig mit destilliertem Wasser abspülen, bis keine Hefeklumpen sichtbar sind und der Korb keine rosa Flecken von überschüssiger Bleichmittel hinterlässt, wenn er auf einem Papiertuch gefleckt wird.
  3. Mit einem Pinsel mit mit destilliertem Wasser gedämpften Borsten dechorionierte und gewaschene Embryonen aus dem Sammelkorb auf den vorbereiteten Apfelsaft-Agarkeil auf der Glasrutsche übertragen.
  4. Verwenden Sie ein Paar Feinspitzen-Pinzette oder eine Sezierender Nadel, um zehn Embryonen in einer geraden Linie entlang der langen Achse des rechteckigen Agarkeils anzuordnen (Abbildung 1,Schritt 3). Ordnen Sie die Embryonen kopf-an-Schwanz, so dass ihre vordere Pol nach rechts und dorsale Seite ist mit Blick auf den Forscher (Abbildung 1,Schritt 3, vergrößert).
  5. 0,5 cm vom Ende einer P200-Pipettespitze mit einer Rasierklinge abschneiden und in den "Embryokleber" (beschriebenin 28 )tauchen. Großzügig einen Bereich 5 mm breit(Abbildung 1, Schritt 4) entlang der langen Kante eines 24 mm x 50 mm rechteckigen Abdeckrutsches beschichten und trocknen lassen, Seite nach oben kleben. Die Trocknung dauert 30 s und ist abgeschlossen, sobald der gesamte klebstoffbeschichtete Bereich matt statt nass oder glänzend erscheint.
    HINWEIS: Bereiten Sie "Embryokleber" mindestens 48 h im Voraus vor. Fügen Sie n-Heptane zu Streifen von doppelseitigem Klebeband in einer Szintillationsdurchstechflasche hinzu, wie in28beschrieben.
  6. Sobald der "Embryokleber" getrocknet ist, legen Sie den Deckelkleber vorsichtig auf die Reihe der ausgerichteten Embryonen auf den Agar, so dass 2-3 mm Raum zwischen dem Rand des Deckels und der Reihe der Embryonen.
    HINWEIS: Das Festkleben der Embryonen am Rand des Deckslips kann dazu führen, dass die Embryonen im Laufe des Experiments zu stark austrocknen.
  7. Drehen Sie den Deckelüberschlag um, so dass die Embryonen nun nach oben gerichtet sind. Sie sollten in einer Linie entlang einer langen Kante des Deckslips stecken bleiben, und ihr ventraler Bereich mit Blick auf die nächste Kante des Deckslips (Abbildung 1,Schritt 4, vergrößert).
  8. Entimitieren Sie die Embryonen, indem Sie den Deckelrutsch mit Embryonen sanft auf 150 g frischem blauen Entsatikmittel legen, das in einem 16 oz Schraubdeckel glas gelagert wird. Schrauben Sie den Deckel fest und brüten Sie für 8-10 min(Abbildung 1, Schritt 5).
  9. Nach der Austrocknung, entfernen Sie den Deckelausrutsche aus dem Entsüchterglas und Klebeband jede kurze Seite des Coverslip zu einem Mikroskop-Dia, Embryo-Seite nach oben,mit zwei 4 cm2 Stück doppelseitigem Klebeband, so dass der Embryo-Abdeckungsslip auf die Injektionsstufe passt (Abbildung 1,Schritt 6).
  10. Fügen Sie 2-3 Tropfen Halocarbon 27 Öl mit einer Pasteur Pipette hinzu, um die ausgerichteten Embryonen zu bedecken und sie vor weiterer Austrocknung zu schützen (Abbildung 1,Schritt 6).

4. Injektion und Hitze stress enden Embryonen zur Förderung der Aktinstabbildung

HINWEIS: Alle Injektionen erfolgen in einem temperaturgeregelten Raum bei 18 °C.

  1. Bereiten Sie feuchte Inkubationskammern aus einer Glas-Petrischale von mindestens 100 mm x 20 mm Größe vor und säumen Sie die Kammer mit Verdrehungen von Labor-Gewebewischern, die mit destilliertem Wasser gedämpft sind (Abbildung 1,Schritt 8). Vorerwärmen Sie die Inkubationskammern bei 32 °C oder die gewünschte Inkubationstemperatur vor der Injektion von Embryonen.
  2. Öffnen Sie das Luftstromventil für den Mikroinjektor und schalten Sie den Mikroinjektor ein (Druckluft oder Hausluft mit einem Druck von mindestens 90 psi ist geeignet).
  3. Während Embryonen ausgetrocknet sind, laden Sie den zuvor vorbereiteten G-ActinRed Überstand mit einer Mikroladerspitze in die Mikronadel zurück. Stellen Sie die Pipette so ein, dass sie 1-1,5 l aufzieht.
    HINWEIS: Aufgrund der Viskosität des Aktins sind die Ladevolumina möglicherweise nicht genau, und es kann genug Actin übrig bleiben, um mindestens ein bis zwei weitere Mikronadeln zu laden. Bis zu 60 Embryonen können pro geladener Mikronadel injiziert werden, wenn die Mikronadel richtig kalibriert ist und im Laufe des Experiments nicht verstopft wird.
  4. Befestigen Sie die Mikronadel am Nadelhalter und ziehen Sie die Schraube fest. Schließen Sie das Luftrohr an den Mikroinjektor an und stellen Sie sicher, dass der Rückflussdruck auf der Mikronadel auf 30 hPa ausgeglichen wird.
  5. Kalibrieren Sie die Mikroinjektoreinstellungen, um eine Blase mit einem Durchmesser von 100 m g-ActinRed (ca. 500 pL) auf einem Gleitmikrometer zu vertreiben. Drehen Sie den Druckknopf (500-1500 hPa) und den Injektionsimpuls-Zeitknopf (0,1-0,5 s) auf dem Mikroinjektor, um die richtige Blasengröße zu erhalten. Passen Sie diese Einstellungen jedes Mal an, wenn eine neue Mikronadel geladen wird, um die Variabilität der Aktinviskosität und der Mikronadelspitzengröße zu berücksichtigen.
    HINWEIS: Das präparierte G-ActinRed ist zähflüssig und es kann Luft in der Spitze der Mikronadel vorhanden sein, die vor der Injektion von Embryonen ausgestoßen werden sollte. Wenn das G-ActinRed nicht ohne weiteres von der Spitze der Mikronadel ausstößt, brechen Sie vorsichtig die Mikronadelspitze gegen die Kante des Schiebemikrometers.
  6. Legen Sie das Dia mit montierten Embryonen auf die Mikroskopstufe.
    HINWEIS: Jede Injektion wird anders sein, so dass die Forscher ihre Injektionsmethode entsprechend anpassen müssen. Hier werden die Embryonen in Bezug auf eine stationäre Mikronadel bewegt, wobei jeder Embryo durch Ausführen des Embryos in die Mikronadel injiziert wird.
  7. Passen Sie das Mikromanipulatorstadium und den Fokus des 10-fachen Objektivs auf das Lichtmikroskop so an, dass die Embryonen sichtbar sind. Die Embryonen befinden sich in der richtigen Fokalebene, wenn die Umrisse der Vitelline-Membran am schärfsten sind und der Embryo am größten erscheint. Wählen Sie Embryonen, die sich im richtigen Entwicklungsstadium befinden, so dass bis zum Zeitpunkt der Inkubation nach der Injektion der größte Teil der Kupplung das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht (z. B. Injektion von Embryonen im Stadium 2-330 von Bownes, um Die Stäbe bei der Zellulisierung nach Hitzespannung bei 32 °C zu beobachten).
  8. Verwenden Sie die Mikronadel-Kontrollen, um die Nadel in die gleiche Fokalebene wie die Embryonen zu bringen.
    HINWEIS: Wenn die Mikronadel beim Bewegen der Bühne oder Mikronadel auf dem Deckelverschluss gefangen wird, ist die Mikronadel zu nah am Schlitten und befindet sich nicht in der richtigen Brennebene. Die Mikronadel sollte parallel zum Deckelschlupf und nicht in einem signifikanten Winkel sein (Abbildung 1,Schritt 7).
  9. Setzen Sie die Mikronadel in den Embryo ein, so dass sie den Embryo in der Mitte seiner ventralen Region trifft, am Embryo "Äquator". Auslösen Sie die Injektion mit dem Fußpedal oder der "Injizieren"-Taste, wenn die Mikronadelspitze in der Mitte des Embryos sichtbar ist (Abbildung 1, Schritt 7).
  10. Das G-Actin Rot einmalinjizieren und langsam die Mikronadel entfernen. Bewegen Sie die Phase und wiederholen Sie für jeden Embryo der entsprechenden Entwicklungsstufe.
    HINWEIS: Die Ausdehnung des Embryos ist normal, da das G-Actin-Rot injiziert wird und ein bisschen Zytoplasma aus dem Embryo austreten kann.
  11. Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, legen Sie das Dia mit den Embryonen in die vorbereitete feuchte Inkubationskammer und schließen Sie den Deckel (Abbildung 1,Schritt 8). Wenn Sie versuchen, Embryonen zu erhalten, die eine Zellzellisierung erreichen, belasten Sie die Embryonen bei 32 °C für 60-75 min in der feuchten Inkubationskammer.
    HINWEIS: Inkubationszeiten werden angegeben, die die Visualisierung von Stäben in zellulisierenden wärmegestressten Embryonen ermöglichen. Die Inkubationszeit wird für Embryonen ohne Hitzestresskontrolle länger sein, da die Entwicklung bei einer niedrigeren Temperatur31langsamer sein wird. Diese Kontrollembryonen können in feuchten Kammern bei Temperaturen von 18 °C oder 25 °C inkubiert werden, je nach Design des spezifischen Experiments und der zu stellenden Frage. Die minimale Inkubationszeit, die erforderlich ist, damit das G-ActinRed im gesamten Embryo diffundiert, beträgt 30 min.

5. Bild-Aktin-Stäbe in wärmebelasteten Embryonen durch konfokale Mikroskopie

  1. Während die Embryonen wärmebelastet werden, schalten Sie das konfokale Mikroskop ein und wählen Sie den 561 nm Laserkanal.
  2. Bewegen Sie die Objektivlinse (25x, 40x oder 63x empfohlen) in die Arbeitsposition.
  3. Wenn die Bildaufnahme wärmebelastete Embryonen, dann stellen Sie den beheizten Stadium Inkubator, um eine Innentemperatur von 32 °C zu erreichen. Ein Point-and-Shoot- oder Infrarot-Thermometer kann verwendet werden, um die Temperatur am oder in der Nähe des Ziels zu überprüfen.
  4. Entfernen Sie das Dia mit injizierten Embryonen aus der feuchten Inkubationskammer, nachdem die Inkubation abgeschlossen ist (Abbildung 1,Schritt 9).
  5. Schnell arbeiten, hebeln Sie vorsichtig die doppelseitigen Klebebandstücke ab, mit denen der Deckelrutsch mit montierten Embryonen am Dia befestigt wurde (Abbildung 1,Schritt 9).
    VORSICHT: Seien Sie bei diesen Schritten sanft, da Abdeckungen leicht zerbrechen können, wenn zu viel Kraft angewendet wird.
  6. Halten Sie zwei 2,5 cm lange Stücke doppelseitigen Klebebandes zusammen und schneiden Sie das Band in der Länge halb, um zwei Streifen zu bilden, 2,5 x 0,5 cm lang(Abbildung 1, Schritt 10).
  7. Stecken Sie zwei Drittel der Länge jedes Bandstreifens auf den ersten Coverslip und flankieren Sie jede Seite der Embryonen in Halocarbon 27-Öl(Abbildung 1, Schritt 10, Orange),so dass ein Drittel der Bandstreifen am Rand des ersten Coverslips hängen bleibt, an dem die Embryonen stecken. Verwenden Sie die Hände und achten Sie darauf, die Embryonen während dieses Schritts nicht zu berühren.
  8. Legen Sie vorsichtig einen zweiten rechteckigen Deckelaufdruck auf die Bandstreifen, um die Embryonen zwischen die Decklippen zu sandwichen (Abbildung 1,Schritt 10, blau). Richten Sie die 25 mm Kanten aus, aber halten Sie die 50 mm Kanten um 1 cm in der Breite voneinander verankündigt.
    HINWEIS: Die volle Oberfläche dieses zweiten Coverslips wird zur neuen Bildfläche, die der Objektivlinse gegenübersteht, also achtet darauf, keine Fingerabdrücke oder Halocarbon 27 Öl auf dieser zweiten Deckgeradenoberfläche zu erhalten. Der Offset ist notwendig, damit zusätzliches Halocarbon 27 Öl hinzugefügt werden kann, um die Embryonen gleichmäßig einzutauchen. Fügen Sie bei Bedarf Halocarbon 27 Öl an der Naht hinzu, wo sich die beiden Abdeckungen an der Spitze des Sandwiches treffen, und es wird die Embryonen durch Kapillarwirkung beschichten (siehe gestrichelte Linien in Abbildung 1,Schritt 10).
  9. Tippen Sie vorsichtig auf die Bereiche des Coverslip, die sich direkt auf den Bandstreifen mit der stumpfen Seite einer Rasierklinge befinden, um den Coverslip auf das Band zu kleben.
  10. Drehen Sie das Coverslip-Sandwich um und legen Sie es auf einen Laborgewebewischer, um die bildgebende Oberfläche sauber zu halten und zum konfokalen Mikroskop zu tragen (Abbildung 1, Schritt 11). Stellen Sie sicher, dass das Band vor der Bildgebung vollständig an beiden Abdeckungen klebt.
  11. Vergewissern Sie sich, dass sich die beheizte Stufe auf Temperatur befindet, und fügen Sie bei Verwendung eines invertierten Mikroskops tauchflüssigkeit auf die ausgewählte Objektivlinse ein.
  12. Legen Sie das Coverslip-Sandwich vorsichtig auf die Bühne, um sicherzustellen, dass die neue Bildfläche(2. Coverslip) diejenige ist, die die Tauchflüssigkeit berührt (Abbildung 1,Schritt 11).
    HINWEIS: Bei Bedarf das Coverslip-Sandwich mit zwei kleinen Stücken doppelseitigem Klebeband auf die Bühne kleben, um unnötige Bewegungen während der Bildgebung zu vermeiden, wenn die Abdeckungen nicht gut in die beheizte Stufe passen.
  13. Konzentrieren Sie sich auf einen Embryo, der sich in der Zellzellisierung (Bownes Stadium 4a30) oder einem gewünschten Entwicklungsstadium mit übertragenem Licht oder Fluoreszenz befindet.
  14. Sobald ein Embryo in den Fokus gerückt ist, wechseln Sie in den Lasererfassungsmodus am konfokalen Mikroskop und passen Sie Laserleistung und Verstärkung, Rahmengröße, Fliesen und Projektionseinstellungen nach Belieben an.
  15. Nehmen Sie OberflächenansichtBilder durch die Fokalebenen der Kerne des Embryos, um intranukleare Aktinstäbe zu finden. Stäbe sollten in mehreren Ausrichtungen als helle Streifen oder Punkte innerhalb der vergleichsweise dunklen Kerne erscheinen (Abbildung 2A, 2C).

6. Alternative Bildgebungsexperimente

  1. Führen Sie FRAP durch, um den Aktinumsatz entlang der Länge der intranuklearen Aktinstäbe oder in zytoplasmatischen Aktinstrukturen, wie z. B. den Spitzen der Plasmamembranfurchen während der Zellulisierung, zu untersuchen.
  2. Wählen Sie in der Bildgebungssoftware einen rechteckigen Bereich um Furchenspitzen oder Aktinstäbe aus, in dem sie das Experiment erwerben können.
  3. Wählen Sie einen kleinen quadratischen Bereich der Mitte eines Aktinstabs innerhalb des rechteckigen Erfassungsbereichs zum Bleichen aus. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Aktinstange sichtbar sind und im Laufe des Experiments nicht gebleicht werden, um eine genaue Verfolgung der Stange im Kern zu ermöglichen.
  4. Stellen Sie den Bleichlaser auf 50x und stellen Sie die Bleichlaserleistung auf ein Maximum.
  5. Wählen Sie einen Zeitkurs, um Bilder jede Sekunde für insgesamt bis zu 120 s bei maximaler Pixelverweilgeschwindigkeit zu erfassen, und stellen Sie den Laser nach den ersten zwei Sekunden der Bildaufnahme auf Bleichen ein.
  6. Quantifizieren Sie die Daten, um die Halbzeit der Fluoreszenzwiederherstellung zu bestimmen1.

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Ergebnisse

In Abbildung 1ist ein schematischer Arbeitsablauf für die Handhabung von Embryonen dargestellt, und in Tabelle 1ist ein Zeitplan für ein typisches Experiment dargestellt. Eine Schätzung für ein gutes experimentelles Ergebnis ist, dass auf 10 injizierte Embryonen mindestens die Hälfte der betrachteten Embryonen im richtigen Entwicklungsstadium sein wird, unbeschädigt, und eine robuste ASR mit Hitzespannung bei 32 °C aufweisen. Diese ASR wird durch die Montage von intranuklea...

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Diskussion

Die Bedeutung dieser Methode ist, dass sie das etablierte Protokoll der Mikroinjektion in Drosophila-Embryonen 21,22,23,24,25,26,27 nutzt, um neue Forschungen in Bezug auf die ASR und die begleitende Aktinstabmontage zu ermöglichen. Ein großer Vorteil der Injektion von G-ActinR...

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Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte deklariert.

Danksagungen

Die Autoren würdigen die Arbeit von Liuliu Zheng und Zenghui Xue, die diese Technik im Sokac-Labor mitvorangetrieben haben, sowie Hasan Seede, der bei der Analyse mitgeholfen hat. Die Arbeit für diese Studie wird durch ein Stipendium des NIH (R01 GM115111) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Adenosintriphosphat (ATP)Millipore-SigmaA23835GBestandteil von G-Puffer
Apfelsaft, Mott's, 64 fl ozMott's014800000344Bestandteil von Apfelsaftplatten
Bacto AgarBD214010Bestandteil von Apfelsaftplatten
Bleach, PureBright Keimizid, 6,0% NatriumhypochloritKIK International059647210020Für die Dechorionierung von Embryonen
CalciumchloridMillipore-SigmaC1016500GBestandteil des G-Puffers
Zellsieb, 70 μ mFalcon352350Zur Entnahme dechorionierter Embryonen
Konfokales Mikroskop, LSM 880 34-Kanal mit AiryscanZeiss0000001994956Zur Abbildung von intranukleären Aktinstäbchen
TrockenmittelDrierit24001Zum Austrocknen von Embryonen
Präpariermikroskop, Stemi 508 Stereoskop mit 8:1 Zoom Zeiss4350649000000Zum Anordnen von Embryonen auf einem Agarkeil
Präpariernadel, 5 ZollFisher Scientific08965AZum Anordnen von Embryonen auf einem Agarkeil
Dithiothreitol (DTT)Fisher ScientificBP1725Bestandteil des G-Puffers
Doppelseitiges Klebeband, Scotch Permanent, 0,5 Zoll x 250 Zoll3M021200010323Zur Herstellung von Embryokleber
Käfig für die EmbryonenentnahmeGenessee Scientific59100Zur Unterbringung erwachsener Fliegen und zum Sammeln von Embryonen
Pinzette mit feiner Spitze, Dumont Pinzette, Typ 5Elektronenmikroskopie Sciences72701DZum Anordnen von Embryonen auf Agarkeilen
Glaskapillaren, Borosilcatglas, dünn 1 mm x 0,75 mmWorld Precision Instruments, Inc.TW1004Für Mikronadeln
Halogenkohlenwasserstofföl 27Millipore-SigmaH8773100MLFür die Hydratation von Embryonen
Beheizter TischinkubatorZeiss4118579020000, 4118609020000, 4118609010000Für die konfokale
Bildgebung Laborgewebewischer, KimWipesKimberly-Clark34155Laborgewebewischer
Lichtmikroskop, Invertoskop 40C Invertierter Phasenkontrast Mikroskop, generalüberholtZeissAuslaufmodellInjektionsmikroskop
Methyl-4-hydroxybenzoatMillipore-Sigma H36471KGBestandteil von Apfelsaftplatten
Microinjector, FemtoJet4xEppendorf5253000025Microinjector
Microloader Spitzen, epT.I.P.S. 20 μ LEppendorf5242956003Zum Laden von Mikronadeln
Mikromanipulator und Injektionstisch mit X,Y,Z-Zifferblättern zur NadeleinstellungBernard Instruments, Inc (Houston, TX)CustomZur Durchführung von Mikroinjektionen
Mikropipettenabzieher, Modell P-97, Flaming/BrownSutter InstrumentsP97Zum Ziehen von Kapillarröhrchen zur Herstellung von Mikronadeln
Mikroskop-Deckglas 24x50-1,5Fisher Scientific12544EZum Einbetten von Embryonen
Objektträger, Lilac Colorfrost, vorgereinigt, 25 x 75 x 1mmFisher Scientific22037081Zum Einbetten von Embryonen zur Injektion
n-HeptanFisher ScientificH3601Bestandteil des Embryoklebers
Objektiv, 10xZeissAbgekündigt10x Objektiv für Injektionsmikroskop
Objektiv, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCSZeiss421767997171140x Wasserobjektiv für konfokales
Objektiv, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 für Öl-, Wasser-, Silikonöl- oder Glycerin-Immersion (D=0-0,17mm) (WD=0,57mm bei D=0,17mm)Zeiss420852987100025x gemischtes Immersionsobjektiv für konfokales
Objektiv, Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Öl DIC f/ELYRAZeiss420782990079963x Ölobjektiv für konfokal
Pinsel, Robert Simmons Expression E85 Spitz Rund Größe 2Daler-Rowney038372016954Für den Embryotransfer
Papierhandtücher, Kleenex Papierhandtücher mit C-Faltung, weißKimberly-Clark 884266344845Zum Blottieren von Zellsieb
Pasteurpipette, 5 3/4 ZollFisher Scientific1367820AZum Abdecken von Embryonen mit Öl
Petrischale, Glas, 100 x 20 mmCorning3160102Für feuchte Brutkammer
Petrischale, Kunststoff, 60 x 15 mmVWR25384092Für Apfelsaftplatten
Pipette, Eppendorf Referenz 0,5-10 μ LEppendorf2231000604Zum Laden der Mikronadel-Pipettenspitze
, xTIP4 250 μ LBiotix63300006Zum Hinzufügen von Embryokleber zum Deckglas
RasierklingeVWR55411050Zum Schneiden von Agarkeilen, Klebeband, Pipettenspitzen
Rhodamin-konjugiertes globuläres Aktin, menschliches Blutplättchen (nicht Muskeln; 4x10 μ g)Cytoskeleton, Inc.APHR-AG-Aktin^Rotes
Szintillationsfläschchen, 20 mL Borosillat aus Glas mit Polyethylen-Liner und HarnstoffkappenFisher Scientific033377Zur Herstellung von Embryokleber
Schraubglas, 16 ozNalgene000194414195Zum Austrocknen von Embryonen
TischmikrometerElektronenmikroskopie Sciences602104PGZur Kalibrierung des Volumens der G-Aktin-Injektion
SaccharoseMillipore-Sigma840971KGBestandteil von Apfelsaftplatten
Trizma baseMillipore-SigmaT15031KGBestandteil von G Puffer
Hefe, Lesaffre Yeast Corporation Hefe, Red Star Active Dry, 32 ozLesaffre Yeast Corporation117929157002Bestandteil von Hefepaste

Referenzen

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