Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin in Drosophila-Embryonen zu injizieren und die intranukleare Aktinstabsmontage nach Hitzestress abzubilden.

Zusammenfassung

Der Zweck dieses Protokolls ist es, intranukleare Aktinstäbe zu visualisieren, die sich in lebenden Drosophila melanogaster Embryonen nach Hitzestress zusammensetzen. Actin-Stäbe sind ein Kennzeichen einer konservierten, induktiven Actin Stress Response (ASR), die menschliche Pathologien begleitet, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Zuvor haben wir gezeigt, dass die ASR zu Morphogenese-Ausfällen und einer verminderten Lebensfähigkeit der sich entwickelnden Embryonen beiträgt. Dieses Protokoll ermöglicht die kontinuierliche Untersuchung der Mechanismen, die der Aktinstabbaugruppe und der ASR in einem Modellsystem zugrunde liegen, das sehr bildgebend, genetisch und biochemie geeignet ist. Embryonen werden gesammelt und auf einem Deckslip montiert, um sie für die Injektion vorzubereiten. Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin (G-Actin^Red) wird verdünnt und in eine Mikronadel geladen. Eine einzige Injektion erfolgt in das Zentrum jedes Embryos. Nach der Injektion werden Embryonen bei erhöhter Temperatur inkubiert und intranukleare Aktinstäbe werden dann durch konfokale Mikroskopie visualisiert. Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) Experimente können an den Aktinstäben durchgeführt werden; und andere aktinreiche Strukturen im Zytoplasma können ebenfalls abgebildet werden. Wir stellen fest, dass G-Actin^Red wie endogenes G-Actin polymerisiert und allein nicht die normale Embryoentwicklung beeinträchtigt. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass während der Injektion Vorsicht geboten ist, um eine schwere Verletzung des Embryos zu vermeiden. Jedoch, mit der Praxis, Injektion von G-Actin^Rot in Drosophila Embryonen ist eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit, Aktin-Stäbe zu visualisieren und kann leicht mit Fliegen jeder Art oder mit der Einführung von anderen zellulären Spannungen verwendet werden, einschließlich Hypoxie und oxidativen Stress.

Einleitung

Dieses Protokoll beschreibt, wie Man G-Actin^Red injizieren, um die Montage von intranuklearen Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu visualisieren, die sich einer induzierbaren Actin-Stressreaktion (ASR)¹unterziehen. Wir entwickelten dieses Protokoll, um Studien der ASR zu unterstützen, die bei Embryonen zu gestörter Morphogenese und verminderter Lebensfähigkeit führt, und bei erwachsenen menschlichen Zelltypen ist mit Pathologien wie Nierenversagen², Muskelmyopathien³und Alzheimer und Huntington^4,5,

Protokoll

1. Bereiten Sie Embryo-Sammelbecher und Apfelsaft-Agar-Platten vor

1. Fünf Tage vor dem Injektionsexperiment²⁸ konstruieren oder mindestens zwei kleine Embryo-Entnahmebecher beschaffen. Machen Sie frische 60 mm Apfelsaft Agar Teller mit kleinen Sammelbecherⁿ²⁸verwendet werden. Platten in Plastikboxen lagern, die mit feuchten Papiertüchern bei 4 °C bedeckt sind.
   HINWEIS: Kleine Embryo-Entnahmebecher, die mit Fliegenzahlen bestückt sind, wie in Schritt 1.3 beschrieben, bieten ausreichende Embryozahlen pro Experiment und sorgen gleichzeitig dafür, dass embryonale Handhabung und Injektion in kurzer Zeit durchgeführ....

Ergebnisse

In Abbildung 1ist ein schematischer Arbeitsablauf für die Handhabung von Embryonen dargestellt, und in Tabelle 1ist ein Zeitplan für ein typisches Experiment dargestellt. Eine Schätzung für ein gutes experimentelles Ergebnis ist, dass auf 10 injizierte Embryonen mindestens die Hälfte der betrachteten Embryonen im richtigen Entwicklungsstadium sein wird, unbeschädigt, und eine robuste ASR mit Hitzespannung bei 32 °C aufweisen. Diese ASR wird durch die Montage von intranuklea.......

Diskussion

Die Bedeutung dieser Methode ist, dass sie das etablierte Protokoll der Mikroinjektion in Drosophila-Embryonen ^{21,22,23,24,25,26,27} nutzt, um neue Forschungen in Bezug auf die ASR und die begleitende Aktinstabmontage zu ermöglichen. Ein großer Vorteil der Injektion von G-Actin^R.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Adenosintriphosphat (ATP)	Millipore-Sigma	A23835G	Bestandteil von G-Puffer
Apfelsaft, Mott's, 64 fl oz	Mott's	014800000344	Bestandteil von Apfelsaftplatten
Bacto Agar	BD	214010	Bestandteil von Apfelsaftplatten
Bleach, PureBright Keimizid, 6,0% Natriumhypochlorit	KIK International	059647210020	Für die Dechorionierung von Embryonen
Calciumchlorid	Millipore-Sigma	C1016500G	Bestandteil des G-Puffers
Zellsieb, 70 μ m	Falcon	352350	Zur Entnahme dechorionierter Embryonen
Konfokales Mikroskop, LSM 880 34-Kanal mit Airyscan	Zeiss	0000001994956	Zur Abbildung von intranukleären Aktinstäbchen
Trockenmittel	Drierit	24001	Zum Austrocknen von Embryonen
Präpariermikroskop, Stemi 508 Stereoskop mit 8:1 Zoom Zeiss		4350649000000	Zum Anordnen von Embryonen auf einem Agarkeil
Präpariernadel, 5 Zoll	Fisher Scientific	08965A	Zum Anordnen von Embryonen auf einem Agarkeil
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	BP1725	Bestandteil des G-Puffers
Doppelseitiges Klebeband, Scotch Permanent, 0,5 Zoll x 250 Zoll	3M	021200010323	Zur Herstellung von Embryokleber
Käfig für die Embryonenentnahme	Genessee Scientific	59100	Zur Unterbringung erwachsener Fliegen und zum Sammeln von Embryonen
Pinzette mit feiner Spitze, Dumont Pinzette, Typ 5	Elektronenmikroskopie Sciences	72701D	Zum Anordnen von Embryonen auf Agarkeilen
Glaskapillaren, Borosilcatglas, dünn 1 mm x 0,75 mm	World Precision Instruments, Inc.	TW1004	Für Mikronadeln
Halogenkohlenwasserstofföl 27	Millipore-Sigma	H8773100ML	Für die Hydratation von Embryonen
Beheizter Tischinkubator	Zeiss	4118579020000, 4118609020000, 4118609010000	Für die konfokale
Bildgebung Laborgewebewischer, KimWipes	Kimberly-Clark	34155	Laborgewebewischer
Lichtmikroskop, Invertoskop 40C Invertierter Phasenkontrast Mikroskop, generalüberholt	Zeiss	Auslaufmodell	Injektionsmikroskop
Methyl-4-hydroxybenzoat	Millipore-Sigma H36471KG		Bestandteil von Apfelsaftplatten
Microinjector, FemtoJet4x	Eppendorf	5253000025	Microinjector
Microloader Spitzen, epT.I.P.S. 20 μ L	Eppendorf	5242956003	Zum Laden von Mikronadeln
Mikromanipulator und Injektionstisch mit X,Y,Z-Zifferblättern zur Nadeleinstellung	Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)	Custom	Zur Durchführung von Mikroinjektionen
Mikropipettenabzieher, Modell P-97, Flaming/Brown	Sutter Instruments	P97	Zum Ziehen von Kapillarröhrchen zur Herstellung von Mikronadeln
Mikroskop-Deckglas 24x50-1,5	Fisher Scientific	12544E	Zum Einbetten von Embryonen
Objektträger, Lilac Colorfrost, vorgereinigt, 25 x 75 x 1mm	Fisher Scientific	22037081	Zum Einbetten von Embryonen zur Injektion
n-Heptan	Fisher Scientific	H3601	Bestandteil des Embryoklebers
Objektiv, 10x	Zeiss	Abgekündigt	10x Objektiv für Injektionsmikroskop
Objektiv, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS	Zeiss	4217679971711	40x Wasserobjektiv für konfokales
Objektiv, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 für Öl-, Wasser-, Silikonöl- oder Glycerin-Immersion (D=0-0,17mm) (WD=0,57mm bei D=0,17mm)	Zeiss	4208529871000	25x gemischtes Immersionsobjektiv für konfokales
Objektiv, Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Öl DIC f/ELYRA	Zeiss	4207829900799	63x Ölobjektiv für konfokal
Pinsel, Robert Simmons Expression E85 Spitz Rund Größe 2	Daler-Rowney	038372016954	Für den Embryotransfer
Papierhandtücher, Kleenex Papierhandtücher mit C-Faltung, weiß	Kimberly-Clark 884266344845		Zum Blottieren von Zellsieb
Pasteurpipette, 5 3/4 Zoll	Fisher Scientific	1367820A	Zum Abdecken von Embryonen mit Öl
Petrischale, Glas, 100 x 20 mm	Corning	3160102	Für feuchte Brutkammer
Petrischale, Kunststoff, 60 x 15 mm	VWR	25384092	Für Apfelsaftplatten
Pipette, Eppendorf Referenz 0,5-10 μ L	Eppendorf	2231000604	Zum Laden der Mikronadel-Pipettenspitze
, xTIP4 250 μ L	Biotix	63300006	Zum Hinzufügen von Embryokleber zum Deckglas
Rasierklinge	VWR	55411050	Zum Schneiden von Agarkeilen, Klebeband, Pipettenspitzen
Rhodamin-konjugiertes globuläres Aktin, menschliches Blutplättchen (nicht Muskeln; 4x10 μ g)	Cytoskeleton, Inc.	APHR-A	G-Aktin^Rotes
Szintillationsfläschchen, 20 mL Borosillat aus Glas mit Polyethylen-Liner und Harnstoffkappen	Fisher Scientific	033377	Zur Herstellung von Embryokleber
Schraubglas, 16 oz	Nalgene	000194414195	Zum Austrocknen von Embryonen
Tischmikrometer	Elektronenmikroskopie Sciences	602104PG	Zur Kalibrierung des Volumens der G-Aktin-Injektion
Saccharose	Millipore-Sigma	840971KG	Bestandteil von Apfelsaftplatten
Trizma base	Millipore-Sigma	T15031KG	Bestandteil von G Puffer
Hefe, Lesaffre Yeast Corporation Hefe, Red Star Active Dry, 32 oz	Lesaffre Yeast Corporation	117929157002	Bestandteil von Hefepaste