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Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

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DOI:

10.3791/61298

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16. Juli 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.

Zusammenfassung

Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellmembransystemen spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl biologischer Prozesse - von Zell-zu-Zell-Interaktionen bis hin zur Signaltransduktion; von der Erfassung von Umweltsignalen bis hin zur biologischen Reaktion; von der metabolischen Regulierung bis zur Entwicklungskontrolle. Genaue strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Membranproteinkomplexen und für die Entwicklung hochspezifischer Moleküle zur Modulation dieser Proteine. Für den Nachweis und die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden zahlreiche In-vivo- und In-vitro-Ansätze entwickelt. Unter ihnen ist der strukturbiologische Ansatz insofern einzigartig, als er direkte strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene liefern kann. Die derzeitige Membranproteinstrukturbiologie beschränkt sich jedoch noch weitgehend auf Waschmittel-basierte Methoden. Der Hauptnachteil von Waschmittel-basierten Methoden ist, dass sie oft Membranproteinkomplexe dissoziieren oder denaturieren, sobald ihre native Lipid-Doppelschichtumgebung durch Waschmittelmoleküle entfernt wird. Wir haben ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem für die Strukturbiologie von Membranproteinen entwickelt. Hier zeigen wir den Einsatz dieses Systems bei der Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Zellmembran mit einer Fallstudie des oligomeren Zustands von AcrB.

Einleitung

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) spielen in der gesamten Biologie eine zentrale Rolle, von der Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion von Proteinen bis hin zur Regulierung ganzer Systeme. PPIs gibt es in vielen verschiedenen Formen und können basierend auf den Arten von Interaktionen kategorisiert werden, die sie bilden. Eine solche Kategorisierung ist homooligomer oder heterooligomer, je nach, ob die Wechselwirkungen zwischen identischen Untereinheiten oder verschiedenen Proteinen, die als Untereinheiten wirken, bestehen. Eine weitere Kategorisierung basiert auf der Stärke der Wechselwirkung, wenn die Wechselwirkungen zur Bildung stabiler Komplexe oder transienter komplexer Zustände führen. Strukturelle Informationen über die PPI zwischen Proteinen sind entscheidend für das Verständnis des Mechanismus, mit dem Proteine ihre Funktion erfüllen. Es wurde geschätzt, dass über 80% der Proteine auf komplexe Bildung angewiesen sind, um ihre funktionellen Rollen durchzuführen1. Angesichts des Prozentsatzes der Proteine, die für eine ordnungsgemäße angeborene Funktion auf PPI angewiesen sind, ist ihre Bedeutung in der Biologie leicht erkennbar, aber die Fähigkeit, die Proteine, die an diesen Wechselwirkungen teilnehmen, richtig untersuchen zu können, ist aufgrund der Beschränkungen der Techniken, die zur experimentellen Beobachtung zur Verfügung stehen, um zu beobachten, wann Proteine PPI bilden, eine Herausforderung geblieben.

Es gibt ein hohes Maß an Uneinigkeit zwischen den Ergebnissen für viele experimentell ermittelte PPI aufgrund der hohen Menge an Rauschen, falsch positive und falsche Negative, die von vielen der derzeit verfügbaren PPI-Bestimmungstechniken abgeleitet werden. Dies gilt insbesondere für das Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H), die Tandem-Affinitätsreinigungs-Massenspektrometrie (TAP-MS) und die Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung (FRET), die drei der am häufigsten verwendeten Methoden zur PPI-Bestimmung2,3,4,5,6,7darstellen. Im Vergleich dazu können proteinstrukturbiologische Techniken wie Kernspinresonanz (NMR), Röntgenkristallographie und Elektronenmikroskopie (EM) verwendet werden, um hochauflösende Strukturinformationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen bis auf atomare Ebene zu gewinnen und eine direkte visuelle Bestätigung der Wechselwirkungen zu ermöglichen, die für ein Zielprotein von Interesse auftreten. Alle derzeit verfügbaren nicht-strukturbasierten PPI-bestimmenden Forschungstechniken (z. B. Y2H, TAP-MS und FRET) haben diese Fähigkeit und leiden zusätzlich unter Schwierigkeiten bei der Identifizierung schwacher und vorübergehender Wechselwirkungen zwischen Proteinen5. Diese Unzulänglichkeiten werden bei der Untersuchung von Membranproteinen aufgrund der zusätzlichen Komplexität, die durch die zusätzliche Variable der Lipidumgebung, die die Bildung einer richtigen quaternären Struktur und heteromeren komplexen Montage beeinflusst, noch verstärkt.

Membranproteine machen einen großen Teil des Proteoms aus und sind dafür bekannt, viele entscheidende Rollen bei der ordnungsgemäßen Zellfunktion in allen lebenden Organismen zu spielen. Trotz der Tatsache, dass Membranproteine schätzungsweise 27 % des menschlichen Genoms ausmachen und 60 % aller aktuellen Wirkstoffziele ausmachen, gibt es eine große Anomalie in der Anzahl der gelösten Modelle für Membranproteine, die nur 2,2 % aller veröffentlichten Proteinstrukturenausmachen 8,9,10. Die Hauptursache für die Diskrepanz bei der Verfügbarkeit von Strukturinformationen liegt in den intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen selbst. Aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit, der Abhängigkeit von Wechselwirkungen mit einer Lipidumgebung zur Aufrechterhaltung der einheimischen Struktur und Funktion und der verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Lipidmembran selbst stellen Membranproteine weiterhin ein wesentliches Problem bei der Implementierung strukturbiologischer Techniken zur Untersuchung dar. Von diesen intrinsischen Eigenschaften ist die wichtigste für die Beschaffung genauer struktureller Informationen die Anforderung, Wechselwirkungen mit ihrer natürlichen Lipidumgebung zu haben, damit sie ihre native Struktur und Funktion erhalten. Die Lipidumgebung ist ein so integraler Bestandteil der Struktur und Funktion von Membranproteinen, dass das Konzept von Memtein (eine Kombination der Wörter Membran und Protein) als grundlegende Einheit der Membran-Protein-Struktur und Funktion vorgeschlagen wurde11. Trotz der Bedeutung von Lipid-Protein-Wechselwirkungen erfordern die derzeit verfügbaren strukturbasierten PPI-Bestimmungstechniken oft, dass die untersuchten Proteine löslich sind oder mit Reinigungsmitteln löslich sind. Die Exposition gegenüber harten Waschmitteln kann die Proteine denaturiert oder falsche Positiv- und Negative aufgrund von Delipidation verursachen, die Aggregation, Denaturierung von Protein, Dissoziation nicht-kovalenter Wechselwirkungen und Bildung künstlicher oligomerer Zustände induzieren können. Aufgrund der Notwendigkeit, eine natürliche Lipidumgebung für die genaue Bestimmung des nativen oligomeren Zustands von Membranproteinen zu erhalten, haben wir ein Native Cell Membrane Nanoparticles System (NCMNs)12 auf Basis der zuvor berichteten Styrol Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 Methode entwickelt.

SMALP verwendet Styrol-Maleinsäure-Copolymer als membranaktives Polymer, um Membranproteine zu extrahieren und zu löslich. Poly (Styrene-Co-Maleic Acid) (SMA) ist ein einzigartiges amphiphiles Polymer aufgrund seiner hydrophoben Styrol-Moiety und diametral entgegengesetzten hydrophilen Maleinsäure-Moiety. Es bildet Nanopartikel, indem es in einem pH-abhängigen Mechanismus14adsorbiert, destabilisiert und die Zellmembran stört. Diese funktionelle Aktivität von SMA ermöglicht es, als waschmittelfreies System für membranproteinextraktion und Löslichkeit verwendet werden. Das NCMN-System unterscheidet sich in mehreren Aspekten vom SMALP-System. Das einzigartigste Merkmal des NCMN-Systems ist, dass es eine membranaktive Polymerbibliothek mit einer Vielzahl von Polymeren hat, die einzigartige Eigenschaften haben, die sie für die Isolierung vieler verschiedener Membranproteine geeignet machen, die unterschiedliche Bedingungen für Stabilität und native Funktion erfordern. Das NCMN-System hat auch andere Protokolle im Vergleich zur SMALP-Methode, wenn es um die Herstellung der Nanopartikel geht. Ein beispiel dafür ist, dass NCMNs eine einstufige Nickelaffinitätssäulenreinigung für die hochauflösende Strukturbestimmung verwenden. die Wirkung dieser verschiedenen Protokolle kann beim Vergleich des NCMNs-Protokolls, das 3,2 und 3,0 -C-Cryo-EM-AcrB-Strukturen erzeugte, mit einer ähnlichen Studie mit der SMALP-Methode beobachtet werden, die zu einer Kryo-EM-AcrB-Struktur mit einer Auflösung von 8,8 °12,15führte. Diese einzigartigen Merkmale des NCMN-Systems sind die Verbesserungen an der zuvor etablierten SMALP-Methode und machen es zu einem idealen Kandidaten für die Untersuchung von PPI.

Der Multidrug Efflux Transporter AcrB existiert als funktioneller Homotrimer in E. coli12. Eine mutagene Analyse ergab, dass eine einzelne P223G-Punktmutation, die sich auf einer Schleife befindet, die für die Stabilität des AcrB-Trimmers verantwortlich ist, den Trimmerzustand destabilisiert und bei der Herstellung mit dem Waschmittel DDM ein AcrB-Monomer ergibt, das mit nativer Blaugelelektrophorese16nachgewiesen werden konnte. Die FRET-Analyse des AcrB-P223G-Mutanten ergab jedoch, dass in der nativen Zellmembran-Lipid-Bilayer-Umgebung die Mehrheit der mutierten AcrB-P223G noch als Trimmer existierte und dass die Expressionswerte für den Wildtyp AcrB und AcrB-P223G ähnlich sind. Doch trotz der ERGEBNISSE der FRET-Analyse zeigte ein Aktivitätstest für den mutierten Transporter, dass die Aktivität im Vergleich zum Wildtyp16dramatisch zurückging. Obwohl die FRET-Technologie im Volksmund für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde, hat die Forschung gezeigt, dass sie häufig falsch positive Ergebnisse geben kann17,18,19,20.

Kürzlich wurden hochauflösende Kryo-EM-Strukturen des AcrB-Trimers bestimmt, die die Wechselwirkung von AcrB mit der zugehörigen nativen Zellmembran Lipid-Bilayer durch den Einsatz der NCMNs12zeigten. Grundsätzlich können die NCMNs problemlos für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der nativen Zellmembran verwendet werden. In einem Test dieses Systems wurden Experimente durchgeführt, um den oligomeren Zustand von AcrB-P223G mit nativen Zellmembran-Nanopartikeln und negativer Färbeelektronenmikroskopie direkt zu beobachten. Um mit den wilden AcrB-Nanopartikeln zu vergleichen, verwendeten wir das gleiche membranaktive Polymer (SMA2000 made in our laboratory, which is indexed as NCMNP1-1 in the NCMN library), das für die hochauflösende Kryo-EM-Strukturbestimmung von AcrB und alternativen Polymeren verwendet wird, die in der NCMNs-Bibliothek gefunden werden12. Basierend auf den zuvor berichteten Ergebnissen wurde erwartet, dass die Mehrheit der AcrB-P223G-Mutation in Form von trimernativen Zellmembran-Nanopartikeln21existieren würde. Es wurden jedoch keine AcrB-Trimmer in der Stichprobe gefunden, wie z. B. diejenigen, die mit dem wilden Typ AcrB beobachtet wurden. Dies deutet darauf hin, dass die Mehrheit der AcrB-P223G nicht Trimmer auf der nativen Zellmembran bildet, wie zuvor vorgeschlagen.

Hier berichten wir über eine detaillierte Analyse des mutierten E. coli AcrB-P223G im Vergleich mit dem Wildtyp E. coli AcrB mit den NCMNs. Diese Fallstudie von AcrB legt nahe, dass NCMNs ein gutes System für die Protein-Protein-Interaktionsanalyse ist.

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Protokoll

1. Proteinexpression

  1. Impfung von 15 ml Terrific Broth (TB) Medien mit plasmidspezifischen Antibiotika mit BL21(DE3) pLysS-Zellen, die die AcrB-Exzids in 50 ml-Röhrchen über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min exemitenken.
  2. Überprüfen Sie die optische Dichte der Nachtkultur bei 600 nm (OD600) und stellen Sie sicher, dass sie über 2,0 liegt.
  3. 5 ml Zellkultur in 1 L TB-Medien verdünnen, die plasmidspezifische Antibiotika enthalten, und bei 37 °C mit Schütteln bis OD600=0,8 inkubieren und dann mit IPTG induzieren, das eine Endkonzentration von 1 mM aufweist.
  4. Induktion bei 20 °C mit Schütteln für 20 h durchführen.
  5. Pellet die Zellen mit Zentrifugation für 15 min bei 4 °C und 4.000 x g.

2. Zelllyse und Membranisolierung

  1. Setzen Sie das Zellpellet in Puffer A(Tabelle 1, Verwenden Sie DDM-Puffer A oder NCMNs-Puffer A je nach dem zu folgenden Reinigungsschema) mit 80 ml für jeweils 20 g des Zellpellets aus.
  2. Homogenisieren Sie die resuspendierten Zellpellets mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 4 °C oder bei Raumtemperatur sofort danach auf Eis legen.
  3. Die Probe in ein Metallbecher glasen auf Eis geben und die Zellen durch Beladen in einen Hochdruckhomogenisator bei 4 °C und 1.500 bar lysieren.
    1. Wiederholen Sie den Vorgang des Ladens der Zellen in den Homogenisator und lassen Sie sie durch den Homogenisator für 3-4 Zyklen passieren oder bis das Lysat beginnt zu klären.
  4. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 15.000 x g für 30 min bei 4 °C.
  5. Den Überstand sammeln und bei 4 °C bei 215.000 x g bei 215.000 x g in Ultrazentrifugenrohre und Zentrifuge laden.
  6. Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie die Membranpellets aus den Ultrazentrifugenrohren. Überschüssiges Membranpellet bei -80 °C lagern.

3. Herstellung von nativen Zellmembran-Nanopartikeln

  1. 1 g Membranpellet in 10 ml NCMNs Puffer A (Tabelle 1) aufheben
  2. Homogenisieren Sie die resuspendierte Zellmembranprobe mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 20 °C.
  3. Übertragen Sie die suspendierte Membranprobe auf ein 50 ml Polypropylenrohr und fügen Sie membranaktive Polymere Lagerlösung und zusätzliche NCMNs Puffer A hinzu, um die Probe auf eine Endkonzentration von 2,5% (w/v) Membran-aktivem Polymer (NCMNP1-1 oder NCMNP5-2) zu bringen.
    HINWEIS: Lagerlösungen von membranaktiven Polymeren sollten in doppelt destilliertem Wasser hergestellt werden und können in unterschiedlichen Konzentrationen gehalten werden, in der Regel jedoch 10 % (w/v).
  4. Schütteln Sie die Probe für 2 h bei 20 °C.
  5. Die Probe in eine Ultrazentrifuge laden und bei 150.000 x g bei 1 h bei 20 °C drehen.
  6. Während die Probe ultrazentrifugiert wird, beginnen Sie, eine 5 ml Ni-NTA-Säule mit 25 ml NCMNs Puffer A auszubalancieren.
  7. Sammeln Sie den Überstand, nachdem die Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, und laden Sie ihn mit einer Spritzenpumpe auf 5 ml Ni-NTA-Säule bei Raumtemperatur mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min.
  8. Waschen Sie schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) Linien mit genügend NCMNs Puffer B (Tabelle 1), um das System vollständig zu spülen und dann die Säule mit der FPLC-Maschine zu verbinden.
  9. Waschen Sie die Säule mit 30 ml NCMNs Puffer B mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.
  10. Waschen Sie die Säule mit 30 ml NCMNs Puffer C (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.
  11. Das Protein mit 20 ml NCMNs Puffer D (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min und die Probe mit einem Fraktionskollektor und den jeweils auf 1,0 ml eingestellten Fraktionen zu sammeln.
  12. Bewahren Sie die Proteinproben bei 4 °C auf.
  13. Führen Sie einen SDS-PAGE-Gelelektrophorese-Assay durch, um die Proben zu überprüfen, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entsprechen.

4. SDS-PAGE Gelelektrophorese

  1. Bereiten Sie die Gießkammer vor, indem Sie das Glas an das Gießgerät spannen.
  2. Bereiten Sie das 12% Trenngel nach dem in Tabelle 1aufgeführten Rezept vor.
    HINWEIS: Sobald TEMED hinzugefügt wurde, wird das Gel schnell polymerisieren, so fügen Sie diese nur einmal bereit, das Gel zu gießen.
  3. Gießen Sie das Gel, so dass 2 cm unter der Unterseite des Kamms für das Stapelgel.
  4. Entfernen Sie alle Blasen, indem Sie die Oberseite des Gels mit 100% Isopropanol schichten und warten, bis das Trenngel polymerisiert ist.
  5. Entfernen Sie das Isopropanol und waschen Sie alle Spuren des Isopropanols mit destilliertem Wasser aus.
  6. Bereiten Sie das Stapelgel gemäß dem in Tabelle 1aufgeführten Rezept vor.
    HINWEIS: Sobald TEMED hinzugefügt wurde, wird das Gel schnell polymerisieren, so fügen Sie diese nur einmal bereit, das Gel zu gießen.
  7. Gießen Sie das Stapelgel auf das Trenngel.
  8. Fügen Sie einen Kamm in die Kammer, um die Brunnen zu bilden und warten, bis das Stapelgel vollständig polymerisiert.
  9. Legen Sie 1 L 1 M DTT in ein Mikrozentrifugenrohr für jede Bruchprobe, die auf dem Gel ausgeführt werden muss.
  10. Fügen Sie jedem Rohr auch 7 l 4x Ladepuffer hinzu.
  11. Fügen Sie jedem Mikrozentrifugenrohr 20 L Proben aus den Fraktionen hinzu, die auf dem Gel ausgeführt werden müssen.
  12. Wirbel die Rohre, die die Proben enthalten.
  13. Drehen Sie die Probenröhrchen mit einer Tisch-Mikrozentrifuge für 3 s nach unten und stellen Sie sicher, dass die gesamte Probe auf den Boden der Rohre zurückgekehrt ist.
  14. Bereiten Sie die Gelelektrophoresezelle vor, indem Sie eine 12% Polyacrylamid-Gelkassette einstecken und die inneren und äußeren Kammern der Zelle mit Tris-Acetat-EDTA (TAE) Buffer füllen (Tabelle 1).
  15. Laden Sie die Molekulargewichtsmarkierung mit dem entsprechenden Volumen, das in den Anweisungen vorgeschrieben ist, in die erste Spur des Gels ein.
  16. Laden Sie 28 l der Probe aus jedem Rohr gemischt mit DTT und Ladepuffer.
  17. Legen Sie den Deckel der Elektrophoresezelle auf die Box und stecken Sie den Deckel in das Netzteil.
  18. Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie es auf 100 V ein und lassen Sie es 20 min laufen.
  19. Nach 20 min erhöhen Sie den Netzstrom auf 140 V und führen Sie ihn weitere 30-40 min laufen oder bis das Band des Ladepufferfarbstoffs den Boden der Gelkassette erreicht.
  20. Nach Abschluss der Elektrophorese Fleck und Entfleckung des Gels, um die Proteinbänder im Gel enthalten zu visualisieren.

5. Proteinreinigung mit DDM

HINWEIS: Der Zweck dieser Reinigung ist es, als Kontrolle für die Experimente unter Verwendung der membranaktiven Polymere zu dienen.

  1. 6-10 g Membranpellet ab Schritt 2.6 in DDM-Puffer A (Tabelle 1) mit 5 ml/g Membranpellet aufheben.
  2. Homogenisieren Sie die resuspendierte Probe mit einem Glas-Dounce-Homogenisator bei 4 °C oder wenn bei Raumtemperatur sofort danach auf Eis gelegt werden.
  3. Die Probe in ein 50 ml Polypropylenrohr übertragen und DDM und zusätzlichen DDM-Puffer A hinzufügen, um die Probe auf eine Endkonzentration von 2% DDM zu bringen.
  4. Schütteln Sie die Probe für 2 h bei 4 °C.
  5. Die Probe in Ultrazentrifugenrohre und Zentrifuge für 1 h bei 4 °C und 150.000 x gladen.
  6. Während die Probe ultrazentrifugiert wird, beginnen Sie mit der Vorbereitung der 5 ml Ni-NTA-Säule durch Waschen mit 25 ml DDM-Puffer A (Tabelle 1).
  7. Nach Abschluss der Ultrazentrifugation den Überstand sammeln und mit einer Spritzenpumpe bei 4 °C bei 4 °C auf die 5 ml Ni-NTA-Säule laden.
  8. Waschen Sie FPLC-Leitungen mit genügend DDM-Puffer B + 0,05% DDM (Tabelle 1), um das System vollständig zu spülen und dann die Säule an die FPLC-Maschine anzuhängen.
  9. Waschen Sie die Säule mit 30 ml DDM-Puffer B + 0,05% DDM mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.
  10. Waschen Sie die Säule mit 30 ml DDM-Puffer C + 0,05% DDM (Tabelle 1) mit einer Durchflussrate von 1 ml/min und sammeln Sie den Durchfluss durch.
  11. Das Protein mit 20 ml DDM-Puffer D + 0,05% DDM (Tabelle 1) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min zu versenken und den Durchfluss mit einem Bruchkollektor und den jeweils auf 1,0 ml eingestellten Fraktionen zu sammeln.
  12. Wählen Sie die Fraktionen, die den Elutionsspitzenfürst für die Pooling- und Konzentrationsspitze enthalten, mit einem Zentrifugalkonzentrator und Zentrifugieren bei 4.000 x g und 4 °C bis zu 500 l.
  13. Laden Sie die Probe mit einer 500-L-Schleife in die FPLC-Maschine und dann bei 4 °C in die 25 ml-Aussperrsäule. Elute mit 30 ml DDM Puffer E + 0,05% DDM (Tabelle 1) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min und sammeln als Brüche mit den Bruchgrößen auf 0,5 ml pro Bruch eingestellt.
  14. Nehmen Sie die Fraktionen und messen Sie die Proteinkonzentration mit 280 nm Absorption, um die UV-Vis-Kurve aus dem FPLC-Elutionsdiagramm zu bestätigen.
  15. Sammeln Sie 20 l aus jeder Stichprobenfraktion, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entspricht und mit dem Absorptionstest als genau bestätigt wurde.
  16. Den Rest dieser Probenfraktionen mit flüssigem Stickstoff oder Trockeneis in den gewünschten Aliquots einfrieren und Proteinproben bei -80 °C lagern.
  17. Führen Sie einen SDS-PAGE-Gelelektrophorese-Assay durch, wie zuvor beschrieben, um die Proben zu überprüfen, die den im FPLC-Elutionsdiagramm beobachteten Spitzen entsprechen.

6. Negative Fleckengittervorbereitung

  1. Platzieren Sie die Gitter, die für die Probenvorbereitung verwendet werden, auf einem in Filterpapier eingewickelten Glasschlitten mit nach oben gerichteter Carbonseite.
  2. Legen Sie den Glasschlitten mit den Elektronenmikroskopgittern in die Kammer eines Glüh-Entladers zwischen den beiden Elektroden und ersetzen Sie den Glasdeckel, um sicherzustellen, dass er zentriert und gut versiegelt ist.
  3. Führen Sie die Glühlöschmaschine aus und stellen Sie sicher, dass das vom Plasma erzeugte violette Licht sichtbar ist.
  4. Wenn die Maschine fertig läuft, warten Sie, bis die Kammer den atmosphärischen Druck erreicht hat, um den Glasdeckel zu entfernen, und kehren Sie dann den Schlitten mit den Gittern auf die Bank zurück, wo Proben auf sie geladen werden.
  5. Stellen Sie die Konzentration der gereinigten Proteinproben auf etwa 0,1 mg/ml ein, indem Sie die Probe entweder mit dem entsprechenden Puffer verdünnen oder sich mit einem Zentrifugalkonzentrator konzentrieren.
  6. 3,5 l Proteinprobe auf das 10 nm dicke Kohlenstoffgitter laden und 1 min warten.
  7. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Filterpapier von der Oberfläche des EM-Gitters.
  8. Waschen Sie die Gitteroberfläche 3x, indem Sie 3 L Wassertröpfchen mit dem Gitter aufnehmen und das Wasser mit Filterpapier zwischen den Tropfen entfernen.
  9. Waschen Sie die Gitteroberfläche 2x, indem Sie 3 L Tröpfchen frisches, gefiltertes 2% Uranacetat aufnehmen und die Waschlösungen auf dem Gitter mit Filterpapier zwischen den Entnahmen jedes Tröpfchens entfernen.
  10. Färben Sie das Gitter mit einem 3 L Tröpfchen frisch, gefiltert 2% Uranacetat für 1 min.
  11. Entfernen Sie die Uranacetatlösung auf der Oberfläche des EM-Gitters mit Filterpapier und trocknen Sie das Gitter mindestens 1 min.
  12. Speichern Sie das Raster feld in einem Rasterfeld für die spätere Verwendung.

7. EM-Bildgebung

  1. Laden Sie das vorbereitete Gitter an einer sicheren Werkbank in den Gitterhalter.
  2. Bereiten Sie das Mikroskop vor, indem Sie die Mikroskope in eine Polystyrol-Box legen und den Dewar 3/4 voller flüssigem Stickstoff füllen.
  3. Bestätigen Sie, dass die Gummiabdeckung des Mikroskopfensters es bedeckt, und laden Sie den Dewar dann auf das Mikroskop, indem Sie die Kupferdrähte in den Dewar legen, bis er auf die Plattform passt.
  4. Füllen Sie den Rest des Krieges mit flüssigem Stickstoff und legen Sie eine Kappe auf den Dewar, um ihn zu bedecken.
  5. Schalten Sie die Hochspannung ein, konditionieren Sie das Mikroskop und warten Sie, bis sich das Mikroskop erwärmt und einen sicheren Vakuumpegel für den Einsatz festlegt.
  6. Sobald das Mikroskop fertig ist, öffnen Sie das Säulenventil und bestätigen Sie, dass der Strahl vorhanden ist, indem Sie die Gummiabdeckung am Mikroskopfenster entfernen.
  7. Überprüfen Sie die Strahlstigmation, indem Sie sich in und aus ausbreiten, indem Sie die Intensität des Strahls anpassen. Wenn Astigmatismus vorhanden ist, wird der Strahl eine elliptische Form haben, wenn man sich vom Cross-over entfernt und der Strahl sollte auf beiden Seiten die gleiche ovale Form haben.
  8. Passen Sie das Mikroskop-Fernglas so an, dass es die richtige Höhe und den richtigen Abstand gemäß den Augen des Beobachters hat.
  9. Überprüfen Sie die Strahlpositionierung für Such-, Fokus-und Belichtungsmodi, indem Sie durch alle drei Modi radeln, bis der Strahl in jedem Modus zentriert ist.
  10. Schließen Sie das Säulenventil, und laden Sie den Gitterhalter in das Elektronenmikroskop.
  11. Stellen Sie das Mikroskop auf die euzentrische Höhe ein, indem Sie die Wackelfunktion der Mikroskope verwenden und die Bewegung der Bühne mithilfe der Z-Achse anpassen, bis sich keine Seitenbewegung der Probe in der Mitte befindet.
  12. Mit dem niedrig dosierten Suchmodus am Mikroskop suchen Sie das Raster nach einem wünschenswerten Bereich von vernünftigem Kontrast zu den vorhandenen Probenmolekülen, um sich auf die Probe zu konzentrieren.
  13. Konzentrieren Sie sich im Fokusmodus auf die Stichprobe, indem Sie eine hohe Schrittgröße verwenden, bis die Stichprobe angezeigt wird, und verringern Sie dann die Schritte, um die richtige Fokusebene zu finden.
  14. Null und leeren Sie den Strahl und stellen Sie dann sicher, dass das Gummipad das Mikroskopfenster bedeckt.
  15. Nehmen Sie mit dem Belichtungsmodus das Bild der gewünschten Rasterfläche für eine Belichtungszeit von 1 s bei 62.000-facher Vergrößerung auf und überprüfen Sie das erhaltene Bild.
  16. Wenn die Bildgebung erfolgt ist, schließen Sie die Säulenventile und entfernen Sie den Gitterhalter aus der Säule.
  17. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, schalten alle von Interesse sind den Mikroskop ab, indem sie die Filamentleistung ausschalten und den Flüssigstickstoff-Dewar aus dem Mikroskop entfernen.
  18. Legen Sie etwas, um Feuchtigkeit auf dem Ständer zu absorbieren, wo der Dewar saß, um Kondensation von den Kupferspulen des Mikroskops zu fangen.
  19. Aktivieren Sie den Cryo-Zyklus-Modus und stellen Sie sicher, dass die Turbopumpe ausgeschaltet ist.

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Ergebnisse

Mit den hier vorgestellten Verfahren wurden Proben des Wildtyps E. coli AcrB und des E. coli-Mutanten AcrB-P223G gereinigt. Die Proben wurden dann auf kohlenstoffnegative Fleckenelektronenmikroskopiegitter adsorbiert und mit Uranylacetat mit der Side Blotting Methode22gebeizt. Negative Fleckenbilder wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie gesammelt. Das negative Fleckenbild für die mit DDM gereinigte AcrB-Wild-Musterprobe zeigt eine homogene Lösung monodisperser Partike...

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Diskussion

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für die Integrität der Struktur und Funktion von Membranproteinen. Viele Ansätze wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Im Vergleich zu löslichen Proteinen sind Membranproteine und ihre PPI aufgrund der einzigartigen intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen schwieriger zu untersuchen. Diese Schwierigkeit ergibt sich vor allem aus der Anforderung von Membranproteinen, die in eine native Lipid-Bilayer-Umgebung eingebettet werden müssen, u...

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Offenlegungen

Y.G ist als Erfinder des membranaktiven Polymers NCMNP5-2 und des NCMN Systems gelistet.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom VCU Startup Fund (zu Y.G.) und dem National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R01GM132329 (zu Y.G.) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Wir danken Montserrat Samso und Kevin McRoberts für ihre großzügige Unterstützung bei der Videoaufnahme.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemicals
30% Acrylamid/BIS SOL (37,5:1)Bio-Rad161-0158
4x Laemmli Probenpuffer (Ladepuffer)Bio-Rad1610747
Essigsäure GletscherThermoFisher ScientificA38S-212
Ammoniumpersulfat (APS)Bio-Rad161-0700
ChloramphenicolGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 Protein FleckenpulverBio-Rad161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> 99% rein) ProteasefreiGoldbioDTT10
GlycerinThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisher ScientificBP310-1
ImidazolAffymetrix17525 1 KG
IPTGGoldbioI2481C100
KanamycinGoldbioK-120-25
MagnesiumchloridhexahydratThermoFisher ScientificAA3622636
MethanolThermoFisher ScientificA412-4
N,N-Dimethylethylendiamin (EDTA)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2Noch nicht im Handel erhältlichauf Erhalt an den korrespondierenden Autor
stellen Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray ValleyAntrag auf Erhalt an den korrespondierenden Autor stellen
NatriumchloridThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Terrific Broth MediaAffymetrix75856 1 KG
Tris BaseBio-Rad161-0719
UranylacetatAmbinterAmb22348393
Ausrüstung
Avanti J-26S XPIBeckman CoulterB14538
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Kohlenstoff-Elektronenmikroskop-Gitter (10 nm)Elektronenmikroskopie SciencesCF300-Cu-TH
Con-Torque GewebehomogenisatorEberbachE7265
Corning LSE Mini-MikrozentrifugeThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Avestin-Fraktionssammler
F9-RGE Healthcare Life Sciences29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertikale ElektrophoresezelleBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 SpektralphotometerThermoFisher ScientificND-2000
Optima L-90K UltrazentrifugeBeckman CoulterPN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S-230
Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue GrinderWheaton358013
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad164-5050
Razel R99-E Spritzenpumpemit variabler DrehzahlRazel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Typ 70 Ti FestwinkelrotorBeckman Coulter
General Materials1,5
ml MikrozentrifugenröhrchenThermoFisher Scientific05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLCGE Healthcare Life Sciences29018225
BL21(DE3)pLysS ZellenThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 ml Konisches ZentrifugenröhrchenThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 ml SäuleGE Healthcare Life Sciences17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3
Antrag

Referenzen

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