Methodenartikel

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

DOI:

10.3791/61298

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16. Juli 2020

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1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird ein Protokoll zur Bestimmung des oligomeren Zustands von Membranproteinen vorgestellt, das ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem in Verbindung mit der Elektronenmikroskopie nutzt.

Zusammenfassung

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Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellmembransystemen spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl biologischer Prozesse - von Zell-zu-Zell-Interaktionen bis hin zur Signaltransduktion; von der Erfassung von Umweltsignalen bis hin zur biologischen Reaktion; von der metabolischen Regulierung bis zur Entwicklungskontrolle. Genaue strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Membranproteinkomplexen und für die Entwicklung hochspezifischer Moleküle zur Modulation dieser Proteine. Für den Nachweis und die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden zahlreiche In-vivo- und In-vitro-Ansätze entwickelt. Unter ihnen ist der strukturbiologische Ansatz insofern einzigartig, als er direkte strukturelle Informationen über Protein-Protein-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene liefern kann. Die derzeitige Membranproteinstrukturbiologie beschränkt sich jedoch noch weitgehend auf Waschmittel-basierte Methoden. Der Hauptnachteil von Waschmittel-basierten Methoden ist, dass sie oft Membranproteinkomplexe dissoziieren oder denaturieren, sobald ihre native Lipid-Doppelschichtumgebung durch Waschmittelmoleküle entfernt wird. Wir haben ein natives Zellmembran-Nanopartikelsystem für die Strukturbiologie von Membranproteinen entwickelt. Hier zeigen wir den Einsatz dieses Systems bei der Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Zellmembran mit einer Fallstudie des oligomeren Zustands von AcrB.

Einleitung

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Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) spielen in der gesamten Biologie eine zentrale Rolle, von der Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion von Proteinen bis hin zur Regulierung ganzer Systeme. PPIs gibt es in vielen verschiedenen Formen und können basierend auf den Arten von Interaktionen kategorisiert werden, die sie bilden. Eine solche Kategorisierung ist homooligomer oder heterooligomer, je nach, ob die Wechselwirkungen zwischen identischen Untereinheiten oder verschiedenen Proteinen, die als Untereinheiten wirken, bestehen. Eine weitere Kategorisierung basiert auf der Stärke der Wechselwirkung, wenn die Wechselwirkungen zur Bildung stabiler Komplexe oder tra....

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Protokoll

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1. Proteinexpression

  1. Impfung von 15 ml Terrific Broth (TB) Medien mit plasmidspezifischen Antibiotika mit BL21(DE3) pLysS-Zellen, die die AcrB-Exzids in 50 ml-Röhrchen über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min exemitenken.
  2. Überprüfen Sie die optische Dichte der Nachtkultur bei 600 nm (OD600) und stellen Sie sicher, dass sie über 2,0 liegt.
  3. 5 ml Zellkultur in 1 L TB-Medien verdünnen, die plasmidspezifische Antibiotika enthalten, und bei 37 °C mit Schütteln bis OD600=0,8 inkubieren und dann mit IPTG induzieren, das eine Endkonzentration von 1 mM aufweist.
  4. Induktion bei 20 °C mit Schütteln für 20 h durc....

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Ergebnisse

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Mit den hier vorgestellten Verfahren wurden Proben des Wildtyps E. coli AcrB und des E. coli-Mutanten AcrB-P223G gereinigt. Die Proben wurden dann auf kohlenstoffnegative Fleckenelektronenmikroskopiegitter adsorbiert und mit Uranylacetat mit der Side Blotting Methode22gebeizt. Negative Fleckenbilder wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie gesammelt. Das negative Fleckenbild für die mit DDM gereinigte AcrB-Wild-Musterprobe zeigt eine homogene Lösung monodisperser Partike.......

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Diskussion

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Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für die Integrität der Struktur und Funktion von Membranproteinen. Viele Ansätze wurden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Im Vergleich zu löslichen Proteinen sind Membranproteine und ihre PPI aufgrund der einzigartigen intrinsischen Eigenschaften von Membranproteinen schwieriger zu untersuchen. Diese Schwierigkeit ergibt sich vor allem aus der Anforderung von Membranproteinen, die in eine native Lipid-Bilayer-Umgebung eingebettet werden müssen, u.......

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Offenlegungen

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Y.G ist als Erfinder des membranaktiven Polymers NCMNP5-2 und des NCMN Systems gelistet.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde vom VCU Startup Fund (zu Y.G.) und dem National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R01GM132329 (zu Y.G.) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Wir danken Montserrat Samso und Kevin McRoberts für ihre großzügige Unterstützung bei der Videoaufnahme.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemicals
30% Acrylamid/BIS SOL (37,5:1)Bio-Rad161-0158
4x Laemmli Probenpuffer (Ladepuffer)Bio-Rad1610747
Essigsäure GletscherThermoFisher ScientificA38S-212
Ammoniumpersulfat (APS)Bio-Rad161-0700
ChloramphenicolGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 Protein FleckenpulverBio-Rad161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> 99% rein) ProteasefreiGoldbioDTT10
GlycerinThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisher ScientificBP310-1
ImidazolAffymetrix17525 1 KG
IPTGGoldbioI2481C100
KanamycinGoldbioK-120-25
MagnesiumchloridhexahydratThermoFisher ScientificAA3622636
MethanolThermoFisher ScientificA412-4
N,N-Dimethylethylendiamin (EDTA)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2Noch nicht im Handel erhältlichauf Erhalt an den korrespondierenden Autor
stellen Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray ValleyAntrag auf Erhalt an den korrespondierenden Autor stellen
NatriumchloridThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Terrific Broth MediaAffymetrix75856 1 KG
Tris BaseBio-Rad161-0719
UranylacetatAmbinterAmb22348393
Ausrüstung
Avanti J-26S XPIBeckman CoulterB14538
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Kohlenstoff-Elektronenmikroskop-Gitter (10 nm)Elektronenmikroskopie SciencesCF300-Cu-TH
Con-Torque GewebehomogenisatorEberbachE7265
Corning LSE Mini-MikrozentrifugeThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Avestin-Fraktionssammler
F9-RGE Healthcare Life Sciences29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertikale ElektrophoresezelleBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 SpektralphotometerThermoFisher ScientificND-2000
Optima L-90K UltrazentrifugeBeckman CoulterPN LL-IM-12AB
PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S-230
Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue GrinderWheaton358013
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad164-5050
Razel R99-E Spritzenpumpemit variabler DrehzahlRazel Scientific Instruments
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Typ 70 Ti FestwinkelrotorBeckman Coulter
General Materials1,5
ml MikrozentrifugenröhrchenThermoFisher Scientific05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLCGE Healthcare Life Sciences29018225
BL21(DE3)pLysS ZellenThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 ml Konisches ZentrifugenröhrchenThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 ml SäuleGE Healthcare Life Sciences17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3
Antrag

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).<....

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Schlagwörter

Native Cell Membrane NanoparticlesMembrane Protein InteractionsElectron Microscopy AnalysisOligomeric State DeterminationMembrane Active PolymerNickel NTA ChromatographyNegative Stain GridsSize Exclusion ChromatographySDS PAGE AnalysisCryo Electron Microscopy

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