Verdauung von Ganzmausaugen für multiparameterflow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagozyten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine Methode, um ganze Augen in eine einzelzellige Suspension zum Zweck der multiparametern Flow-Zytometrie-Analyse zu verdauen, um spezifische mononukleäre phagozytische Populationen zu identifizieren, einschließlich Monozyten, Mikroglia, Makrophagen und dendritischen Zellen.

Zusammenfassung

Das angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle in der okulären Pathophysiologie, einschließlich Uveitis, diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration. Angeborene Immunzellen, insbesondere mononukleäre Phagozyten, exprimieren überlappende Zelloberflächenmarker, was die Identifizierung dieser Populationen zu einer Herausforderung macht. Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die gleichzeitige, quantitative Analyse mehrerer Zelloberflächenmarker, um Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritische Zellen in Mausaugen zu unterscheiden. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation ganzer Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine einzellige Suspension und die Färbung der einzelzelligen Suspension für myeloische Zellmarker. Darüber hinaus erklären wir die richtigen Methoden zur Bestimmung von Spannungen mit Einzelfarbsteuerungen und zur Abgrenzung positiver Tore mit Fluoreszenz minus 1 Steuerung. Die Hauptbeschränkung der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist das Fehlen von Gewebearchitektur. Diese Einschränkung kann durch Multiparameter-Flow-Zytometrie einzelner Augenkompartimente oder kostenlose Immunfluoreszenzfärbung überwunden werden. Die Immunfluoreszenz wird jedoch durch den Mangel an quantitativer Analyse und die geringere Anzahl von Fluorophoren auf den meisten Mikroskopen begrenzt. Wir beschreiben den Einsatz multiparametrischer Durchflusszytometrie zur hochquantitativen Analyse mononuklearer Phagozyten in laserinduzierter choroidaler Neovaskularisation. Darüber hinaus kann die Multiparameter-Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Makrophagen-Teilmengen, Schicksalskartierung und Zellsortierung für transkriptomische oder proteomische Studien verwendet werden.

Einleitung

Das angeborene Immunsystem umfasst mehrere Zelltypen, die die Komplementaktivierung und Entzündung stimulieren. Angeborene Immunzellen umfassen natürliche Killerzellen (NK) Zellen, Mastzellen, Basophile, Eosinophile, Neutrophile, und mononukleäre Phagozyten. Mononukleare Phagozyten, die aus Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen bestehen, wurden in die Pathophysiologie mehrerer ophthalmologischer Erkrankungen wie Uveitis, diabetische Retinopathie und altersbedingte Makuladegeneration (AMD)¹verwickelt. In diesem Protokoll werden wir uns auf die Identifizierung mononuklearer Phagozyten mittels multiparameterr Flusszytometrieanalyse in einem Mausmodell der neovaskulären AMD²konzentrieren. Dieses Protokoll ist anpassungsfähig für Mausmodelle der diabetischen Retinopathie und/oder Uveitis, aber eine umfassendere Augensektion wird aufgrund der systemischen Natur dieser Krankheiten empfohlen.

Mononukleare Phagozyten exprimiert überlappende Zelloberflächenmarker. Langlebige Gewebe-Resident-Makrophagen und Mikroglia stammen aus dem aus dem Dottersack abgeleiteten Erythromyeloid-Vorläufer³, während das Recycling von Makrophagen und dendritischen Zellen sich vom Knochenmark-abgeleiteten makrophagenen dendritischen Zellvorläufer⁴unterscheidet. Zu den Mauszelloberflächenmarkern, die Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen gemeinsam sind, gehören CD45, CD11b⁵, F4/80⁶, Cx3cr1⁷und der intrazelluläre Marker Iba1⁸. Um diese Herausforderung zu meistern, definiert die transkriptomische Analyse von Makrophagen, Monozyten und dendritischen Zellen aus mehreren Geweben CD64 als makrophagenspezifischen Zelloberflächenmarker⁶. Makrophagen wurden in der Iris, Der Aderhaut, dem Ziliarkörper und dem Sehnerv in gesunden Augen beschrieben³. Alternativ ist die dendritische Zellidentifikation schwieriger; Die spezifischste Methode der dendritischen Zellidentifikation erfordert eine Schicksalskartierung mit der Zbtb46-GFP-Reportermaus⁹. Unabhängig von dieser Reporterzeile kann die Expression von CD11c und MHCII in Verbindung mit dem Fehlen von CD64 potenzielle dendritische Zellen^6,10identifizieren. Dendritische Zellen wurden in Hornhaut, Bindehaut, Iris und Aderhaut in normalen Augen¹¹identifiziert. Mikroglia sind spezialisierte Makrophagen in der Netzhaut, geschützt durch die Blut-Retina-Barriere, und abgeleitet von Dotter-Sac-Vorläuferzellen¹². Dadurch kann die retinale Mikroglia von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen durch ihre düsteren Konzentrationen von CD45-Expression¹³ und hohen Konzentrationen von Tmem119 unterschieden werden, die als Durchflusszytometrie-Antikörper¹⁴erhältlich sind. Bei der Aktivierung von Mikroglia kann CD45 jedoch¹⁵ und Tmem119 herunterreguliert sein³, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, und dies ist wahrscheinlich sowohl für AMD als auch für sein Mausmodell relevant. Schließlich können Monozyten in mindestens zwei Subtypen unterteilt werden, darunter klassische und nicht-klassische. Klassische Monozyten zeigen CCR2⁺Ly6C^highCX3CR1^Low Expression, und nicht-klassische Monozyten zeigen CCR2^-Ly6C^lowCX3CR1^High Marker⁵.

Aufgrund der Notwendigkeit der quantitativen Analyse der Markerexpression, d.h. hoher im Vergleich zu niedrigen/niedrigen Konzentrationen, ist die Multiparameter-Flow-Zytometrie die ideale Methode zur Diskriminierung zwischen Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritischen Zellen im Auge und anderen Geweben. Weitere Vorteile sind die Identifizierung von Subpopulationen, die Möglichkeit, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zur Sortierung von Zellpopulationen für transkriptomische oder proteomische Analysen zu verwenden, und Schicksalskartierung. Der Hauptnachteil der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist der Mangel an Gewebearchitektur. Dies kann durch die ophthalmologische Dissektion in die verschiedenen okulären Subkompartimente überwunden werden: Hornhaut, Bindehaut, Iris, Linse, Netzhaut und Aderhautsklera-Komplex. Darüber hinaus kann eine bestätigende Immunfluoreszenz-Bildgebung durchgeführt werden, ist jedoch durch die Anzahl der Marker und den Mangel an robuster Quantifizierung begrenzt.

Genomweite Assoziationsstudien haben mehrere Komplementgene mit AMD¹⁶verknüpft. Die Komplementaktivierung führt zur Anaphylatoxinproduktion, Zur Rekrutierung von Leukozyten und zu einer daraus resultierenden Entzündung. Bei Komplementrezeptor-Mangelmäusen reduziert die Laserverletzung die mononukleäre Phagozytenrekrutierung und den laserinduzierten choroidalen Neovaskularisationsbereich (CNV)¹⁷. In ähnlicher Weise zeigt die C-C-Motiv-Chemokin-Rezeptor-2 (CCR2)-Knockout-Maus, die einen Mangel an Monozytenrekrutierung im Gewebe hat, sowohl eine verringerte mononukleäre Phagozytenrekrutierung als auch den laserinduzierten CNV-Bereich¹⁸. Diese Daten verbinden Komplement und mononukleäre Phagozyten mit experimenteller CNV und möglicherweise neovaskulärer AMD. Zur Unterstützung dieser Assoziation werden Komplementrezeptoren bei Patienten mit neovaskulärer AMD^19,20. Diese Daten zeigen einen starken Zusammenhang zwischen AMD und mononukleären Phagozyten.

In diesem Manuskript verwenden wir das experimentelle laserinduzierte CNV-Modell, um die mononukleären Phagozytenpopulationen im Mausauge mittels Multiparameter-Flow-Zytometrie zu charakterisieren. Laserinduzierte CNV ist das Standard-Mausmodell der neovaskulären AMD, das die Wirksamkeit der aktuellen ersten linie neovaskulären AMD-Therapie²¹demonstrierte. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation von Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine Einzelzellsuspension, die Antikörperfärbung, die Bestimmung von Laserspannungen mit Einzelfarbsteuerungen und die Gating-Strategie mit Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen. Eine detaillierte Beschreibung des laserinduzierten CNV-Modells finden Sie in einer früheren Publikation²². Mit diesem Protokoll definieren wir Mikroglia, Monozyten, dendritische Zellen und Makrophagenpopulationen. Darüber hinaus werden wir MHCII und CD11c verwenden, um Makrophagen-Teilmengen innerhalb des laserinduzierten CNV-Modells weiter zu definieren.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. C57BL/6-Mäuse wurden in einer Barriereanlage am Center for Comparative Medicine der Northwestern University (Chicago, IL) untergebracht. Alle Tiere wurden in 12/12 h Licht/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.

1. Sammlung von Augengewebe

1. Opfern Sie 10-12-Wochen-alte C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit regulierter Verabreichung von Kohlendioxid, bis die Maus nicht mehr reagiert und nicht mehr einatmet. Führen Sie Zervixdislokation oder eine andere zugelassene sekundäre Methode durch, um Dieeuthanasie zu gewährleisten.
   HINWEIS: Transkardiale Perfusion kann durchgeführt werden, um zirkulierende Leukozyten zu entfernen, die sich nicht in den Augengeweben befinden. In diesem Experiment reduziert die systemische Perfusion nicht die Anzahl von Mikroglia, Monozyten, Makrophagen oder dendritischen Zellen, die in unbehandelten oder laserbehandelten ganzen Augen nachgewiesen werden. Daher befinden sich die meisten dieser Zelltypen im ophthalmologischen Gewebe und dieser Schritt ist optional.
2. Um die Augen zu enukleieren, drücken Sie in der Nähe der Augenhöhle nach unten, während Sie ein Paar gekrümmte Zangen sanft unter das Auge legen, während es aus der Steckdose herausragt. Pinch Zange unter dem Auge geschlossen, ohne das eigentliche Auge zu drücken. Augen aus der umgebenden Bindehaut lösen (siehe vorherige Veröffentlichung)²³.
3. Ziehen Sie das Auge seitlich, bis der Sehnerv die einzige verbleibende Verbindung ist, um das Auge zu lösen. Der Sehnerv trennt sich oft mit Spannung, aber manchmal ist eine kleine Schere notwendig, um den Sehnerv zu schneiden. Legen Sie das Auge in kalte 1x Hank es Buffered Saline Solution (HBSS) mit Kalzium und Magnesium in 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr.

2. Verdauung des Augengewebes

1. Bereiten Sie den Verdauungspuffer vor, der 0,1 mg/ml Verdauungsenzym und 0,2 mg/ml DNase in kalten HBSS enthält. Rekonstituieren Sie zunächst 5 mg Verdauungsenzym in 2 ml sterilem Wasser. Bereiten Sie eine anfängliche Verdünnung von 10 mg/ml DNase in HBSS vor. Pro 10 ml des Verdauungspuffers (ausreichend für 3 Tiere) 9,4 ml kalteHBSS mit 0,4 ml rekonstituiertem Verdauungsenzym und 0,2 ml verdünnter DNase I mischen.
   HINWEIS: Diese Konzentrationen wurden empirisch über mehrere Experimente bestimmt, um ein optimales Maß an Antikörperfärbung einzelner Zellen zu ermöglichen und gleichzeitig den Zelltod zu reduzieren. Collagenase D wurde als Alternative zum Verdauungsenzym mit reduzierter Zelllebensfähigkeit und verminderter CD45⁺ Zellen ausprobiert. Weitere Informationen zum iterativen Prozess zur Optimierung der Verdauung finden Sie in der Diskussion.
2. Entfernen Sie unter einem Sezierender Mikroskop bei 10-facher Gesamtvergrößerung die verbleibende Bindehaut und den Sehnerv mit feinen Zangen und Federscheren in kalten HBSS.
3. Bewegen Sie saubere Augen zu einer trockenen Sezschale oder einem kleinen Wägeboot. Injizieren Sie 0,15-0,20 ml/Auge des Verdauungspuffers über eine Spritze mit 30 G Nadel in die Glaskörperhöhle, nachdem zwei perforierende Wunden im Auge durch die Sehachse und 90° von dieser ersten Wunde entfernt für den Verdauungspufferausgang gemacht wurden.
4. Mit Federschere und feinen Zangen mit allen Teilen kleiner als 0,5 mm x 0,5 mm ganze Augen zerkleinern. Dissoziieren Sie Linsengewebe mit stumpfer mechanischer Störung über Zangen, um das Verstopfen von Pipettenspitzen in nachfolgenden Schritten zu verhindern. Für jede Probe, Spülen Zangen und Schere jeweils mit 0,75 ml Verdauungspuffer in kleine Schale. Verwenden Sie für jede Probe ein neues Gericht.
5. Übertragen Sie den Inhalt der Schale auf ein Dissoziationsrohr auf Eis mit P1000 Pipette, wobei darauf geachtet wird, dass kein Material in der Pipettenübertragung verloren geht. Spülen Sie die Schale mit zusätzlichen 1,5 ml Verdauungspuffer, wodurch das Gesamtvolumen in Dissoziationsrohr auf 3,25-3,50 ml.
6. Legen Sie das Dissoziationsrohr invertiert auf den elektronischen Dissoziator und laufen Sie den Zyklus "m_brain_03_01", bestehend aus 1 min unidirektionaler Drehung bei 200 U/min bei Raumtemperatur, was ein vorinstalliertes Programm ist. Stellen Sie sicher, dass sich das gesamte Gewebe an der Unterseite des Dissoziationsrohrs in Kontakt mit dem Verdauungspuffer und dem Rotor für diesen und alle verbleibenden Schritte befindet.
7. Legen Sie das Dissoziationsrohr in den Schüttelinkubator für 30 min bei 200 U/min bei 37 °C.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 ein weiteres Mal. Nach der zweiten 30 min Inkubation führen Sie eine letzte mechanische Verdauung mit elektronischem Dissoziator wie in Schritt 2.6 durch.
9. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 ml Kaltstrompuffer hinzufügen und Rohre auf Eis legen.

3. Vorbereitung der Zellsuspension

1. Um eine einzellige Suspension zu erzeugen, gießen Sie die angehaltene Augenverdauungsreaktion durch einen 40-m-Filter, der auf der Oberseite eines 50 ml konischen Zentrifugenrohrs platziert wird. Mit dem Kolben aus einer 2,5 ml Spritze schieben Sie alle verbleibenden Teile des unverdauten Augengewebes durch den Filter.
2. Waschen Sie das Dissoziationsrohr mit 10 ml Flow-Puffer und Spülfilter, bevor Sie den gleichen Kolben verwenden, um wieder unverdaute Augengewebeteile durch den Filter zu leiten.
3. Wiederholen Sie Schritt 3.2 mit 5 ml Flow-Puffer.
4. Waschen Sie das Dissoziationsrohr und den Filter mit einem endgültigen 10 ml Flow-Puffer.
   HINWEIS: Das Gesamtvolumen des Verdauungs- und Durchflusspuffers beträgt etwa 38-40 ml pro Probe.
5. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Dekant den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
6. Bereiten Sie 1x Lysing-Lösung vor, indem Sie sterilem Wasser eine 10-fache Lysing-Lösung hinzufügen. Brechen Sie das Pellet auf, indem Sie das Rohr gegen ein anderes Rohr streicheln. Um rote Blutkörperchen zu lysieren, fügen Sie 1 ml 1x Lysing-Lösung für 30 s mit Wirbeln bei Raumtemperatur (RT).
7. Stoppen Sie die Reaktion mit 20 ml Flow-Puffer.
8. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Dekant den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
9. Dissoziieren Sie das Pellet, indem Sie das Rohr gegen ein anderes Rohr streicheln. Fügen Sie 5 ml kalte 1x HBSS pro Tube hinzu.
10. Zentrifugenrohre bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirat Überstand.

4. Färbung der Zellsuspension für mononukleäre Phagozyten

1. Bereiten Sie 0,5 ml Lebend/Totfleck pro Probe vor, indem Sie Live/Dead Farbstoff 1:5.000 in kalten HBSS verdünnen.
2. Fügen Sie jeder Probe mit einer P1000 Pipette einen Live/Dead-Fleck hinzu, der sich erstellt, um das Pellet vollständig zu trennen. Proben in 1,2 ml Mikrotiterröhren übertragen.
3. Nehmen Sie einen kleinen Aliquot (10 L), um Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler zu zählen (siehe 4.4). Inkubieren Sie Proben mit Live/Dead-Färbung für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
4. Zählen Sie Zellen mit Trypan blue, um die Anzahl der lebenden Zellen pro Probe zu bestimmen.
   HINWEIS: In der Regel enthalten 2 Augen einer 10-12 Wochen alten C57BL/6J-Maus weniger als 2 x 10⁶ lebende Zellen.
5. Waschen Sie Proben, indem Sie 400 l kalten Durchflusspuffer hinzufügen. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
6. Resuspend Zellen vollständig in 500 l kalten Flow-Puffer. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
7. Blockieren Sie bis zu 5 x 10⁶ lebende Zellen in 50 l F_c Block (1:50 Verdünnung im kalten Durchflusspuffer der gereinigten Rattenanti-Maus-CD16/CD32). Wenn mehr als 5 x 10⁶ lebende Zellen, erhöhen Volumen angemessen.
8. Fügen Sie dem Pellet einen F_c-Block hinzu, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig getrennt wird. 20 min bei 4 °C inkubieren.
9. Fügen Sie 50 l Antikörper-Färbelösung (siehe Tabelle 1 zur Auswahl und Menge jedes Antikörpers, der in der Lösung enthalten ist) pro 5 x 10⁶ lebenden Zellen direkt zu den Zellen in F_c Block hinzufügen und vollständig mischen. 30 min bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Antikörpermengen sind abhängig von der Durchflusszytometerkonfiguration und sollten für jedes Labor und Instrument unabhängig getitriert werden. Siehe Tabelle 2 für die Instrumentenkonfiguration von Filtern und Spiegeln. Um Antikörper zu tittieren, beginnen Sie mit der Empfehlung des Herstellers und berechnen Sie den Färbeindex. Führen Sie einen Testlauf mit unterschiedlichen Antikörperkonzentrationen (sowohl oberhalb als auch unterhalb der Empfehlung des Herstellers) durch und wählen Sie die niedrigste Antikörperkonzentration, bei der der Färbeindex beibehalten wird. Stellen Sie außerdem sicher, dass die positive Färbung weniger hell ist als die einfarbige Steuerung. Verwenden Sie ungefärbte Zellen, um sicherzustellen, dass negativ gefärbte Zellen auf einer Skala sind und einen Spitzenwert von 1 x 10²haben. Verwenden Sie eine Fluoreszenz minus ein Steuerelement, um die positiv gefärbten Zellen zu definieren.
10. Waschen Sie Proben, indem Sie 700 l kalten Durchflusspuffer hinzufügen. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
11. Optional können die Proben nach der Antikörperfärbung mit 500 l Paraformaldehyd im Durchflusspuffer fixiert werden. Proben für 15 min bei Raumtemperatur fixieren. Führen Sie dann eine Wäsche durch, wie in 4.10 beschrieben. Feste Proben bei 4 °C lagern. Zählperlen sollten am Tag der Datenerfassung der Durchflusszytometrie hinzugefügt werden. Feste Proben sollten auf durchflusszytometer in 1-2 Tagen laufen.
    VORSICHT: Paraformaldehyd ist ein korrosives und gesundheitsgefährdendes Mittel.
12. Waschen Sie die Proben erneut mit 500 l kaltem Durchflusspuffer. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Die Hälfte des Überstandes aspirieren, ohne das Zellpellet zu stören.
13. Pellets aufsetzen und auf eine 96-Gut,U-Boden-Assayplatte übertragen. Zentrifugenplatte bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Um den Überstand zu dekantatigen, drehen Sie die Platte um und in einem starken Shake lösen Sie die Flüssigkeit in ein Waschbecken, ohne Pellet zu stören.
14. In einem neuen 1,2 ml Mikrotiterrohr 50 l gut wirbelnde Zählperlen platzieren.
15. Pellets in 96 Brunnenplatten in 200 l Kaltflusspuffer resuspendieren. Fügen Sie Zellmischung auf der Oberseite der Perlen aus dem vorherigen Schritt. Laufen Sie auf Durchflusszytometer in einem Gesamtvolumen von 250 L / Mikro-Titer-Rohr.

5. Erfassung von Flusszytometriedaten

1. Schalten Sie das Durchflusszytometer ein und bereiten Sie es vor. Hier aufgeführte Anweisungen sind für ein modifiziertes Vierlaserzytometer (Tabelle 2).
2. Führen Sie eine Testprobe aus, die einen kleinen Aliquot aus jeder Probe enthält, um sicherzustellen, dass alle Zellen für jeden Detektor skaliert werden. Passen Sie die Spannungen so an, dass alle Zellen skaliert sind.
3. Führen Sie Single Color Controls (SCC) für jedes Fluorophor aus, das in Derfärbecocktails verwendet wird (Tabelle 3). Legen Sie Mikrotiterrohr in ein größeres 5 ml Polystyrolrohr für die Platzierung auf der Durchflusszytometer-Stufe.
   HINWEIS: Wurzelfluorophore wie BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) und Alexa700 benötigen nicht den gleichen Antikörper wie der Cocktail (d. h. CD19 PE für CD64 PE). Tandem-Fluorophore wie PE-CF594, PE-Cy7 oder APC-Cy7 benötigen jedoch aufgrund einer möglichen Dissoziation der konjugierten Fluorophore denselben Antikörper für SCC wie Cocktail.
   1. Erstellen Sie den SCC für BV421, indem Sie 2 Tropfen Kompensationsperlen zu einem 1,2 ml Titerrohr zusammen mit 1 L Hamster-Anti-Maus-CD11c BV421 hinzufügen. Kompensationsperlen werden verwendet, da CD11c BV421 ein IgG-Lambda-Subtyp und nicht Kappa ist, wie in 5.3.3 beschrieben. 15 Min. bei 4 °C inkubieren. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.
   2. Erstellen Sie den SCC für den Live/Dead Farbstoff, indem Sie einen Tropfen positiver Färbeperlen (grüne Kappe) aus den amin-reaktiven Perlen hinzufügen, gefolgt von 1 L Live/Dead Farbstoff. 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Fügen Sie einen Tropfen der negativen Perlen (weiße Kappe) aus der Amin reaktive Perlen. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.
   3. Erstellen Sie die verbleibenden SCCs, indem Sie einen Tropfen positiver Färbeperlen (grüne Kappe) aus dem Anti-Ratten- und Antihamster-Ig-Kappa-Perlenset hinzufügen, gefolgt von der aufgeführten Antikörpermenge (Tabelle 3) in einem 1,2 ml Titerrohr. 15 min bei 4 °C inkubieren. Fügen Sie einen Tropfen der negativen Perlen (weiße Kappe) aus der Anti-Ratte und Anti-Hamster Ig kappa Perlen-Set. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.
   4. Wirbel alle Perlenmischungen vollständig. ScCs bei 4 °C für bis zu 3 Tage lagern.
      HINWEIS: Das SCC für fluoreszierende Reportermäuse sind ungefärbte Zellen.
   5. Legen Sie beim Ausführen von SCCs Spannungen so fest, dass die SCC-Probe einen Spitzenwert hat, der größer ist als jede Fluoreszenz für eine Zelle im selben Detektorkanal. Darüber hinaus sollten Spannungen so eingestellt werden, dass jeder SCC mindestens 0,5 Log-Differenz zwischen dem Histogramm-Peak im Kanal von Interesse im Vergleich zu jedem anderen Kanal hat (Abbildung 1).
4. Führen Sie Beispiele auf "Niedrig" aus, in dem Ereignisse/Sekunden unter 4000 bleiben. Wenn die Durchflussmenge nicht entsprechend gesenkt werden kann, verdünnen Sie Proben mit zusätzlichem Kaltflusspuffer. Zeichnen Sie das hinzugefügte Volumen auf, da dies für die Zählberechnung erforderlich ist (siehe repräsentative Ergebnisse).
5. Sammeln Sie mindestens 3 x 10⁶ Ereignisse pro Stichprobe. Dies kann höher sein als die Zellzahl aufgrund von Pigmentgranulat und Schmutz, der als Ereignisse auf Ihrem Zytometer zählt.
6. Zeichnen Sie eine Fluoreszenz Minus One (FMO) für jedes Fluorophor außer Live/Dead für eine korrekte Gating-Strategie in Abschnitt 6.4 auf. Ein FMO ist eine Probe, die mit allen Fluorophoren bis auf eine gefärbt wurde.
7. Durchflusszytometer gemäß Hersteller- oder Anlagenanweisungen reinigen und herunterfahren.

6. Anmerkung der Durchflusszytometriedaten

1. Öffnen Sie ein neues Arbeitsblatt mit Analysesoftware. Importieren Sie FCS-Dateien aus dem Zytometer für alle Proben und einfarbigen Steuerelemente.
2. Verwenden Sie SCCs, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen.
3. Wenden Sie die Kompensationsmatrix auf Ihre gebeizten Proben und FMOs an.
4. Verwenden Sie die FMOs, um positive Färbung zu bestimmen, um Tore zu ziehen.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigte unkompensierte Frequenzhistogramme für die SCCs und Zellen für den roten Laser: Alexa647, Alexa700 und APC-Cy7. In Abbildung 1Azeigte die Magentalinie den Peak des SCC für Alexa647, während die Cyanlinie den beabsichtigten Unterschied von 0,5 Log zeigte. Beachten Sie, dass der Gipfel in Alexa700 und APC-Cy7 links (weniger hell) der Cyan-Linie war. Beachten Sie auch, dass sich die Zellen alle links von der Magentalinie befanden. Zellen rechts v...

Diskussion

Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die quantitative Analyse mehrerer Zelltypen in einem komplexen Gewebe. In diesem Bericht beschreiben wir die zytometrische Durchflussdetektion mononuklearer Phagozytenpopulationen, einschließlich Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen-Untergruppen, nach Laserverletzungen im Mausauge. Liyanage et al vor kurzem berichtet eine ähnliche Gating-Strategie, um Neutrophile zu erkennen, Eosinophile, Lymphozyten, DCs, Makrophagen, infiltrierende Makrophagen, und Monozyten...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-408-120
1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Costar	3620
10 ml Pipetten	Fisher Scientific	431031
15 ml Konika	ThermoFisher	339650
1x HBSS, 500 ml	Gibco	14025-092
2,5 ml Spritze	Henke Sass Wolf	7886-1
20%ige Paraformaldehyd-Lösung	Elektronenmikroskopie Sciences	15713-S
25 ml Pipetten	Fisher Scientific	431032
30 G Nadel	Exel	26437
3ml Luer-Lock-Spritze	Fisher Scientific	14955457
41 x 41 x 8 mm Polystyrol-Waage	Fisher Scientific	08-732-112
50 ml Kegel	Falcon	352070
96-Well-Assay-Platte mit U-Boden ohne	Deckel Falcon	353910
Amin-reaktive Kügelchen	ThermoFisher	A10628
Analysesoftware	FlowJo	v 10
Anti-Ratten- und Anti-Hamster-Ig-Kappa-Perlen-Set	BD Biosciences	552845
C57BL/6J Mäuse	Jackson Laboratory	664
Zellzähler	Invitrogen	AMQAX1000
Zellzähler Objektträger	Invitrogen	C10283
Kompensationsperlen	ThermoFisher	01-1111-42
Kügelchen	zählen ThermoFisher	01-1234-42
Gebogene Pinzette	Fisher Scientific	16-100-123
Verdauungsenzym	Sigma Aldrich	5401020001
Präpariermikroskop	National Optical and Scientific Instruments, Inc.	DC3-420T
Dissoziationsröhrchen	Miltenyi Biotec	130-096-334
DNase	Roche	10104159001
Elektronischer Dissoziator	Miltenyi Biotec	130-095-937
FACS Diva software	BD Biosciences
Fc-Block, Ratten-Anti-Maus CD16/CD32	BD Biosciences	553142
Feine Pinzette	Integra Miltex	17035X
Fließpuffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Durchflusszytometer	BD Biosciences
Fließschläuche	Falcon	352008
Hamster Anti-Maus CD11c BV421	BD Biosciences	562782
Eiskübel	Fisher Scientific	07-210-123
Lebend-/Totfärbung	ThermoFisher	65-0866-14
Lysinglösung, 10x Lösung	BD Biosciences	555899
Mikrotiterröhrchen und Gestell	Fisher Scientific	02-681-380
Maus Anti-Maus CD64 PE	BioLegend	139304
Maus Anti-Maus NK1.1 PECF594	BD Biosciences	562864
P1000 Pipettenspitzen	Denville Scientific	P2404
P1000 Pipettierer	Gilson	FA10006M
P2 Pipettenspitzen	Eppendorf	22491806
P2 Pipettierer	Gilson	FA10001M
P20 Pipettierer	Gilson	FA10003M
P200 Pipettenspitzen	Denville Scientific	P2401
P200 Pipettierer	Gilson	FA10005M
Pipette	Mann Fisher Scientific	FB14955202
Ratte Anti-Maus B220 PECF594	BD Biosciences	562313
Ratte Anti-Maus CD11b APC-Cy7	BD Biosciences	557657
Ratte Anti-Maus CD19 AlexaFluor 700	BD Biosciences	557958
Ratte Anti-Maus CD19 PE	BD Biosciences	553786
Ratte Anti-Maus CD4 PECF594	BD Biosciences	562314
Ratte Anti-Maus CD45 FITC	ThermoFisher	11-0451-82
Ratte Anti-Maus CD45 PE-Cy7	BD Biosciences	552848
Ratte Anti-Maus CD8 PECF594	BD Biosciences	562315
Ratte Anti-Maus Ly6C	BD Biosciences
Ratte Anti-Maus Ly6G PECF594	BD Biosciences	562700
Ratte Anti-Maus MHC II AlexaFluor 700	BioLegend	107622
Ratte Anti-Maus Siglec F PECF594	BD Biosciences	562757
Ratte Anti-Maus Tim4 AlexaFluor647	BD Biosciences	564178
Schüttel-Inkubator	Labnet	311DS
Federschere	Fine Science Tools	15024-10
Steriles Zellsieb, 40 mm Nylonnetz	Fisher Scientific	22363547
Steriles Wasser, 500 ml	Gibco	A12873-01
Schwingschaufelzentrifuge	eppendorf	5910 R
Trypanblau, 0,4%ige Lösung	Gibco	15250061