Gewebespezifische RNAi-Werkzeuge zur Identifizierung von Komponenten für die systemische Stresssignalisierung

Zusammenfassung

Die Aufrechterhaltung der organismischen Proteostase erfordert die Koordination von Proteinqualitätskontrollreaktionen, wie z. B. der Chaperonexpression von einem Gewebe zum anderen. Hier stellen wir Werkzeuge zur Verfügung, die in C. elegans verwendet werden und die Überwachung der Proteostasekapazität in bestimmten Geweben und die Bestimmung interzellulärer Signalantworten ermöglichen.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren hat das Wissen über die Regulation von Proteinqualitätskontrollprozessen transformativ zugenommen und die Bedeutung interzellulärer Signalprozesse für die Regulation der zellnicht-autonomen Proteostase enthüllt. Neuere Studien beginnen nun, Signalkomponenten und Signalwege aufzudecken, die die Proteinqualitätskontrolle von einem Gewebe zum anderen koordinieren. Es ist daher wichtig, die Mechanismen und Komponenten des zellnicht-autonomen Proteostase-Netzwerks (PN) und seine Bedeutung für Alterung, Stressreaktionen und Proteinfehlfaltungskrankheiten zu identifizieren. Im Labor nutzen wir den genetischen Knockdown durch gewebespezifische RNAi in Kombination mit Stressreportern und gewebespezifischen Proteostase-Sensoren, um dies zu untersuchen. Wir beschreiben Methoden zur Untersuchung und Identifizierung von Komponenten der zellnicht-autonomen PN, die in Geweben, die einen Stresszustand wahrnehmen, und in reagierenden Zellen eine schützende Reaktion auslösen können. Wir beschreiben zunächst, wie man Haarnadel-RNAi-Konstrukte für den konstitutiven genetischen Knockdown in bestimmten Geweben generiert und wie man einen gewebespezifischen genetischen Knockdown durchführt, indem RNAi in verschiedenen Lebensstadien gefüttert wird. Stressreporter und Verhaltensassays fungieren als wertvolle Messwerte, die ein schnelles Screening von Genen und Zuständen ermöglichen, die systemische Stresssignalprozesse modifizieren. Schließlich werden Proteostase-Sensoren, die in verschiedenen Geweben exprimiert werden, verwendet, um Veränderungen in der gewebespezifischen Kapazität des PN in verschiedenen Entwicklungs- und Alterungsstadien zu bestimmen. Daher sollten diese Werkzeuge dazu beitragen, die Kapazität von PN in bestimmten Geweben zu klären und zu überwachen, während sie gleichzeitig dazu beitragen, Komponenten zu identifizieren, die in verschiedenen Geweben zur Vermittlung von zell-nicht-autonomer PN in einem Organismus beitragen.

Einleitung

Die zelluläre Proteostase wird durch ein komplexes Netzwerk von Komponenten der Proteinqualitätskontrolle überwacht, wie z. B. molekulare Chaperone, Stressreaktionen und Abbaumechanismen, einschließlich des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) und der Autophagie ^1,2. Die Aktivierung von Stressreaktionswegen, wie z.B. der HSF-1-vermittelten Hitzeschockreaktion (HSR), der entfalteten Proteinantwort des endoplasmatischen Retikulums (UPR^ER) und der Mitochondrien (UPR^mito), ist entscheidend für die zelluläre Anpassung an und das Überleben bei Umwelteinflüssen oder Proteinfehlfaltungskrankheiten, die zu einer toxischen Proteinaggregation führen 1,2,3,4,5^{, 6}. Urheberrecht

Die zelluläre Proteostase wird durch eine zusätzliche Schicht in mehrzelligen Organismen wie C. elegans koordiniert, die die Orchestrierung zellulärer Stressreaktionen über verschiedene Gewebe hinweg erfordert, um schützende Komponenten zur Proteinqualitätskontrolle wie molekulare Chaperone zu aktivieren⁷. In den letzten zehn Jahren wurde eine zelluläre nicht-autonome Aktivierung von "zellulären" Stressreaktionswegen für die Hitzeschockantwort (HSR), das UPR^ER und das UPR^Mito sowie für die transzelluläre Chaperon-Signalgebung (TCS) beobachtet3,4,7,8,9,10. In jedem Fall spielen das Nervensystem sowie die Signalübertragung aus dem Darm eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Aktivierung von Chaperonen im gesamten Gewebe, um vor den toxischen Folgen von akutem und chronischem Proteinfehlfaltungsstress zu schützen 3,5,9,11. Diese Übertragung von den Neuronen zum Darm und zu anderen Zellen in der Peripherie kann durch Neurotransmitter erreicht werden, wie es beim UPR^ER und dem HSR ^6,8,11 der Fall ist. Bei einer Form der zellnicht-autonomen Stresssignalisierung, TCS, die durch die erhöhte Expression von HSP-90 in den Neuronen aktiviert wird, spielen sekretierte Immunpeptide eine Rolle bei der Aktivierung der hsp-90-Chaperon-Expression von den Neuronen zum Muskel⁵. Bei einer anderen Form der TCS führt die Verringerung der Expression des wichtigsten molekularen Chaperons hsp-90 im Darm zu einer erhöhten Expression von hitzeinduzierbarem hsp-70 bei permissiver Temperatur im Körperwandmuskel ^5,10. In diesem speziellen Fall sind jedoch die spezifischen Signalmoleküle, die im stressempfindenden Darm und den reagierenden Muskelzellen aktiviert werden, unbekannt.

Um zu identifizieren, wie die Chaperon-Expression von einem Gewebe zum anderen aktiviert wird, ist daher ein Ansatz erforderlich, der es ermöglicht, die Kapazität des Proteostase-Netzwerks (PN) und die Aktivierung der Stressantwort auf gewebespezifischer Ebene zu überwachen. Um zu untersuchen, welcher Stressreaktionsweg in den einzelnen Geweben aktiviert ist, kann eine verfügbare Auswahl an transkriptionellen Chaperon-Reportern verwendet werden, die mit fluoreszierenden Protein-Tags fusioniert sind (siehe auch Tabelle 3). Dazu gehören fluoreszenzmarkierte hsp-90-, hsp-70- und hsp-16.2-Transkriptionsreporter, die die Induktion des HSR anzeigen, hsp-4, das die Aktivierung des UPR-ER anzeigt, und hsp-6, das das UPR-Mito anzeigt. Die Kombination dieser Reporter mit einer gewebespezifischen Stressbedingung ermöglicht dann eine aussagekräftige Auslesung, die einzelne Gewebe lokalisiert, die auf ein Ungleichgewicht der PN in einem distalen "Sender"-Gewebe reagieren, das den Stress wahrnimmt. Um einen Stresszustand oder ein Ungleichgewicht des PN in einem bestimmten Gewebe zu induzieren, können verschiedene Ansätze verfolgt werden. Zum Beispiel ist ein solcher Ansatz die ektopische Expression der aktivierten Form eines Stresstranskriptionsfaktors (z. B. xbp-1s) und ein anderer ist die Reduzierung der Expressionsniveaus eines essentiellen molekularen Chaperons (z. B. hsp-90) unter Verwendung gewebespezifischer Promotoren ^8,10. Um PN-Komponenten in nur einem Zelltyp zu depletieren, ist der gewebespezifische Knockdown durch RNAi ein nützliches Werkzeug.

In C. elegans ist RNAi jedoch systemisch; Doppelsträngige RNA in der Umwelt kann in das Tier eindringen und sich dort ausbreiten, um ein Zielgen zum Schweigen zu bringen^12,13. Diese systemische Ausbreitung von aufgenommener dsRNA wird durch SID-Proteine (systemische RNAi-defekte) vermittelt, wie z. B. SID-1- und SID-2-Proteine, die dsRNA-Transporter sind, sowie SID-5, das mit späten Endosomenproteinen kolokalisiert und am Export von aufgenommener dsRNA beteiligt ist 14,15,16. SID-1 ist ein Multipass-Transmembranprotein in allen Zellen außer Neuronen und wird sowohl für den dsRNA-Export als auch für den Import in Zellen^{benötigt 17}. Die SID-2-Expression ist auf den Darm beschränkt, wo sie als endozytärer Rezeptor für aufgenommene dsRNA aus dem Darmlumen in das Zytoplasma von Darmzellen fungiert¹⁶. Neuronen reagiert nicht auf systemische RNAi, was mit einer verminderten Expression des Transmembranproteins SID-1 in Neuronen korreliert, das für den Import von dsRNA unerlässlich ist^15,18. Damit gewebespezifische RNAi nur in einem Zelltyp wirksam ist, muss die systemische Ausbreitung von dsRNA verhindert werden. Dies kann durch die Verwendung der RNAi-resistenten sid-1(pk3321)-Mutante erreicht werden, die die Freisetzung und Aufnahme von dsRNA in Geweben verhindert¹⁵. Die Expression eines gewebespezifischen Haarnadel-RNAi-Konstrukts in dieser Mutante oder die ektopische Expression von SID-1 in einem spezifischen Gewebe kann dann die Funktion der mutierten SID-1 ergänzen und gewebespezifische RNAi¹⁹ ermöglichen.

Wie wird dsRNA also in einer sid-1-Funktionsverlust-Mutante vom Darm aufgenommen und wie kann sie dann Neuronen oder Muskelzellen erreichen, die ektopisch ein SID-1-Konstrukt exprimieren? In einem aktuellen Modell, das diesen Mechanismus erklärt, wird endozytierte dsRNA über SID-2 in das intestinale Zytoplasma aufgenommen und dann durch einen anderen SID-1-unabhängigen Mechanismus, an dem SID-5 und Transzytose^beteiligt sind, in das Pseudocoelom exportiert. Da SID-1 für den dsRNA-Import¹⁷ benötigt wird, können nur Zellen, die den Wildtyp SID-1 exprimieren, die aus dem Darm in das Pseudozölom freigesetzte dsRNA aufnehmen.

Hier demonstrieren wir die Verwendung einer Reihe von Werkzeugen, die gewebespezifische RNAi ermöglichen. Wir verwenden das Beispiel des molekularen Chaperons Hsp90, um die Konstruktion von Haarnadel-RNAi zu beschreiben, die nützlich sein kann, um die Genexpression in einem bestimmten Gewebe konstitutiv herunterzuschalten¹⁰. Der beschriebene Ansatz könnte für jedes Zielgen von Interesse verwendet werden. Die Reaktion anderer Gewebe auf das durch gewebespezifische hsp-90-RNAi verursachte Proteostase-Ungleichgewicht kann durch die Überwachung der Expression von fluoreszenzmarkierten Stressreportern in anderen Geweben untersucht werden. Als zweite Methode für gewebespezifische RNAi zeigen wir, wie das sid-1-Mutantensystem für die Fütterung von RNAi-exprimierenden Bakterien angepasst werden kann, anstatt ein Haarnadel-RNAi-Konstrukt zu exprimieren. Dies kann nützlich sein, wenn ein kandidaten- oder genomweites RNAi-Screening durchgeführt wird, um Komponenten zu identifizieren, die für eine gewebespezifische Reaktion erforderlich sind. Ebenso erfordern Entwicklungsdefekte, die mit der Erschöpfung einer lebenswichtigen PN-Komponente verbunden sind, in späteren Entwicklungsstadien einen RNAi-vermittelten Knockdown in bestimmten Geweben. Wir zeigen, wie ein SID-1-Komplementationssystem auf einem RNAi-Screening für gewebespezifische TCS-Modifikatoren verwendet werden kann. In dem Beispiel wollen wir Signalkomponenten identifizieren, die beim Knockdown im "stresswahrnehmenden" Sendergewebe (Darm) und im stressbeeinflussenden Gewebe (Muskel) zu einer veränderten Expression eines fluoreszenzmarkierten hsp-70-Reporters in Muskelzellen führen.

Protokoll

1. Gewebespezifische RNAi auf zwei Arten: Hairpin-RNAi und gewebespezifische SID-1-Komplementierung

1. Generierung von Hairpin-RNAi-Konstrukten für die gewebespezifische Expression in sid-1-Mutanten
   1. Amplifizieren Sie die Zielgensequenz (z. B. hsp-90-Sequenz , die aus dem hsp-90-RNAi-Klon aus der Ahringer-RNAi-Bibliothek²⁰ isoliert wurde) durch PCR. Platzieren Sie eine nicht-palindromische Sequenz am 3'-Ende der hsp-90-Sequenz , d. h. eine SfiI-Stelle (ATCTA)²¹.
      HINWEIS: Die Primer, die für das Klonen des hsp-90 mit der SfiI-Sequenz (unterstrichen) verwendet werden, sind:
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      as-hsp90 5' TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
   2. Subklonen Sie die amplifizierte Sequenz in den kommerziellen Klonierungskit-Vektor (z. B. TOPO pCR BluntII).
   3. Isolieren Sie die invertierte hsp-90-Sequenz aus dem hsp-90-RNAi-Klon (Ahringer-RNAi-Bibliothek)²⁰ durch Restriktionsverdau unter Verwendung von XbaI- und PstI-Restriktionsstellen und platzieren Sie sie stromabwärts der hsp-90-SfiI-Sequenz im Vektor (aus Schritt 1.1.1), was zu einem hsp-90-Hairpin-Konstrukt führt (Abbildung 1).
   4. Subklonen Sie das Haarnadelkonstrukt in einen Gateway-Eintrittsvektor pDONR221 und fusionieren Sie ihn mit Gateway-Eingangsklonen, die gewebespezifische Promotoren für beide Expressionen in Neuronen enthalten (rgef-1p); im Darm (VHA-6P); oder der Bodywall-Muskel (UNC-54P) und der UNC-54 3'UTR (oder eine andere 3'UTR nach Wahl) in einer Gateway-Reaktion, wie im Protokoll des Lieferanten beschrieben.
   5. Linearisieren Sie die resultierenden Hairpin-RNAi-Konstrukte (Abbildung 1) unter Verwendung einer einzigartigen Restriktionsstelle außerhalb der kodierenden Sequenz und mikroinjizieren Sie sie als komplexes Array mit einer Konzentration von 1 ng/μl Hairpin-RNAi-Konstrukt, gemischt mit 100 ng/μl N2 genomischer DNA aus Bristol (verdaut mit ScaI) zu einem C. elegans-Stamm, der den hsp-70p::RFP-Reporter (Stamm AM722) exprimiert, und kreuzen Sie ihn in den genetischen Hintergrund von sid-1 (PK3321) Mutanten (Stamm NL3321). Für ein Protokoll zur Durchführung der Mikroinjektion komplexer Arrays folgen Sie bitte²².
   6. Als Negativkontrolle verwenden Sie leere Vektor-Hairpin-Konstrukte, die die nicht-palindromische SfiI-enthaltende Sequenz (GGCCATCTAGGCC) unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors exprimieren.
   7. Verwenden Sie die erhöhte hsp-70p::RFP-Expression des Reporters als Messwert, um positive Transformanten zu bewerten, die hsp-90-Haarnadel-RNAi exprimieren (Abbildung 3). Für einen allgemeineren Ansatz zur Verifizierung des gewebespezifischen Knock-downs eines interessierenden Gens messen Sie die mRNA-Spiegel ganzer Tiere mittels qRT-PCR des interessierenden Gens.
   8. Das extrachromosomale Array des resultierenden Stammes, das das darmspezifische hsp-90-Haarnadelkonstrukt (PVH2; siehe Tabelle 1) exprimiert, wird durch Gammabestrahlung integriert. Zur Integration der extrachromosomalen Arrays in das Genom siehe²².
2. Gewebespezifische SID-1-Expression, um gewebespezifische RNAi durch Fütterung von dsRNA-exprimierenden Bakterien zu ermöglichen
   1. Subklonieren Sie die genomische sid-1-DNA vom Vektor TU867 (unc-119p::SID-1)¹⁹ in den Gateway-Eintrittsvektor pDONR221. Primer für die Klonierung von sid-1-DNA finden sich in¹⁹. Verschmelzen Sie das sid-1 pDONR221-Konstrukt mit Gateway-Entry-Klonen , die Muskel- (myo-3p) oder Darm- (vha-6p) spezifische Promotoren enthalten, und die unc-54 3'UTR (oder eine andere 3'UTR Ihrer Wahl) in der Gateway-Reaktion, wie zuvor in 1.1.4 beschrieben.
   2. Mikroinjizieren Sie die resultierenden vha-6p::SID-1::unc-54 3'UTR- oder myo-3p::SID-1::unc-54 3'UTR-Konstrukte in einer Konzentration von 30 ng/μL zusammen mit einem rot fluoreszierenden pharyngealen Co-Injektionsmarker (z. B. myo-2p::RFP; 5 ng/μL) in sid-1(pk3321)- Mutanten.
   3. Integrieren Sie die extrachromosomalen darm- oder muskelspezifischen sid-1-Arrays in das Genom, wie in²² beschrieben. Hier ergab sich die Stämme PVH5 [myo-3p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321) und PVH65 [vha-6p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(PK3321).
   4. Für die neuronenspezifische Expression von sid-1 in der sid-1(pk3321)- Mutante verwenden Sie den Stamm TU3401 uIs3401[unc-119p::SID-1; myo-2p::RFP]; sid-1(pk3321), das zuvor von Calixto et ^al.19 erzeugt wurde.
   5. Wie in 1.1.7 erwähnt, ist der gewebespezifische Knockdown des interessierenden Gens durch Messung der mRNA-Spiegel des gewünschten Zielgens mittels qRT-PCR sicherzustellen. Alternativ kann die gewebespezifische RNAi-Empfindlichkeit durch die Verwendung eines fluoreszierenden Proteins (z. B. GFP oder RFP) bestätigt werden, das im selben Gewebe exprimiert wird, und Würmer mit GFP oder RFP RNAi behandelt werden. Nematoden als synchronisierte Larven im L1-Stadium GFP/RFP-RNAi aussetzen und bis zum ersten Tag des Erwachsenenalters auf den RNAi-Bakterien wachsen (siehe Abbildung 2). In unserem Fall haben wir Stämme verwendet, die SID-1 in den Neuronen, im Muskel oder im Darm exprimieren, und in Stämme gekreuzt, die HSP-90::RFP in Neuronen (AM987), im Darm (AM986) und im Muskel (AM988) exprimieren.

2. Verwendung von Stressreportern und Proteostasesensoren zur Überwachung der zellautonomen und zellnicht-autonomen Proteostase

HINWEIS: Um die PN-Kapazität in bestimmten Geweben zu überwachen, verwenden Sie gewebespezifische Proteostase-Sensoren (z. B. Stämme, die Q44 im Darm oder Q35 im Muskel exprimieren – siehe Tabelle 3) und Stressreporter (wie den hitzeinduzierbaren hsp-70p::mCherry-Reporter ; Tabelle 3).

1. Genetische Kreuzung des mutierten Allels sid-1 (pk3321) in einen Proteostase-Sensorstamm und Bestätigung des Vorhandenseins von sid-1(pk3321) durch Fütterung mit RNAi
   1. Genetische Kreuzung des Proteostase-Sensor/Stressreporter-Stammes in den genetischen Hintergrund des sid-1 (pk3321)- Mutantenstammes. Um genetische Kreuzungen zwischen verschiedenen transgenen Stämmen zu etablieren, befolgen Sie bitte²³ für ein detailliertes Protokoll.
      HINWEIS: SID-1(PK3321)-Mutanten sind resistent gegen die Fütterung von RNAi, und daher führt die Behandlung von Embryonen mit RNAi gegen ein essentielles Gen (wie elt-2 oder hsp-90) nur zu Entwicklungsstillständen oder Larvenletalität bei Stämmen, die heterozygot oder Wildtyp für das sid-1-Gen sind.
   2. Lassen Sie 10 trächtige Hermaphroditen Eier auf RNAi-Platten gegen elt-2 oder hsp-90 legen und kontrollieren Sie (leerer Vektor; EV) RNAi-Platten bei 20 °C. Entfernen Sie die Mütter nach 1 - 2 h. Verwenden Sie N2 Bristol und die sid-1(pk3321)- Mutante als Kontrollen.
   3. Beobachten Sie die Entwicklung der Larven auf den RNAi-Platten in den nächsten 2-3 Tagen. elt-2 RNAi führt zu einem L1-Larvenarrest, während hsp-90-RNAi zu einem L3-Larvenarrest in N2 Bristol führt. sid-1-Mutanten werden von der RNAi-Behandlung nicht betroffen sein und sich zu trächtigen Erwachsenen entwickeln.
      HINWEIS: C. elegans, homozygot für sid-1 (pk3321), zeigt eine einheitliche Population, die sich bis ins Erwachsenenalter entwickelt. Heterozygot wird durch gemischte Populationen von einigen Tieren mit Larvenstillstand und einigen Tieren, die sich zu erwachsenen Tieren entwickeln, angezeigt.
2. Bestätigung des Vorhandenseins von sid-1(pk3321) durch Genotypisierung
   1. Entnehmen Sie 15-20 Würmer des ausgewählten F2-Kandidatenstamms in ein PCR-Röhrchen mit 15 μl Wurmlysepuffer (Tabelle 2).
   2. Stellen Sie das Röhrchen für mindestens 10 min oder über Nacht bei -80 °C auf.
   3. Inkubieren Sie das Röhrchen in der PCR-Maschine mit folgendem Programm:
   4. 65 °C für 60 min (Lysewurm); 95 °C für 15 min (Inaktivierung der Proteinase K); Bei 4 °C halten.
   5. Verwenden Sie 2 μl des Wurmlysats als "Vorlage", um die PCR-Reaktion für die Genotypisierung durchzuführen, wobei die folgenden Primer für sid-1 verwendet werden: sid-1 forw: 5'-agctgtacttgtattcg-3' und sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
   6. Verwenden Sie das folgende Programm für die PCR-Genotypisierung: 1 Zyklus bei 95 °C für 3 Minuten; dann 30 Zyklen von 95 °C für 10, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; 1 Zyklus bei 72 °C für 10 min, bei 4 °C halten.
   7. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit ~650 bp unter Verwendung eines PCR-Aufreinigungskits (Table of Materials) und sequenzieren Sie das sid-1 PCR-Produkt , um die G-zu-A-Punktmutation des sid-1 (pk3321)- Allels zu identifizieren. Alternativ erzeugt die G-zu-A-Punktmutation eine ApoI-Restriktionsstelle, die auf dem PCR-Produkt für die Genotypisierung, wie in²⁴ beschrieben, verwendet werden kann.
3. Verwendung von iQ44::YFP als Proteostase-Sensor für den Darm
   1. Synchronisieren Sie C. elegans, die Q44::YFP exprimieren, im Darm (Stamm OG412) oder gekreuzt in den sid-1(pk3321)-Mutantenhintergrund durch Bleichen, gemäß dem in²⁵ beschriebenen Protokoll. Plattensynchronisierte L1-Larven auf eine 9 cm große Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Agarplatte, die OP50-Bakterien enthält, und wachsen bis zum L4-Stadium bei 20 °C.
   2. Sammeln Sie L4-Tiere, indem Sie die Würmer mit 5 ml M9-Puffer von der Platte waschen. Den M9-Puffer mit L4-Würmern mit einer Glaspipette oder einer silikonisierten Kunststoffpipette in ein 15-ml-Röhrchen überführen und 1 Minute lang bei Raumtemperatur bei 1000 x g zentrifugieren, um die Würmer vorsichtig zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und achten Sie darauf, dass das Wurmkorn ungestört bleibt.
   3. Kritischer Schritt: Um Nematoden zu übertragen oder auszuplattieren, verwenden Sie eine Glaspipette oder eine Pipettenspitze aus Kunststoff, die gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Silikonisierungsmittel (z. B. SigmaCote) behandelt wurde. Dadurch wird das Anhaften von Würmern an der Kunststoffoberfläche einer Pipettenspitze verhindert.
   4. Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 noch dreimal, um alle OP50-Bakterien von den Würmern abzuwaschen.
   5. Nehmen Sie das Wurmpellet in 5 mL M9-Puffer auf und zählen Sie die Anzahl der vorhandenen Würmer in 10 μL.
   6. Platte L4 Tiere auf 6 cm NGM-Agar-Platten mit leeren Vektorkontroll- (EV) oder hsp-90-RNAi-Bakterien bei einer Dichte von 10 Würmern pro Platte (5 Platten pro Zeitpunkt und biologisches Replikat vorbereiten) und 24 -48 Stunden bei 20 °C inkubieren.
   7. Nach 24 Stunden (= Tag 1 Erwachsene) und 48 Stunden (= Tag 2 Erwachsene) wird die Anzahl der Q44-Herde im Darm von Nematoden gezählt, die Aggregate aufweisen. Insgesamt 30-50 Nematoden pro biologischem Replikat.

3. Gewebespezifisches Kandidaten-RNAi-Screening auf Modifikatoren der zellnichtautonomen Proteostase

HINWEIS: Für das gewebespezifische RNAi-Screening haben wir den Stamm PVH172 verwendet, der darmspezifische RNAi durch Fütterung von RNAi-Bakterien ermöglicht, und den Stamm PVH171, der muskelspezifische RNAi ermöglicht (siehe Tabelle 1 für den Genotyp).

1. Vorbereitung der RNAi-Platten
   1. Bereiten Sie 6 cm NGM-Agarplatten vor, die mit 100 μg/ml Ampicillin, 12,5 μg/ml Tetracyclin und 1 mM IPTG nach Standardmethoden^{ergänzt werden 25}.
   2. Verwenden Sie die Ahringer RNAi-Bibliothek, um die Kandidaten-RNAi-Klone für den RNAi-Screen²⁰ zu erhalten.
   3. Impfen Sie 3 mL LB-amp Medien (50 μg/mL Ampicillin in LB Medien) in ein 15 mL Röhrchen mit dem gewünschten RNAi-Klon unter Verwendung einer Pipettenspitze aus Kunststoff. Grow grow bei 37 °C über Nacht unter Rühren.
   4. Am nächsten Tag wird Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid (IPTG) (aus einem 1 M-Stamm) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM in der bakteriellen Übernachtkultur zugegeben.
   5. Rühren Sie die Kulturen für weitere 3 h bei 37 °C.
   6. Platte 300 μl bakterielle RNAi-Kultur auf eine 6 cm große NGM-Agarplatte, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin, 12,5 μg/ml Tetracyclin und 1 mM IPTG. Lassen Sie die Platten 2 Tage bei Raumtemperatur auf der Bank trocknen und zum Schutz vor Licht mit Alufolie abdecken. Nach dem Trocknen können die RNAi-Platten in einer Box bei 4 °C mehrere Wochen gelagert werden.
2. Synchronisation von C. elegans und Behandlung mit RNAi-Bakterien
   1. Um die Wurmstämme zu synchronisieren, nehmen Sie 15 trächtige adulte Tiere auf RNAi-Platten und lassen Sie sie 1 Stunde lang Eier legen. Dann die Erwachsenen vom Teller nehmen.
   2. Kritischer Schritt: Eine Synchronisation durch Bleaching wird in diesem Fall vermieden, da sie den hsp-70p::RFP-Reporter induzieren kann, da dies für C. elegans ein Stresszustand ist.
   3. Entnehmen Sie synchronisierte Larven im L4-Stadium und geben Sie sie auf eine frische RNAi-Platte.
   4. Lassen Sie Nematoden zwei Generationen lang auf der relevanten RNAi wachsen, um eine effiziente Aufnahme von dsRNA zu gewährleisten und sicherzustellen, dass die Temperatur bei 20 °C gehalten wird.
   5. Für die Bildgebung und hsp-70p::RFP-Fluoreszenzquantifizierung verwenden Sie Erwachsene am Tag 1.
3. Vorbereitung von Objektträgern
   1. Bereiten Sie die Objektträger vor, indem Sie ~250 μl einer 2%igen Agaroselösung (in M9-Puffer) auf einen Glasobjektträger geben und einen zweiten Objektträger darauf legen, um eine flache Scheibe zu erzeugen.
   2. Geben Sie 5 μl 5 mM Levamisollösung (in M9-Puffer) auf das Agarose-Set Pad und überführen Sie 5 adulte Würmer von Tag 1 in den Levamisol-Tropfen. Lassen Sie die Nematoden 5 Minuten lang lähmen.
   3. Sobald C. elegans gelähmt ist, richten Sie es vorsichtig mit einem Platindrahtpickel aus und entfernen Sie überschüssiges Levamisol mit einem Labortuch, bevor Sie ein Deckglas hinzufügen.
   4. Kritischer Schritt: Stellen Sie sicher, dass Sie innerhalb von 30 Minuten nach der Vorbereitung der Objektträger Bilder von den Würmern aufnehmen. Gelähmte Nematoden auf dem Objektträger können austrocknen und platzen, was die Fluoreszenzmessungen beeinträchtigen kann.
4. Mikroskopeinstellungen und Bildanalyse
   HINWEIS: Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen, das mit einer EM-CCD-Kamera und einer Mikroskopie-Bildautomatisierungs- und Bildanalysesoftware ausgestattet ist.
   1. Nehmen Sie Bilder mit 10-facher Vergrößerung mit einem 561-nm-Laser für die RFP-Fluoreszenzanregung auf. Stellen Sie sicher, dass alle Bilder mit den gleichen Einstellungen für Laserleistung, Lochblendengröße und Fluoreszenzverstärkung aufgenommen werden, um Vergleiche zu ermöglichen.
   2. Speichern Sie alle Bilder als TIFF-Dateien.
   3. Führen Sie eine Bildanalyse mit ImageJ durch. Messen Sie die Fluoreszenzintensität in jedem Bild in Pixeln pro Flächeneinheit, wobei die Hintergrundfluoreszenz abgezogen wird. Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität für jedes Bild auf den Bildbereich sowie auf die Länge der Würmer.
   4. Messen der mittleren Intensität mit Analysieren | Messen Sie in ImageJ. Normalisieren Sie den resultierenden Intensitätswert auf den Bildbereich, indem Sie die Intensität durch den Bereich dividieren.
   5. Um die Intensität auf die Wurmlänge zu normalisieren, messen Sie den Wurm, indem Sie eine Linie entlang der Länge des Wurms in ImageJ zeichnen und Analysieren | Messen. Der Grund für die Normalisierung der Fluoreszenzintensität auf die Wurmlänge ist, dass Würmer in Abhängigkeit von dem Gen, das von RNAi abgeschaltet wird, in ihrer Größe variieren können, und dies könnte die mittlere Intensität beeinflussen.
   6. Normalisieren Sie die gemessenen Fluoreszenzintensitäten auf unbehandelte Kontrollen (d. h. transgenes C. Elegane, die auf Kontroll-RNAi-Platten (EV) gezüchtet wurden). Fassen Sie die normierten Werte zusammen, um die mittleren Fluoreszenzintensitäten für jede RNAi-Bedingung zu vergleichen. Ziel ist es, 20 Würmer pro biologischem Replikat abzubilden und mindestens 3 biologische Replikationsbilder zu sammeln.
   7. Berechnen Sie die P-Werte der mittleren Fluoreszenzintensitätswerte mit dem Schüler-t-Test und führen Sie eine Korrektur für Mehrfachtests mit der Benjamini-Hochberg-Methode mit einer Falschentdeckungsrate von 0,05 durch.

Ergebnisse

Gewebespezifische RNAi auf zwei Arten: Expression von Haarnadelkonstrukten oder gewebespezifische SID-1-Komplementierung
Die Expression von gewebespezifischen Haarnadel-RNAi-Konstrukten ermöglicht den konstitutiven Knockdown eines Gens während der gesamten Entwicklung. Dies kann jedoch manchmal unpraktisch sein, wenn das untersuchte Gen für die Organogenese dieses bestimmten Gewebes benötigt wird, wie z. B. elt-2 , das für die Entwicklung des Darms benötigt wird²⁶. Die...

Diskussion

Die hier beschriebenen Verfahren demonstrieren den Einsatz von Werkzeugen, die den gewebespezifischen Knockdown von PN-Komponenten konstitutiv und zeitlich ermöglichen. Wir haben zuvor TCS identifiziert, einen zellnicht-autonomen Stressreaktionsmechanismus, der durch gewebespezifische Veränderung der Hsp90-Expressionsniveaus induziert wird¹⁰. Der gewebespezifische Knockdown von hsp-90 durch Expression von Haarnadel-RNAi führt zu einer zellnicht-autonomen ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ampicillin	Merck	A0166-5G	Protokoll Abschnitt 3.1.
DNA reinigen & Concentrator-500	Zymo Research	D4031	Protokoll Abschnitt 2.2.
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactosid	Merck	367-93-1	Protokoll Abschnitt 3.1.
Multisite-Gateway-Klon-Kit	Thermo Fisher	12537100	Protokoll, Abschnitt 1.2.
SigmaCote	Merck	SL2-25mL	Protokoll Abschnitt 2.3.
Tetracyclin	Merck	T7660-5G	Protokoll Abschnitt 3.1.
Zero Blunt TOPO PCR Klonierungskit	Thermo Fisher	K280002	Protokoll Abschnitt 1.1.