Charakterisierung von Immunzellen und proinflammatorischen Mediatoren im pulmonalen Milieu

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Durchflusszytometrie, um die Veränderungen der Immunzellzusammensetzung, des Zytokinprofils und des Chemokinprofils in der pulmonalen Umgebung nach einem vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss, einem murinen Modell des ischämischen Schlaganfalls, zu identifizieren.

Abstract

Die Expansion, Aktivierung und der Transport von Immunzellen in die Lunge, die durch die Expression mehrerer Zytokine und Chemokine gesteuert werden, können durch schwere Hirnverletzungen verändert werden. Dies wird durch die Tatsache belegt, dass Lungenentzündung eine der Haupttodesursachen bei Patienten ist, die einen ischämischen Schlaganfall erlitten haben. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Verwendung der mehrfarbigen Durchflusszytometrie zu beschreiben, um 13 Arten von Immunzellen in der Lunge von Mäusen zu identifizieren, einschließlich alveolärer Makrophagen, interstitieller Makrophagen, CD103+ oder CD11b + dendritische Zellen (DCs), plasmazytoide DCs, Eosinophile, Monozyten / Monozyten-abgeleitete Zellen, Neutrophile, lymphoide T- und B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, nach ischämischer Schlaganfallinduktion durch vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss. Darüber hinaus beschreiben wir die Herstellung von Lungenhomogenaten unter Verwendung einer Perlenhomogenisierungsmethode, um die Expressionsniveaus von 13 verschiedenen Zytokinen oder Chemokinen gleichzeitig durch Multiplex-Bead-Arrays gekoppelt mit durchflusszytometrischer Analyse zu bestimmen. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die pulmonale Immunantwort in anderen Krankheitssituationen wie infektiösen Lungenerkrankungen oder allergischen Erkrankungen zu untersuchen.

Introduction

Die Lunge ist ein Barriereorgan, das der äußeren Umgebung ausgesetzt ist und daher ständig immunologischen Herausforderungen wie Krankheitserregern und Allergenen ausgesetzt ist¹. Die Aktivierung lungenresidenter Immunzellen und die Infiltration von Immunzellen aus der Peripherie sind erforderlich, um Krankheitserreger aus der pulmonalen Umgebung zu entfernen. Darüber hinaus halten lungenresidente Immunzellen die Toleranz gegenüber kommensalen Bakterien aufrecht, was darauf hindeutet, dass diese Zellen eine Rolle bei der Pathogenentfernung und der Aufrechterhaltung der Homöostase spielen¹. Alveoläre und interstitielle Ma....

Protocol

Alle durchgeführten Protokolle und Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der West Virginia University genehmigt. Die Mäuse wurden unter spezifisch-pathogenfreien Bedingungen im Vivarium der West Virginia University untergebracht.

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Perfusionspuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS) vorbereiten. Verwenden Sie ungefähr zwei 10-ml-Aliquots eiskaltes PBS pro Maus.
2. Lungenzellenmedium/FACS-Puffer vorbereiten. FACS-Puffer enthält PBS, ergänzt mit 1% fetalem Rinderserum (FBS). Halten Sie das Medium für den gesamten Prozess der Lungenexzision und -übertragung ka....

Results

Wir berichteten kürzlich, dass die ischämische Schlaganfallinduktion bei Mäusen die Immunzellzusammensetzung der Lunge verändert¹¹. Insbesondere erhöhte die vorübergehende zerebrale Ischämie den Prozentsatz der alveolären Makrophagen, Neutrophilen und CD11b + DCs, während die Prozentsätze von CD4 + T-Zellen, CD8 + T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Eosinophilen im Lungenkompartiment abnahmen. Darüber hinaus entsprach die zelluläre Veränderung signifikant verminderten Konzentrationen multipler Chemo.......

Discussion

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Identifizierung von Lungenimmunzelltypen und die Expression von Chemokinen oder Zytokinen in derselben Maus. Wenn eine histopathologische Untersuchung gewünscht wird, kann ein einzelner Lappen zu diesem Zweck entfernt und fixiert werden, bevor mit den Einzelzellisolierungsschritten fortgefahren wird. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass dieser Ansatz in einigen Krankheitssituationen möglicherweise nicht geeignet ist, wenn die Veränderung der Immunzellzusa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B220-APC, Klon RA3-6B2	Biolegend	103212	1:200 Verdünnung
Beadbug 3-Positionen-Bead-Homogenisator	Benchmark Scientific	D1030	Gewebehomogenisator
CCR2-BV421, Klon SA203G11	Biolegend	150605	1:200 Verdünnung
CD103-BV421, Klon 2E7	Biolegend	121422	1:200 Verdünnung
CD11b-PE/Cy7, Klon M1/70	Biolegend	101216	1:400 Verdünnung
CD11c-PE/Cy7, Klon N418	Biolegend	117318	1:200 Verdünnung
CD11c-Percp/Cy5.5, Klon N418	Biolegend	117328	1:200 Verdünnung
CD4-BV421, Klon GK1.5	Biolegend	100443	1:200 Verdünnung
CD45-FITC, Klon 30-F11	Biolegend	103108	1:200 Verdünnung
CD64-APC, Klon X54-5/7.1	Biolegend	139306	1:200 Verdünnung
CD8-PE, Klon 53-6.7	Biolegend	100708	1:800 Verdünnung
Kollagenase D	Sigma Aldrich	11088882001	Komponente im Dissoziationspuffer
Konisches Schraubverschlussröhrchen	ThermoFisher	02-681-344	Röhrchen für die Gewebehomogenisierung
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001	Komponente im Dissoziationspuffer
Fc-Block CD16/32 Antikörper	Biolegend	101320	1:100 Verdünnungs-GenlteMACS-Dissoziator
	Miltenyi Biotec	130-093-235	Vergleich der Lungenverdauung mit oder ohne mechanischen Dissoziator
gentleMACS C-Röhrchen	Miltenyi Biotec	130-093-237	Röhrchen für die Gewebedisskopie mit genlteMACS-Dissoziator
Halt-Protease- und Phosphatase-Inhibitor cocktial	ThermoFisher	78442	Komponente im Homogenisierungspuffer
Laser-Doppler-Monitor	Moor	MOORVMS-LDF	Überwachung des Blutflusses während des tMCAO
LEGENDplex proinflammatorisches Chemokin-Panel	Biolegend	740451	Multiplex-Bead-Array
LIVE/DEAD fixierbarer Nah-IR-Fleck	ThermoFisher	L34976	Zur Verwendung zum Ausschluss toter Zellen bei der durchflusszytometrischen Analyse
Ly6C-PE, Klon HK1.4	Biolegend	128008	1:800 Verdünnung
Ly6G-BV510, Klon 1A8	Biolegend	127633	1:200 Verdünnung
MCAO-Naht L56 wiederverwendbares 6-0 Medium	Doccol	602356PK10Re	tMCAO
MHC II-BV510, Klon M5/114.15.2	Biolegend	107636	1:800 Verdünnung
NK1.1-Percp/Cy5.5, Klon PK136	Biolegend	108728	1:200 Verdünnung
Siglec F-PE, Klon E50-2440	BD Biosciences	552126	1:200 Verdünnung
Seidennahtfaden, Größe 6/0	Fine Science Tools	18020-60	tMCAO
SomnoSuite Anästhesiesystem	Kent Scientific	SS-01	Mausanästhesie für tMCAO
TCRb-BV510, Klon H57-897	Biolegend	109234	1:200 Verdünnung
Zirkonoxid/Kieselsäurekügelchen, 2,3 mm	Biospec	11079125z	Kügelchen für die Gewebehomogenisierung