Methodenartikel

Charakterisierung von Immunzellen und proinflammatorischen Mediatoren im pulmonalen Milieu

DOI:

10.3791/61359

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24. Juni 2020

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1Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University, 2Department of Neuroscience, West Virginia University, 3Rockefeller Neuroscience Institute, West Virginia University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Durchflusszytometrie, um die Veränderungen der Immunzellzusammensetzung, des Zytokinprofils und des Chemokinprofils in der pulmonalen Umgebung nach einem vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss, einem murinen Modell des ischämischen Schlaganfalls, zu identifizieren.

Zusammenfassung

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Die Expansion, Aktivierung und der Transport von Immunzellen in die Lunge, die durch die Expression mehrerer Zytokine und Chemokine gesteuert werden, können durch schwere Hirnverletzungen verändert werden. Dies wird durch die Tatsache belegt, dass Lungenentzündung eine der Haupttodesursachen bei Patienten ist, die einen ischämischen Schlaganfall erlitten haben. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Verwendung der mehrfarbigen Durchflusszytometrie zu beschreiben, um 13 Arten von Immunzellen in der Lunge von Mäusen zu identifizieren, einschließlich alveolärer Makrophagen, interstitieller Makrophagen, CD103+ oder CD11b + dendritische Zellen (DCs), plasmazytoide DCs, Eosinophile, Monozyten / Monozyten-abgeleitete Zellen, Neutrophile, lymphoide T- und B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, nach ischämischer Schlaganfallinduktion durch vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss. Darüber hinaus beschreiben wir die Herstellung von Lungenhomogenaten unter Verwendung einer Perlenhomogenisierungsmethode, um die Expressionsniveaus von 13 verschiedenen Zytokinen oder Chemokinen gleichzeitig durch Multiplex-Bead-Arrays gekoppelt mit durchflusszytometrischer Analyse zu bestimmen. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die pulmonale Immunantwort in anderen Krankheitssituationen wie infektiösen Lungenerkrankungen oder allergischen Erkrankungen zu untersuchen.

Einleitung

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Die Lunge ist ein Barriereorgan, das der äußeren Umgebung ausgesetzt ist und daher ständig immunologischen Herausforderungen wie Krankheitserregern und Allergenen ausgesetzt ist1. Die Aktivierung lungenresidenter Immunzellen und die Infiltration von Immunzellen aus der Peripherie sind erforderlich, um Krankheitserreger aus der pulmonalen Umgebung zu entfernen. Darüber hinaus halten lungenresidente Immunzellen die Toleranz gegenüber kommensalen Bakterien aufrecht, was darauf hindeutet, dass diese Zellen eine Rolle bei der Pathogenentfernung und der Aufrechterhaltung der Homöostase spielen1. Alveoläre und interstitielle Ma....

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Protokoll

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Alle durchgeführten Protokolle und Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der West Virginia University genehmigt. Die Mäuse wurden unter spezifisch-pathogenfreien Bedingungen im Vivarium der West Virginia University untergebracht.

1. Vorbereitung von Lösungen

  1. Perfusionspuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS) vorbereiten. Verwenden Sie ungefähr zwei 10-ml-Aliquots eiskaltes PBS pro Maus.
  2. Lungenzellenmedium/FACS-Puffer vorbereiten. FACS-Puffer enthält PBS, ergänzt mit 1% fetalem Rinderserum (FBS). Halten Sie das Medium für den gesamten Prozess der Lungenexzision und -übertragung ka....

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Ergebnisse

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Wir berichteten kürzlich, dass die ischämische Schlaganfallinduktion bei Mäusen die Immunzellzusammensetzung der Lunge verändert11. Insbesondere erhöhte die vorübergehende zerebrale Ischämie den Prozentsatz der alveolären Makrophagen, Neutrophilen und CD11b + DCs, während die Prozentsätze von CD4 + T-Zellen, CD8 + T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Eosinophilen im Lungenkompartiment abnahmen. Darüber hinaus entsprach die zelluläre Veränderung signifikant verminderten Konzentrationen multipler Chemo.......

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Diskussion

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Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Identifizierung von Lungenimmunzelltypen und die Expression von Chemokinen oder Zytokinen in derselben Maus. Wenn eine histopathologische Untersuchung gewünscht wird, kann ein einzelner Lappen zu diesem Zweck entfernt und fixiert werden, bevor mit den Einzelzellisolierungsschritten fortgefahren wird. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass dieser Ansatz in einigen Krankheitssituationen möglicherweise nicht geeignet ist, wenn die Veränderung der Immunzellzusa.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss P20 GM109098 und das Innovation Award Program von Praespero an Edwin Wan unterstützt. Durchflusszytometrie-Experimente wurden in der WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility durchgeführt, die durch die NIH-Zuschüsse S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 und P20 GM103434 unterstützt wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
B220-APC, Klon RA3-6B2Biolegend1032121:200 Verdünnung
Beadbug 3-Positionen-Bead-HomogenisatorBenchmark ScientificD1030Gewebehomogenisator
CCR2-BV421, Klon SA203G11Biolegend1506051:200 Verdünnung
CD103-BV421, Klon 2E7Biolegend1214221:200 Verdünnung
CD11b-PE/Cy7, Klon M1/70Biolegend1012161:400 Verdünnung
CD11c-PE/Cy7, Klon N418Biolegend1173181:200 Verdünnung
CD11c-Percp/Cy5.5, Klon N418Biolegend1173281:200 Verdünnung
CD4-BV421, Klon GK1.5Biolegend1004431:200 Verdünnung
CD45-FITC, Klon 30-F11Biolegend1031081:200 Verdünnung
CD64-APC, Klon X54-5/7.1Biolegend1393061:200 Verdünnung
CD8-PE, Klon 53-6.7Biolegend1007081:800 Verdünnung
Kollagenase DSigma Aldrich11088882001Komponente im Dissoziationspuffer
Konisches SchraubverschlussröhrchenThermoFisher02-681-344Röhrchen für die Gewebehomogenisierung
DNase ISigma Aldrich10104159001Komponente im Dissoziationspuffer
Fc-Block CD16/32 AntikörperBiolegend1013201:100 Verdünnungs-GenlteMACS-Dissoziator
Miltenyi Biotec130-093-235Vergleich der Lungenverdauung mit oder ohne mechanischen Dissoziator
gentleMACS C-RöhrchenMiltenyi Biotec130-093-237Röhrchen für die Gewebedisskopie mit genlteMACS-Dissoziator
Halt-Protease- und Phosphatase-Inhibitor cocktialThermoFisher78442Komponente im Homogenisierungspuffer
Laser-Doppler-MonitorMoorMOORVMS-LDFÜberwachung des Blutflusses während des tMCAO
LEGENDplex proinflammatorisches Chemokin-PanelBiolegend740451Multiplex-Bead-Array
LIVE/DEAD fixierbarer Nah-IR-FleckThermoFisherL34976Zur Verwendung zum Ausschluss toter Zellen bei der durchflusszytometrischen Analyse
Ly6C-PE, Klon HK1.4Biolegend1280081:800 Verdünnung
Ly6G-BV510, Klon 1A8Biolegend1276331:200 Verdünnung
MCAO-Naht L56 wiederverwendbares 6-0 MediumDoccol602356PK10RetMCAO
MHC II-BV510, Klon M5/114.15.2Biolegend1076361:800 Verdünnung
NK1.1-Percp/Cy5.5, Klon PK136Biolegend1087281:200 Verdünnung
Siglec F-PE, Klon E50-2440BD Biosciences5521261:200 Verdünnung
Seidennahtfaden, Größe 6/0Fine Science Tools18020-60tMCAO
SomnoSuite AnästhesiesystemKent ScientificSS-01Mausanästhesie für tMCAO
TCRb-BV510, Klon H57-897Biolegend1092341:200 Verdünnung
Zirkonoxid/Kieselsäurekügelchen, 2,3 mmBiospec11079125zKügelchen für die Gewebehomogenisierung

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
  2. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue ....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Immune Cell AnalysisFlow CytometryLung Homogenate PreparationMultiplex Bead ArrayCytokine Chemokine DetectionIschemic Stroke ModelMiddle Cerebral Artery OcclusionAlveolar MacrophagesInterstitial MacrophagesDendritic Cells

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