इस प्रक्रिया का लक्ष्य ड्रोसोफिला मेलानोगेस्टरका उपयोग करके न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडल में डीएलएम न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों (एनएमजेएस) की संरचनात्मक अखंडता का आकलन करने के लिए पृष्ठीय देशांतर मांसपेशी (डीएलएम) ऊतक को विच्छेदन करना है।
ड्रोसोफिला न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़े सिनैप्टिक संरचना और कार्य का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में कार्य करता है। जबकि बहुत काम ड्रोसोफिला लार्वा में न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों (एनएमजेएस) पर केंद्रित है, वयस्क ड्रोसोफिला में सिनैप्टिक अखंडता का आकलन करने पर बहुत कम ध्यान दिया गया है। यहां हम पृष्ठीय देशांतर मांसपेशियों (डीएलएमएस) के विच्छेदन के लिए एक सीधी विधि प्रदान करते हैं, जो उड़ान की क्षमता के लिए आवश्यक हैं। एक व्यवहार readout के रूप में उड़ान के अलावा, यह विच्छेदन दोनों डीएलएम सिनेप्स और मांसपेशियों के ऊतकों के लिए सिनैप्टिक मार्कर या ब्याज के प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंटी लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करके संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी होने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल अधिकांश न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की प्रगतिशील, आयु-निर्भर प्रकृति को मॉडल करने के लिए उम्र बढ़ने के दौरान वयस्क ड्रोसोफिला में सिनेप्स की संरचनात्मक अखंडता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।
सिनैप्टिक रोग सबसे प्रमुख न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की प्राचीनतम पहचानों में से एक है1,2,3,,4,5,,6. हालांकि, बहुत कम कैसे इन संरचनात्मक और कार्यात्मक हानि रोग प्रगति के बाद के चरणों से संबंधित के बारे में जाना जाता है । ड्रोसोफिला लार्वा एनएमजेएस 7 ,8,,9का उपयोग करके सिनैप्स विकास और विकास को समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली साबितहुईहै। हालांकि, तीसरा लार्वा इंस्टार चरण केवल कुछ दिनों तक रहता है, जो प्रगतिशील, उम्र पर निर्भर न्यूरोडिजेनरेशन का अध्ययन करने में उनकी उपयोगिता को सीमित करता है। लार्वा एनएमजे का आकलन करने का एक विकल्प वयस्क ड्रोसोफिलामें सिनैप्टिक संरचनाओं की जांच करना है, जैसे कि पृष्ठीय देशांतर मांसपेशियों (डीएलएमएस) पर गठित सिनैप्सिस जो उड़ान10 , 11,12,13,14,15, 15,1613,केलिए आवश्यक हैं।, ये त्रिपक्षीय सिनैप्स संरचनात्मक रूप से स्तनधारी सिनैप्स17के समान तरीके से आयोजित किए जाते हैं, जो न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के मॉडल का आकलन करने के लिए एक अनूठा लाभ प्रदान करते हैं।
यहां हम न्यूरोडिजेनरेशन के ड्रोसोफिला मॉडल में वयस्क एनएमजेएस की संरचनात्मक अखंडता का विश्लेषण करने के लिए एक सीधी विधि का वर्णन करते हैं। पिछले डीएलएम विच्छेदन विधियों और अध्ययनों ने 18 ,19 , 20, 22 ,22,,,,,23के विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए मांसपेशियों के ऊतकोंकोसंरक्षित करनेकेमहत्व पर बल दिया है ।23 हमारा प्रोटोकॉल न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की जांच करने के लिए न्यूरोनल और मांसपेशियों के ऊतकों दोनों को संरक्षित करने के लिए एक व्यापक विधि प्रदान करता है। इन बीमारियों का अध्ययन करने का एक और प्रमुख घटक उम्र पर निर्भर तरीके से न्यूरोनल लॉस को समझने की क्षमता है। पिछला कार्य इस बात की एक महत्वपूर्ण और गहन समझ प्रदान करता है कि कायापलट के दौरान डीएलएम एनएमजेस का गठन प्रारंभिक वयस्कता11, 12,14,15,,16,24में कैसेहोताहै । हमारा प्रोटोकॉल उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में उम्र पर निर्भर तरीके से डीएलएम एनएमजेएस की जांच करने के लिए इस काम पर निर्माण करने के लिए एक विधि स्थापित करता है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का उपयोग करके, हम डीएलएम ऊतक के विच्छेदन के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि वयस्क ड्रोसोफिला में संरचनात्मक धुंधला और सिनैप्टिक मार्कर के माध्यम से सिनैप्टिक अखंडता का आकलन करने के लिए इसे कैसे लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है कि डीएलएम ऊतक को काटना आसान बनाता है तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश फ्रीजिंग है । इस कदम के बिना, ऊतक कम फर्म है और अधिक मुश्किल के रूप में ठीक से कटौती के रूप में चित्रा 3में मनाया । यह प्रोटोकॉल मोटर न्यूरॉन्स और मांसपेशियों के ऊतकों 18 , 19 , 20 ,22, 22,22,,,23दोनों के संरक्षण की अनुमति देने19के,लिए पिछले विच्छेदन विधियों परबनाताहै । इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि जब बाइसेक्शन के लिए मिडलाइन को काट दिया जाता है, तो प्रति छाती दो साफ प्रेप प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। एक तरह से प्रति फ्लाई कम से कम एक षिकोराक्स सुनिश्चित करने के लिए, आप जानबूझकर एक साफ तैयारी प्राप्त करने के लिए छाती के एक तरफ काट सकते हैं। इस संशोधन के साथ, ब्लेड ब्रेकर के साथ नमूने को साफ करने के लिए कटौती से अतिरिक्त अतिरिक्त ऊतक को हटाने की भी आवश्यकता हो सकती है। इस तकनीक के लिए नए लोगों के लिए, निरंतर अभ्यास के साथ, बाइसेक्शन की सटीकता में वृद्धि होगी।
यहां वर्णित विधि शोधकर्ताओं को आसानी से अपने जीवन भर में किसी भी समय वयस्क DLM एनएमजेएस की संरचनात्मक अखंडता का आकलन करने की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ सिनैप्टिक मार्कर का उपयोग करके न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडल में सिनैप्टिक अखंडता तक पहुंचने की क्षमता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह एप्लिकेशन संरचनात्मक धुंधला(चित्रा 1C\u2012H)के साथ सकल आकृति विज्ञान में परिवर्तन की कल्पना करने में मदद कर सकता है। इसके अतिरिक्त, सिनैप्टिक अखंडता का आकलन प्रेसिनैप्टिक मार्कर के धुंधला होने के साथ किया जा सकता है, जिसमें सिनेपसिन28 (चित्रा2\u2012F), सिंटैक्सिन29 (चित्रा 2जी \u2012L)और बीआरपी30 (चित्रा 2M\u2012R)तक सीमित नहीं है।A‒F इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शन करते हुए ग्लूटामेट रिसेप्टर III सबयूनिट एंटीबॉडी31 (चित्रा 2एस\u2012X)का उपयोग करके पोस्टसिनैप्टिक मांसपेशी ऊतक का भी आकलन किया जा सकता है।
शोधकर्ता विभिन्न प्रकार की बीमारियों से जुड़े सिनेप्स की संरचनात्मक अखंडता की व्यापक जांच करने के लिए कार्यात्मक डेटा को पूरक करने के लिए इस विच्छेदन विधि का भी उपयोग कर सकते हैं। ये सिनेप्स इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग32 , 33,34,और उड़ान परख10के माध्यम से कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देते हैं ।34 यह प्रोटोकॉल कई अनुप्रयोगों और परख के लिए ऊतक तक पहुंच में आसानी प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, भविष्य के अध्ययन इस प्रोटोकॉल का उपयोग घनत्व और15, 16,के सिनैप्स की संख्या के परिमाणीकरण के माध्यम से सिनैप्टिक परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए करसकतेहैं। जबकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन्स की सिनैप्टिक अखंडता की जांच करता है, मांसपेशियों की कोशिका हानि का आकलन करने के लिए पूरक प्रोटोकॉल भी ट्यूनल स्टेनिंग35का उपयोग करके इस विच्छेदन के साथ किया जा सकता है। न्यूरोनल हानि की जांच करने के लिए, वक्ष गैंगलियन36 के विच्छेदन का उपयोग ट्यूनल धुंधला के साथ भी किया जा सकता है। हम उम्मीद करते हैं कि यहां वर्णित विच्छेदन में उम्र से संबंधित विकृतियों के साथ-साथ न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों का आकलन करने वाले भविष्य के अध्ययनों के लिए अधिक अनुप्रयोग होंगे।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 NS110727) द्वारा डी टी.B के लिए समर्थन दिया गया था ।
32% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Tissue preservation |
Alexa Fluor 568 goat anti mouse | Fisher Scientific | A11031 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
Alexa Fluor 568 goat anti rabbit | Fisher Scientific | A11036 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
anti- Bruchpilot (BRP) antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | NC82 | Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration. |
anti-GluRIII antibody | Gift from Aaron DiAntonio | N/A | Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration. |
anti-Synapsin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration. |
anti-Syntaxin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 8C3 | labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration. |
BenchRocker | Genesee Scientific | 31-302 | Rotating samples during staining |
Blade Breaker | Fine Science Tools | 10053-09 | Used for holding feather blade |
cover slips | Fisher Scientific | 12548A | For mounting tissue |
cryogenic gloves | VWR | 97008-198 | protect hands from liquid nitrogen |
cryogenic tweezers | VWR | 82027-432 | Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen |
dewar flask-1900 mL | Thomas Scientific | 5028M54 | Hold liquid nitrogen |
Feather Blades | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | Scalpel Blades |
Fine Forecps x 2 | Fine Science Tools | 11252-20 | One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone. |
FITC-conjugated anti HRP | Jackson Laboratories | 123-545-021 | Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration |
freezer box (Black) | Fisher Scientific | 14100F | Protects samples from light |
glass pasteur pipettes | VWR | 14637-010 | Used to transfer samples |
glass slides | Fisher Scientific | 12550143 | For mounting tissue |
mounting media (vectashield) anti-fade | VWR | 101098-042 | Mounting media retains fluorescent signaling |
nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Seals microscope slides |
normal goat serum | Fisher Scientific | PCN5000 | Prevents non-specific binding of antibodies |
paint brush | Genesee Scientific | 59-204 | Transferring flies |
PBS | Fisher Scientific | 10-010-023 | Saline solution for dissecting and staining |
Phalloidin 647 | Abcam | AB176759 | Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration |
plastic petri dish (100 mm) | VWR | 25373-100 | Dissection dish |
reinforcement labels | W.B. Mason | AVE05722 | Provides support for glass coverslip over the mounted tissue |
sharpening block | Grainger | 1RDF5 | Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair |
slide folder | VWR | 10126-326 | Sample storage |
standard office scissors | W.B. Mason | ACM40618 | Cutting reinforcement labels |
Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Coating for dissection dish |
Triton-X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22140 | Helps to permeabilize tissue |
Vannas Disssection Sissors | Fine Science Tools | 1500-00 | Ued for removing fly legs and making an incision on thorax |