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在与神经退行性变相关的成年 Drosophila 中可视化突触退化

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DOI：

10.3791/61363

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2020年5月13日

 , 
1Department of Biological Sciences, Lehigh University

本文内容

摘要

本实验的目的是解剖背侧纵肌（DLM）组织，利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的神经退行性疾病模型来评估DLM神经肌肉接头（NMJs）的结构完整性。

摘要

Drosophila 是研究与神经退行性疾病相关的突触结构和功能的有用模型。尽管已有大量研究集中于 Drosophila 幼虫的神经肌肉接头（NMJs），但对成年 Drosophila 突触完整性的评估关注较少。本文提供了一种简便的方法，用于解剖背纵肌（DLMs），该肌肉是飞行能力所必需的。除了以飞行行为作为表型读数外，该解剖方法还可使 DLM 突触和肌肉组织适用于使用荧光标记抗体对突触标志物或目的蛋白进行结构分析。本实验方案可用于评估成年 Drosophila 在衰老过程中突触的结构完整性，从而模拟大多数神经退行性疾病的进行性、年龄依赖性特征。

引言

突触功能障碍是大多数主要神经退行性疾病最早已知的特征之一1,2,3,4,5,6。然而，目前对这些结构和功能损伤如何与疾病进展的后期阶段相关联仍知之甚少。Drosophila 已被证明是利用幼虫神经肌肉接头（NMJs）研究突触生长与发育的有用模型系统7,8,9。然而，三龄幼虫阶段仅持续数天，限制了其在研究进行性、年龄依赖性神经退行性病变中的应用。除检测幼虫NMJs外，另一种方法是检测成年 Drosophila 的突触结构，例如形成于背纵肌（DLMs）上的突触，这些突触对飞行功能至关重要10,11,12,13,14,15,16。这些三联突触在结构上与哺乳动物突触具有相似的组织方式17，为研究神经退行性疾病模型提供了独特优势。

本文介绍了一种在神经退行性疾病 Drosophila 模型中分析成年个体神经肌肉接头（NMJ）结构完整性的简便方法。以往关于直间接肌（DLM）解剖的方法和研究强调了在多种应用中保持肌肉组织完整的重要性18,19,20,21,22,23。本实验方案提供了一种全面的方法，可同时保存神经组织和肌肉组织，用于研究神经退行性疾病。研究此类疾病的另一个关键方面是能够以年龄依赖的方式理解神经元的丢失。以往的研究已对直间接肌神经肌肉接头在变态发育至早期成虫阶段的形成过程提供了深入且关键的认识11,12,14,15,16,24。本方案在此基础上建立了一种方法，可用于在衰老及神经退行性疾病过程中以年龄依赖的方式研究直间接肌神经肌肉接头的变化。

方案

1. 转基因果蝇的制备

  1. 为进行本实验，使用 CO2 垫麻醉收集 OK371-Gal425 virgin 雌蝇和 UAS-TDP-43M337V 26 雄蝇（图 1A），以便分选。
  2. 将麻醉后的果蝇分选至含标准黑腹果蝇培养基的试剂瓶中进行杂交。将标记好的试剂瓶置于 25 °C 环境中，等待下一代果蝇羽化。
    注意：在子代果蝇羽化前清除试剂瓶中的成虫，以确保获得正确的基因型。
  3. 子代果蝇羽化后，将其收集至试剂瓶中，并按性别分选，开始老化处理以准备实验条件。
  4. 果蝇收集完成后，每 2 天将其转移至新鲜食物中，直至果蝇达到 21 天龄。

2. 解剖准备

  1. 为进行解剖，准备室温的磷酸盐缓冲液（1× PBS）、一个涂有硅胶弹性体的10 cm解剖皿、直刃解剖剪、一套钝头解剖镊、P200移液器及移液器吸头、2.0 mL微量离心管、普通办公剪刀、70%乙醇、一个6 cm培养皿，以及用1× PBS将32%甲醛稀释至4%的溶液。
  2. 为每种基因型或处理条件标记好微量离心管，并向每管中加入900 µL室温1× PBS和150 µL 32%甲醛。配制4%甲醛固定液时需佩戴手套和护目镜。
  3. 每组取6–10只果蝇，直接从培养管中用CO2麻醉，然后将果蝇浸入盛有70%乙醇的6 cm培养皿中。使用毛笔将果蝇压入乙醇中，确保样本完全浸没，以去除体表角质层外的油层。

3. 胸部的分离与固定

  1. 解剖每个样本前，在涂有硅胶弹性体的解剖皿中加入约 7‒10 mL 的 1× PBS，确保组织样本完全浸没。
  2. 用钝头镊子夹住果蝇的翅膀或腿部，将其从 70% 乙醇中转移至解剖皿中。
  3. 在解剖显微镜下将样本置于视野中央，随后将其浸入 1× PBS 中，并使用钝头 Dumont #5 精细镊子小心去除翅膀。
  4. 使用 Vannas 直刃弹簧解剖剪，在外骨骼腹侧做一小切口以去除腿部。在步骤 3.8 中，该切口将有助于甲醛渗透组织。
  5. 一手持剪刀，另一手持镊子，使果蝇腹面朝上固定。用钝头镊子稳定样本的同时，用解剖剪切除头部和腹部。
  6. 使用改装过的移液枪头将分离出的胸部转移到步骤 3.2 中已标记的离心管中。
    注意：将移液器设定为 40 µL，以避免向固定液中额外加入 1× PBS。
  7. 对每个样本重复执行上述步骤 3.2‒3.6。
  8. 在室温下固定样本 30 分钟。
  9. 使用巴斯德移液管吸除固定液，并在通风橱内的适当废液容器中弃去。用巴斯德移液管以每次 1.5 mL 的 1× PBS 对样本清洗三次，第四次清洗时仅使用 750 µL，并将组织保留在 1× PBS 中。
    注意：此时组织样本可在 4 °C 下保存最多 3 天，再进行后续步骤。

4. 快速冷冻与胸部切开

  1. 开始切片前，佩戴适当的低温防护手套和安全眼镜，将液氮注入杜瓦瓶中。准备刀片断裂器、手术刀片、一把精细镊子、冰、预冷的1×PBS以及低温镊子。
  2. 准备一个装有冰的冰桶，以保持1×PBS处于冰冻低温状态。
  3. 使用刀片折断器以一定角度夹住羽状刀片，弯曲刀片以折下一个小片。然后可用刀片折断器将刀片固定在适当位置，作为小型手术刀使用。
    注意：一把刀片应可供所有组使用。若刀片破损或变钝，需更换。
  4. 将干净的吸头安装到P200上，吸取1/5th 样本运输用的尖端部分。
  5. 为每组准备一个新的微量离心管，向每管中加入 200 µL 的 1x PBS。该第二根离心管将用于收集最终的 DLM 样品。
  6. 使用巴斯德吸管从试管中移除所有1× PBS。
  7. 佩戴适当的防护装备，使用低温镊子将试管浸入液氮瓶中10秒。
    注意：试管应紧密封闭，以防试管爆裂。
  8. 从液氮中取出试管，用巴氏吸管向样品中加入约 300 µL 冰冷的 1x PBS。将样品保持在冰上。
  9. 向涂有硅胶弹性体的10 cm解剖皿中加入预冷的1×PBS，并用改良的200 µL移液器加入第一个胸段。
  10. 将胸部腹面朝上放置。一手用钝头镊子固定胸部，另一手持精细镊子去除部分胸神经节，以暴露胸部中线。
  11. 以胸廓中线为引导，进行浅层切割，深度约为1/3rd 用刀片切开胸腔。
  12. 用镊子将胸部以45°角固定，取出刀片后重新插入，沿胸部中线垂直向下切割，得到两个半胸腔。
  13. 一次取一个半胸腔，去除DLM肌纤维F下方的多余组织图1B），即最腹侧的肌纤维。使用刀片小心地进行一到两次切割，以去除多余组织，同时避免损伤背纵肌（DLMs）。
  14. 分离后，将半胸腔转移至含有1×PBS的正确离心管中。
  15. 重复步骤 4.6 至 4.14，直至每组获得 10 个解剖好的半胸廓。

5. 结构染色

  1. 将胸部样本切开后，放入封闭缓冲液（1x PBS 含 0.1% 正常山羊血清和 0.2% Triton X-100，pH 7.4）中，以通透组织并防止非特异性染色。使用巴斯德吸管去除多余的 1x PBS，并向每管中加入 1.5 mL 封闭缓冲液。在 4 °C 下封闭组织至少 1 小时。
  2. 使用荧光标记的抗体辣根过氧化物酶 488（anti-HRP-488），按 1:200 稀释，以及 Phalloidin-647 按 1:1000 稀释，溶于封闭缓冲液中，分别对运动神经元和肌肉组织进行结构染色。每管需准备 150 µL 染色液。将染色液置于 4 °C，用铝箔包裹或存于暗盒中，直至使用。
  3. 封闭完成后，用玻璃巴斯德吸管去除多余的封闭缓冲液。
  4. 在加入结构染色液前，先将染色液涡旋混匀。向每管中加入 150 µL 染色液。将样本置于暗盒中，在室温下于旋转仪上避光孵育 2 小时。
  5. 去除染色液后，在暗盒中用含 0.3% Triton X-100 的 1.5 mL 室温 1x PBS 溶液，在旋转仪上清洗组织 4 次，每次 5 分钟。样本现可进行载玻片封片。

6. 组织封片

  1. 在用PBST洗涤样本后，准备显微镜载玻片以固定组织进行染色。另需准备以下用品：玻璃盖玻片、P200移液器、200 µL移液器吸头、剪刀、透明胶片加固圈、直头镊子、抗荧光淬灭封片剂、指甲油以及用于覆盖载玻片的暗盒。
  2. 标记载玻片以标识样品，并用擦镜纸清洁载玻片，确保无污渍。
  3. 为防止盖玻片损坏半胸腔样本，使用加固标签搭建一个“桥”。取一个加固标签，将其切成两半，将每半相隔约15 mm放置。此间距必须小于盖玻片的宽度。重复此步骤四次，构建一个由5层标签组成的“桥”。
  4. 取一支P200移液器，将吸头前端剪去五分之一th 用移液器枪头将样品转移至载玻片上。样品应转移至桥区中央。
  5. 用实验室擦拭纸的边缘去除多余的PBST。使用镊子将DLMs排列整齐，确保所有样品的肌肉面朝上，角质层面朝下。
  6. 使用标准的 P200 移液器吸头，将 70 µL 封片介质加到载玻片上，避免产生气泡。从加固圈的外侧开始向中心以环形方式滴加介质。
  7. 在加固材料上放置盖玻片。
  8. 用指甲油涂抹盖玻片外围的外边缘，充分涂抹以形成对组织的完全密封。
  9. 将载玻片置于黑暗环境中平坦的表面上，静置至少10分钟以充分干燥，避免荧光淬灭或荧光信号丢失。载玻片可立即用于成像，也可存放于-20 °C的载玻片盒中以备后续观察。

7. 替代方案：使用一抗进行染色

注意：本节为可选内容，如需使用，应直接插入在第4节与第5节之间。

  1. 使用一抗染色组织时，将组织浸入封闭缓冲液中，孵育至少1小时。
  2. 用封闭缓冲液按适当比例稀释一抗。至少准备每组150 µL的抗体混合液。注意样品需保持静止。4 °C保存，待用。
  3. 用巴斯德吸管吸除多余的封闭缓冲液。短暂涡旋混匀一抗溶液，每组加入150 µL抗体混合液，4 °C过夜孵育。
  4. 次日，移除一抗溶液，用PBST在旋转器上洗涤组织4次，每次5分钟。
  5. 在封闭缓冲液中配制二抗染色液。将二抗染色液加入样品中，置于避光盒内在旋转器上室温孵育2小时。
    注意：二抗染色液中也可同时包含HRP和鬼笔环肽（phalloidin）。
  6. 2小时孵育后，用PBST洗涤组织4次，每次5分钟，以去除二抗，随后进行封片。

结果

表达人类43 kDa TAR结合蛋白突变体（TDP-43M337V）的转基因果蝇的构建过程如示意图所示（图1A），展示了Gal4/UAS双元系统在Drosophila中的应用27。图示为半胸壁结构，包含六条肌纤维，从最背侧的纤维A到最腹侧的纤维F（图1B）11,12。为评估突触完整性，使用HRP和鬼笔环肽对神经肌肉接头（NMJ）进行染色（图1C‒E）。在TDP-43M337V突变体中，运动神经元至第21天时几乎无HRP染色信号（图1F），而野生型（Oregon-R）则保持完整（图1C）。肌纤维染色未见明显差异（图1D,G）。TDP-43M337V突变体中观察到的宏观形态学改变表明，在成年DLM模型中，突触完整性可被用于模拟肌萎缩侧索硬化症（ALS）这一神经退行性疾病。除结构染色外，对DLM神经肌肉接头的染色还可利用突触前标记物（图2A‒R）和突触后标记物（图2S‒X）进一步评估突触完整性。综上，这些结果说明了该解剖方案可用于神经退行性疾病中DLM组织的研究。

该解剖操作的一个关键步骤是使用液氮对组织进行速冻，以便于组织的切开。在野生型果蝇中使用液氮的效果如图所示，肌肉组织未出现损伤或纤维断裂（图3A‒C）。若不使用液氮，组织解剖将更加困难。例如，按照本方案操作但跳过液氮速冻步骤时，组织更容易受到解剖工具的损伤，如神经元受损（图3D）或肌纤维损伤（图3E）。无论样本的基因型如何，使用液氮均有助于防止DLM组织在操作过程中发生损伤（图3C和3F）。

遗传杂交图解，神经元荧光显微镜观察，果蝇肌肉结构分析
图1：DLM突触进行性失神经支配 果蝇 肌萎缩侧索硬化症模型。 (A) 示意图展示了表达人类突变型43 kDa TAR DNA结合蛋白（TDP-43）的ALS转基因果蝇的构建过程。B示意图展示了成人半侧胸腔的形态与方位 果蝇通过该方案，我们可以利用 HRP（绿色）对运动神经元进行结构染色，以及用 Phalloidin（品红色）对肌肉组织进行染色，观察 DLM NMJ 突触突触完整性进行性丧失的情况。我们的模型通过构建表达人类 TDP-43 突变体的成年果蝇，描绘了肌萎缩侧索硬化症（ALS）成年模型中突触完整性的丧失过程M337V 在运动神经元中（图1F‒H) 与野生型（WT）相比图1C‒E）果蝇肌纤维C中的突触。箭头标示了野生型（WT）突触的示例（图1C）以及突触完整性丧失的示例。比例尺 =20 µm 在63倍放大倍数下。 请点击此处以查看此图的放大版本。

神经元蛋白定位、HRP 和 Synapsin 标记物、荧光显微镜示意图
图 2：利用成年 NMJ 处的突触前标记物评估突触完整性。 在14日龄野生型果蝇的C肌纤维中，也可通过突触前和突触后标记物评估突触完整性。突触前标记物Synapsin（B）、Syntaxin（H）和Bruchpilot（BRP）（N）与HRP（A、G、M）共同染色。染色结果显示这些标记物定位于突触前终末（C、I、O）。在更高放大倍数下，图像更详细地展示了Synapsin（E）、Syntaxin（K）和BRP（Q）与HRP（D、J、P）的共定位情况（图 F、L 和 R）。我们还展示了突触后标记物谷氨酸受体III（GluRIII）（T）与HRP（S）的共染色结果。共染色结果表明了这些标记物的应用价值（U）。在更高放大倍数下，代表性图像示例显示GluRIII（W）定位于突触后肌组织，HRP（V）定位于突触前终末（X）。图中A‒C、G-I、M‒O、S‒U各面板的比例尺为63倍放大下的20 µm。D‒F、2J-2L、2P-2R 和 2V-2X各面板的比例尺为63倍放大下的10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

使用HRP和鬼笔环肽染色的神经组织显微图像，合并的荧光结果。
图3：液氮在DLM解剖中的应用价值。 为了展示液氮在DLM解剖中的实用性，我们展示了第21天野生型果蝇在有无液氮条件下来自C肌纤维的比较结果。使用液氮后，鬼笔环肽染色（B）保持完整，且不影响HRP染色（A、C）。未使用液氮时，肌肉组织变得呈丝状且难以进行中线切分（E），同时由于技术误差导致HRP染色（D、F）受损。白色箭头指示使用液氮时无肌肉损伤区域（B）以及未使用液氮时的肌肉组织损伤区域（E）。比例尺 = 63倍放大下20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

利用本方案中描述的方法，我们提供了一种简便的DLM组织解剖技术，并展示了如何通过结构染色和突触标志物来评估成年Drosophila中的突触完整性。该方案中的一个关键步骤是使用液氮进行瞬时冷冻，这一步骤可使DLM组织更易于解剖。如图3所示，若缺少此步骤，组织会变得较软，难以精确切割。本方案在先前解剖方法的基础上进行了改进，能够同时保留运动神经元和肌肉组织18,19,20,21,22,23。本方案的一个局限性在于，在沿中线进行半胸体切开时，较难从每个胸部样本获得两个完整的半侧制备物。为确保每只果蝇至少获得一个完整的半胸体制备物，可有意偏向胸部一侧进行切割，从而获得一个干净的制备样本。采用这种修改方法时，可能还需要使用刀片断裂法去除切面多余的组织，以清理样品。对于初次使用该技术的研究者而言，随着持续练习，切开的准确性将逐步提高。

本文所述方法可使研究人员在成年果蝇DLM神经肌肉接头（NMJ）生命周期的任何阶段轻松评估其结构完整性。该方案的主要优势在于能够利用突触标志物来检测神经退行性疾病模型中的突触完整性。我们证明，通过结构染色可直观展示整体形态的变化（图1C‒H）。此外，还可通过染色突触前标志物（包括但不限于Synapsin28（图2A‒F）、Syntaxin29（图2G‒L）和BRP30（图2M‒R））来评估突触完整性。突触后肌肉组织也可利用谷氨酸受体III亚基抗体进行检测31（图2S‒X），进一步体现本方案的实用性。

研究人员还可利用该解剖方法结合功能数据，全面检测与多种疾病相关的突触结构完整性。这些突触还可用于电生理记录32,33,34和飞行实验10等功能分析。本方案还可为多种应用和检测提供便捷的组织获取途径。例如，未来的研究可利用该方案通过量化突触密度和数量来评估突触变化15,16。尽管本文所述方案主要针对运动神经元的突触完整性进行检测，但结合TUNEL染色35，也可利用该解剖方法实施评估肌细胞丢失的互补性实验方案。为检测神经元丢失，还可结合TUNEL染色对胸段神经节36进行解剖。我们预计，本文所述的解剖方法将在未来针对年龄相关性疾病以及神经退行性疾病的研究中具有更广泛的应用前景。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（R01 NS110727）资助，项目负责人：D.T.B.

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
32% 甲醛Electron Microscopy Sciences15714组织保存
Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠抗体Fisher ScientificA11031标记一抗，使用浓度为 1:200。
Alexa Fluor 568 山羊抗兔抗体Fisher ScientificA11036标记一抗，使用浓度为 1:200。
抗 Bruchpilot (BRP) 抗体Developmental Studies Hybridoma BankNC82染色突触前神经元的活性区，使用浓度为 1:25。
抗 GluRIII 抗体Aaron DiAntonio 惠赠N/A标记谷氨酸受体亚基，使用浓度为 1:1000。
抗 Synapsin 抗体Developmental Studies Hybridoma Bank3C11标记突触蛋白 synapsin，使用浓度为 1:50。
抗 Syntaxin 抗体Developmental Studies Hybridoma Bank8C3标记突触蛋白 syntaxin，使用浓度为 1:10。
BenchRockerGenesee Scientific31-302染色过程中旋转样品
刀片夹持器Fine Science Tools10053-09用于固定 Feather 刀片
盖玻片Fisher Scientific12548A用于组织封片
低温手套VWR97008-198保护手部免受液氮伤害
低温镊子VWR82027-432用于在液氮中夹持 2.0 mL 离心管
杜瓦瓶（1900 mL）Thomas Scientific5028M54盛装液氮
Feather 刀片Electron Microscopy Sciences72002-01手术刀片
精细镊子 × 2Fine Science Tools11252-20一对精细镊子用于清除胸部中线组织；另一对可用磨刀石磨钝。
FITC 标记的抗 HRP 抗体Jackson Laboratories123-545-021染色运动神经元，使用浓度为 1:100。
冻存盒（黑色）Fisher Scientific14100F保护样品免受光照
玻璃巴斯德吸管VWR14637-010用于转移样品
载玻片Fisher Scientific12550143用于组织封片
封片介质（Vectashield）抗荧光淬灭剂VWR101098-042封片介质可维持荧光信号
指甲油Electron Microscopy Sciences72180密封显微镜载玻片
正常山羊血清Fisher ScientificPCN5000防止抗体非特异性结合
画笔Genesee Scientific59-204转移果蝇
PBSFisher Scientific10-010-023用于解剖和染色的生理盐水溶液
Phalloidin 647AbcamAB176759染色肌肉组织中的 F-肌动蛋白，使用浓度为 1:1000。
塑料培养皿（100 mm）VWR25373-100解剖皿
加强型标签纸W.B. MasonAVE05722为覆盖在组织上的盖玻片提供支撑
磨刀块Grainger1RDF5保持精细镊子锋利，并用于磨钝另一对镊子
载玻片存放夹VWR10126-326样品储存
标准办公剪刀W.B. MasonACM40618裁剪加强型标签纸
Sylgard 184Electron Microscopy Sciences24236-10解剖皿的涂层材料
Triton-X-100Electron Microscopy Sciences22140有助于组织通透
Vannas 解剖剪Fine Science Tools1500-00用于去除果蝇腿部并在胸部做切口

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在与神经退行性变相关的成年 Drosophila 中可视化突触退化
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