Summary
这个程序的目标是解剖后纵向肌肉（DLM）组织，以评估DLM神经肌肉结（NMJs）在神经退行性疾病模型使用果 蝇黑色素酮的结构完整性。
Abstract
果蝇是评估与神经退行性疾病相关的突触结构和功能的有用模型。虽然许多工作都集中在果蝇幼虫的神经肌肉结（NMJs）上，Drosophila 但评估成人果蝇的突触完整性受到的关注则少得多。在这里，我们提供了一个简单的方法来解剖的后纵向肌肉（DM），这是飞行能力所需的。除了作为行为读出飞行外，这种解剖还允许DLM突触和肌肉组织使用荧光标记的突触标记或感兴趣的蛋白质进行结构分析。该协议允许评估成人果蝇在衰老期间突触的结构完整性，以模拟大多数Drosophila神经退行性疾病的渐进性、年龄依赖性。
Introduction
突触功能障碍是大多数主要,神经退行性疾病1，2，3，4，5，6,2,3,4的已知5最早的特征之一。然而，对于这些结构和功能损伤与疾病进展的后期阶段的关系，人们对此了解得很少。果蝇已被证明是一个有用的模型系统，用于了解突触生长和发育使用幼虫NMJs7，8，9。7,8,9然而，第三个幼虫星阶段只持续几天，限制了他们在研究渐进的，年龄依赖性神经退化的效用。评估幼虫NMJs的替代方案是检查成人果蝇的突触结构，如在多萨尔纵向肌肉（DLMs）上形成的突触，这是飞行10，11，12，13，14，15，16。,11,12,13,14,15,16这些三方突触的结构组织方式与哺乳动物突触17相似，为评估神经退行性疾病的模型提供了独特的优势。
在这里，我们描述了一个简单的方法来分析成人NMJs的结构完整性在神经退化的果蝇模型。以往的DLM解剖方法和研究都强调保存肌肉组织对于各种应用的重要性18，19，20，21，22，23。,19,20,21,22,23我们的协议提供了一个综合的方法，以保存神经元和肌肉组织，以调查神经退行性疾病。研究这些疾病的另一个主要组成部分是能够理解神经元损失在年龄依赖的方式。先前的工作提供了一个关键和深入的了解，DLM NMJ是如何形成在变质到成年早期11，12，14，15，16，24。11,12,14,15,16,24我们的协议建立了一种方法，以研究DLM NMJ在老化和神经退行性疾病中的年龄依赖的方式。
Protocol
1. 转基因苍蝇的生成
- 为了为这个实验生成转基因苍蝇，收集OK371-Gal425处女雌性苍蝇和雄性UAS-TDP-43M337V 26（图1A）通过麻醉苍蝇与CO2在垫上排序。
- 用标准的果蝇介质将麻醉苍蝇分拣到小瓶中。将标有 25°C 的小瓶放在 25 °C 处，供下一代出现。
注：在后代出现之前，从小瓶中清除成人，以确保适当的基因型。 - 一旦后代出现，收集转基因苍蝇到小瓶和排序的性别开始老化的实验条件。
- 一旦收集苍蝇，每2天将苍蝇转移到新鲜食物，直到苍蝇21天大。
2. 解剖准备
- 要准备解剖，获取室温磷酸盐缓冲盐水（1x PBS），一个10厘米的解剖盘涂有硅胶弹性体， 直边解剖剪刀、一组钝解剖钳、P200移液器和移液器尖端、2.0 mL 微离心管、标准办公室剪刀、70% 乙醇、6 厘米培养皿和 32% 甲醛稀释至 1x PBS 的 4%。
- 标签管每个基因型或条件，并添加900μL的1xPBS（室温）和150μL的32%甲醛到每个管。准备4%甲醛固定时戴手套和安全眼镜。
- 麻醉 6\u201210 苍蝇每组直接从小瓶与 CO2 和 潜水飞入 6 厘米培养皿与 70% 乙醇。用油漆刷将飞入乙醇中，以确保样品完全被淹没。这将去除外角质层上的油层。
3. 胸科隔离和固定
- 在解剖每个样品之前，在涂有硅胶弹性体的解剖盘中加入约 7\u201210 mL 的 1x PBS。此体积应确保组织样本完全浸没。
- 用钝钳将一只苍蝇从70%乙醇转移到解剖盘中，抓住翅膀或腿部。
- 将样品聚焦在解剖显微镜下解剖盘中。接下来将样品淹没在 1x PBS 中，并使用钝的杜蒙和细钳#5卸下机翼。
- 使用 Vannas 直边弹簧解剖剪刀，在角质层的腹侧创建一个小切口，从而去除腿部。在步骤3.8中，这种切口将允许甲醛穿透组织。
- 一手拿剪刀，另一手握住钳子，将苍蝇腹侧向上放置。在用钝钳将标本放在位位时，用解剖剪刀取出头部和腹部。
- 使用修改后的移液器尖端将隔离的胸舌从步骤 3.2 转移到带标签的管中。
注：将移液器设置为 40 μL，以避免向固定器添加额外的 1x PBS。 - 对每个试样重复上述步骤 3.2+u20123.6。
- 在室温下固定样品30分钟。
- 使用巴斯德移液器拆下固定件，并将其丢弃在烟罩下的适当废物容器中。使用巴斯德移液器，用 1.5 mL 的 1x PBS 冲洗样品三次。只需 750 μL 即可完成第四次冲洗，并在 1x PBS 中留下组织。
注：此时，组织样本可以保持在4°C长达3天，然后再继续下一步。
4. 闪光冻结和胸节
- 在开始分两节之前，请用液氮填充德瓦尔烧瓶，并戴上适当的低温防护手套和安全眼镜。获得刀片断路器、羽毛刀片、一对细钳子、冰、冰 1x PBS 和低温钳子。
- 准备一个冰桶，以保持1倍PBS冰冷。
- 使用刀片断路器以一定角度抓住羽绒刀片，然后弯曲刀片以切断一小块刀片。然后，刀片断路器可以锁定刀片的位置，用作小手术刀。
注：一个刀片应持续所有组。如果刀片断裂或变暗，请切换。 - 向 P200 添加清洁移液器尖端，并取出尖端的1/5 以运输样品。
- 为每组准备一个新的微离心管，并在每个管中加入200μL的1xPBS。第二管将用于收集最后的DLM准备。
- 使用巴氏移液器从管子上取出所有 1x PBS。
- 穿着适当的防护设备，用低温钳子将管子淹没在液氮瓶中10 s。
注：管应紧闭，防止管子爆炸。 - 从液氮中去除管子，用巴氏移液器将大约 300 μL 的冰冷 1x PBS 添加到样品中。把样品放在冰上。
- 将冰冷 1x PBS 添加到涂有硅胶弹性体的 10 厘米解剖盘中，然后用经过修改的 200 μL 移液器分配第一个胸膛。
- 将胸腹侧向上放置。一方面使用一双沉闷的钳子来定位胸部，另一方面使用一对细钳子来去除一些胸腔，以露出胸腔的中线。
- 使用胸部的中线作为参考，用刀片将浅切穿过胸部的 1/3。rd
- 从胸片上取下刀片，用钝钳将胸部以 45° 角放置。重新插入刀片，并直接切割到胸的中线。这将导致两个拥抱。
- 一次服用一个海米托拉克斯，并去除DLM肌肉纤维F（图1B）下多余的组织，即最腹的纤维。使用刀片小心地进行一次或两次切割，以去除多余的组织，而不会损坏 DAM。
- 分离后，用1x PBS将 Hemithorax 转移到正确的管中。
- 重复步骤 4.6\u20124.14，直到每组进行 10 次解剖的隐用。
5. 结构染色
- 将胸液样本分两块后，将组织放在阻断缓冲液中（1x PBS，0.1%正常山羊血清，0.2%Triton X-100在pH7.4）中渗透组织，防止非特异性染色。使用巴斯德移液器去除多余的 1x PBS，并在每个管中添加 1.5 mL 的阻尼缓冲液。在 4 °C 下堵塞组织至少 1 小时。
- 使用荧光结合抗体、马萝卜过氧化物酶488（抗HRP-488）在稀释1：200和Phalloidin-647时，在1：1000的缓冲液中分别稀释1：1000，以阻断缓冲剂，准备结构染色的样品。制造足够的污渍，每管有150μL。将污渍存放在4°C，覆盖在铝箔或暗箱中，直到准备染色。
- 堵塞后，用玻璃巴氏移液器取出多余的阻塞缓冲液。
- 在分配结构污渍之前，旋转污渍。将污渍添加到每个管中，加入 150 μL。将样品在室温下将样品放在旋转器上的暗箱中 2 小时。
- 去除污渍，在1.5 mL的室温1x PBS中洗涤组织四次，用0.3%Triton X-100在暗箱中的旋转器上洗涤5分钟。示例现在可以装入幻灯片。
6. 安装组织
- 在 PBST 中清洗样品后，准备显微镜幻灯片以安装组织进行染色。准备额外的耗材，包括玻璃盖滑、P200 移液器、200 μL 移液器尖端、剪刀、透明钢筋、直边钳、防褪色荧光安装介质、指甲油和深色盒子，以覆盖幻灯片。
- 标记幻灯片以识别样品，并用 kimwipes 清洁幻灯片，以确保没有污迹。
- 为确保海米托拉克斯样品不会因盖滑而损坏，请使用加固标签建造一座"桥"。拿一个加固标签，切成两半，把每半大约15毫米分开。此距离必须小于盖滑的宽度。重复此步骤四次，以完成 5 个标签高的"桥"。
- 拿 P200 移液器，通过切断尖端的1/5 来修改尖端，将样品传输到幻灯片。样品应转移到桥中央的幻灯片上。
- 采取实验室擦除的边缘，并删除任何多余的PBST。使用钳子，排列 DAM，使所有样品朝向肌肉侧向上和角质层侧向下。
- 使用标准 P200 移液器尖端，将 70 μL 的安装介质涂抹到幻灯片上，避免气泡。从外部到中心，以圆形模式在钢筋内分配介质。
- 在钢筋上放置盖滑。
- 使用指甲油覆盖盖玻片周围外边缘。慷慨地涂抹以形成组织的完整密封。
- 将幻灯片放在平面上，在黑暗中，允许至少 10 分钟干燥，并防止光漂白或荧光损失。幻灯片现在可用于立即成像，或存储在 -20 °C 的幻灯片文件夹中，以供以后查看。
7. 替代：用原抗体染色
注：此部分 是可选 的，如果需要，应直接在第 4 节和 5 节之间使用。
- 用原抗体染色组织，将组织淹没在阻断缓冲液中至少1小时。
- 在阻断缓冲液中用适当的稀释来准备原抗体。至少，准备足够的抗体混合物，每组有150μL。请注意，样本保持静止。储存在4°C，直到准备使用。
- 使用巴氏移液器去除多余的阻塞缓冲液。短暂地涡旋原抗体，并将150μL的抗体混合物加入到每组，并在4°C下放置样品过夜。
- 第二天，在旋转器上用PBST去除原抗体并洗涤组织4次，每次洗涤5分钟。
- 在阻塞缓冲液中准备二次污渍。将二次污渍添加到样品中，然后在旋转器上的暗盒中将其保持室温 2 小时。
注：二次染色还可以包括HRP和 phaloidin。 - 2小时孵育后，用PBST去除二次染色组织4次，5分钟，然后进行安装。
Representative Results
表达人类焦油结合蛋白的43kDa突变体（TDP-43M337V）的转基因苍蝇的生成由示意图（图1A）表示。这演示了二进制 Gal4/UAS 系统在果蝇27 中的应用。该图描绘了一个具有六根肌肉纤维的海米托拉克斯，A+u2012F从最后体纤维 A 到最腹体 F （图 1B）11，12。为了评估突触的完整性，NMJs 被染上了HRP和法罗丹（图1C+u2012E）。TDP-43M337V突变体中的运动神经元（图1F）在第21天之前几乎没有HRP染色，而WT（俄勒冈-R）保持完好无损（图1C）。肌肉染色没有明显差异（图1D，G）。TDP-43M337V突变体中观察到的毛形态变化表明，使用成人DLM模型，突触完整性如何与肌萎缩性侧硬化症（ALS）的神经退行性疾病模型有关。除了结构染色，染色DLM NMJs还可以提供突触完整性的评估与预突触（图2A+u2012R）和突触后（图2S+u2012X）标记。这些结果共同说明了这种解剖方案如何应用于神经退行性疾病中的DLM组织的研究。
这种解剖的一个关键方面是应用液氮闪光冻结组织，使两分更容易。液氮的效用在用液氮的 WT 苍蝇中证明，其中肌肉组织没有损伤或纤维被划破（图 3A+u2012C）。没有液氮，组织可能更难解剖。例如，遵循此协议并跳过液氮闪光冻结步骤，使组织更容易受到解剖工具（如受损神经元（图3D）或肌肉纤维受损）的损伤（图3E）。液氮的应用有助于防止使用DLM组织时可能发生的组织损伤，而不管样本的基因型如何（图3C和3F）。
图1：在ALS的果蝇模型中逐步 去神经化DLM 突触。 （A） 在示意图中显示了ALS转基因苍蝇的生成，这种苍蝇表达一种人类突变形式的43 kDa（TDP-43）。（B） 插图描绘了成年果蝇中血小佛的形状 和方向。使用该协议，我们可以通过运动神经元与HRP（绿色）和肌肉组织与法罗酮（品红色）的结构染色，观察到DLM NMJ突触完整性的逐渐丧失。我们的模型描绘了通过生成成年苍蝇在ALS的成人模型中的突触完整性损失，该模型在运动神经元中表达人类TDP-43M337V 的突变体（图1F+u2012H）与WT（图1C+u201E）在肌肉纤维C型苍蝇中相比。 箭头突出显示 WT 突触 （图1C） 的示例和突触完整性损失的示例。放大倍率为 63 倍时刻度杆 ±20 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：使用成人NMJs的突触前标记评估突触完整性。在肌肉纤维C中14天大的WT苍蝇中，也可以使用前突触和后突触标记进行评估。前突触标记Synapsin（B），语法素（H），和布鲁奇飞行员 （BRP） （N） 与HRP（A，G，M）共同染色。A 染色描绘了这些标记的定位到前突触终端（C，I，O）。 O在较高的放大倍率下，图像更详细地说明了Synapsin（E）、语法（K）和 BRP（Q）与HRP （D、J和P）的本地化（图 F、L和R）。 我们还显示了一个后突克标记谷氨酸受体III （GluRIII） （T） 与HRP （ S ） 共同染色。共染色证明了这些标记的效用 （U）.在较高的放大率下，代表性图像分别将GluRIII（W） 和HRP （ V ） 的定位（X）分别对后突触性肌肉组织和前突触终端进行展示。面板 A+u2012C、G-I、M+u2012O、S=u2012U 的缩放条在 63 倍放大倍率下表示 20 μm。D+u2012F、2J-2L、2P-2R 和 2V-2X 的刻度杆表示 63 倍放大倍率下 10 μm。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：液氮对DLM解剖的效用。 为了证明液氮对DLM解剖的效用，我们展示了第21天WT苍蝇与肌肉纤维C中的不液氮的比较。使用液氮时，法罗酮 （B） 保持不变，不会损害 HRP 染色（A， C） 。没有液氮，肌肉组织变得细小，难以分块（E）和HRP染色（D，F）由于技术错误而受损。 白色箭头显示液氮（B） 和受损肌肉组织 （ E ） 中无肌肉损伤的区域。缩放杆 = 63 倍放大倍率时 20 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
使用本协议中描述的方法，我们为解剖 DLM 组织提供了一种简单的方法，并演示了如何通过成人果蝇结构染色和突触标记来评估突触完整性。使DLM组织更容易解剖的协议中的一个关键步骤是液氮的闪光冻结。如果没有这一步骤，组织就不那么牢固，更难以精确切割，如图3所示。该协议建立在以前的解剖方法，允许保持运动神经元和肌肉组织18，19，20，21，22，23。18,19,20,21,22,23该协议的一个限制是，当削减双节的中线时，可能很难得到两个干净的准备每个胸部。一种方法，以确保至少一个半轴每只苍蝇，你可以故意切断到一侧的胸，以获得一个干净的准备。通过这种修改，您可能还需要从切口中去除额外的多余的组织，以使用刀片断路器清理样品。对于这些新到这种技术，随着实践的继续，二分的精度将提高。
此处描述的方法使研究人员能够轻松地评估成人 DLM NMJ 在其整个生命周期中的任何时间的结构完整性。此协议的一个主要优点是能够通过使用突触标记在神经退行性疾病模型中访问突触完整性。我们演示，此应用程序可以帮助可视化总形态的变化与结构染色 （图1C+u2012H）.此外，突触完整性可以通过染色前突触标记进行评估，包括但不限于突触素28（图2A+u2012F），语法29（图2G+u2012L）和BRP30（图2M+u2012R）。关节后肌肉组织也可以评估使用谷氨酸受体III亚单位抗体31（图2S+u2012X），证明此协议的效用。
研究人员还可以利用这种解剖方法补充功能数据，全面检查与各种疾病相关的突触的结构完整性。这些突触还允许通过电生理记录32，33，34,33,和飞行分析10进行功能分析。该协议还可以为许多应用和测定提供轻松访问组织的机会。例如，未来的研究可以通过量化突触的密度和数量来,量化突触变化。虽然这里描述的协议专门检查运动神经元的突触完整性，但使用 TUNEL 染色35进行这种解剖，也可以执行评估肌肉细胞损失的补充协议。为了检查神经元损失，胸结36的解剖也可以与调谐染色一起使用。我们预计，这里描述的解剖将有更多的应用，在未来的研究评估与年龄相关的病理学以及神经退行性疾病。
Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院（R01 NS110727）对D.T..B。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32% Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Tissue preservation |
| Alexa Fluor 568 goat anti mouse | Fisher Scientific | A11031 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
| Alexa Fluor 568 goat anti rabbit | Fisher Scientific | A11036 | Labels primary antibodies. Used at 1:200 concentration. |
| anti- Bruchpilot (BRP) antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | NC82 | Stains the active zones in presynaptic neurons. Used at 1:25 concentration. |
| anti-GluRIII antibody | Gift from Aaron DiAntonio | N/A | Labels glutamate receptor subunits. Used at 1:1000 concentration. |
| anti-Synapsin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3C11 | Labels the synaptic protein synapsin. Used at 1:50 concentration. |
| anti-Syntaxin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 8C3 | labels the synaptic protein syntaxin. Used at 1:10 concentration. |
| BenchRocker | Genesee Scientific | 31-302 | Rotating samples during staining |
| Blade Breaker | Fine Science Tools | 10053-09 | Used for holding feather blade |
| cover slips | Fisher Scientific | 12548A | For mounting tissue |
| cryogenic gloves | VWR | 97008-198 | protect hands from liquid nitrogen |
| cryogenic tweezers | VWR | 82027-432 | Hold 2.0 mL tube in liquid nitrogen |
| dewar flask-1900 mL | Thomas Scientific | 5028M54 | Hold liquid nitrogen |
| Feather Blades | Electron Microscopy Sciences | 72002-01 | Scalpel Blades |
| Fine Forecps x 2 | Fine Science Tools | 11252-20 | One fine pair for Clearing midline of thorax. The other pair can be dulled using a sharpening stone. |
| FITC-conjugated anti HRP | Jackson Laboratories | 123-545-021 | Stains Motor Neurons. Used at 1:100 concentration |
| freezer box (Black) | Fisher Scientific | 14100F | Protects samples from light |
| glass pasteur pipettes | VWR | 14637-010 | Used to transfer samples |
| glass slides | Fisher Scientific | 12550143 | For mounting tissue |
| mounting media (vectashield) anti-fade | VWR | 101098-042 | Mounting media retains fluorescent signaling |
| nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Seals microscope slides |
| normal goat serum | Fisher Scientific | PCN5000 | Prevents non-specific binding of antibodies |
| paint brush | Genesee Scientific | 59-204 | Transferring flies |
| PBS | Fisher Scientific | 10-010-023 | Saline solution for dissecting and staining |
| Phalloidin 647 | Abcam | AB176759 | Stains F-Actin in muscle Tissue. Used at 1:1000 concentration |
| plastic petri dish (100 mm) | VWR | 25373-100 | Dissection dish |
| reinforcement labels | W.B. Mason | AVE05722 | Provides support for glass coverslip over the mounted tissue |
| sharpening block | Grainger | 1RDF5 | Keeping fine forceps sharp and also dulling separate pair |
| slide folder | VWR | 10126-326 | Sample storage |
| standard office scissors | W.B. Mason | ACM40618 | Cutting reinforcement labels |
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Coating for dissection dish |
| Triton-X-100 | Electron Microscopy Sciences | 22140 | Helps to permeabilize tissue |
| Vannas Disssection Sissors | Fine Science Tools | 1500-00 | Ued for removing fly legs and making an incision on thorax |
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