Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Promotor-Reporter, Live-Zell-Mikroskopie und individuelle Inklusionsextraktion in einem gerichteten vorwärts genetischen Ansatz, um Entwicklungsmutanten von Chlamydia trachomatiszu identifizieren und zu isolieren.

Zusammenfassung

Der intrazelluläre bakterielle Erreger Chlamydia trachomatis durchläuft einen Entwicklungszyklus, der aus zwei morphologisch diskreten Entwicklungsformen besteht. Der nicht-reproduzierende Elementarkörper (EB) initiiert eine Infektion des Wirts. Einmal im Inneren, unterscheidet sich der EB in den Retikulatkörper (RB). Die RB durchläuft dann mehrere Replikationsrunden, bevor sie sich wieder auf die infektiöse EB-Form unterscheidet. Dieser Zyklus ist für das Überleben der Chlamydien von entscheidender Bedeutung, da das Nichtumschalten des Wechsels zwischen Zelltypen eine Hostinvasion oder Replikation verhindert.

Einschränkungen in genetischen Techniken aufgrund der obligaten intrazellulären Natur von Chlamydien haben die Identifizierung der molekularen Mechanismen behindert, die an der Zelltypentwicklung beteiligt sind. Wir haben ein neuartiges Dual-Promoter-Reporter-Plasmidsystem entwickelt, das in Verbindung mit der Live-Zellmikroskopie die Visualisierung des Zelltypwechsels in Echtzeit ermöglicht. Um Gene zu identifizieren, die an der Regulierung der Zelltypentwicklung beteiligt sind, wurde das Live-Zell-Promotor-Reporter-System für die Entwicklung eines vorwärtsgenetischen Ansatzes genutzt, indem chemische Mutagenese des Dual-Reporter-Stamms, Bildgebung und Verfolgung von Chlamydien mit veränderter Entwicklungskinetik kombiniert wurden, gefolgt von klonaler Isolierung von Mutanten. Dieser vorwärtsgenetische Workflow ist ein flexibles Werkzeug, das für gezielte Verhöre in eine Vielzahl von genetischen Pfaden modifiziert werden kann.

Einleitung

Chlamydia trachomatis (Ctr) ist ein obligate intrazellulärer Erreger, der durch einen biphasischen Entwicklungszyklus fortschreitet, der für sein Überleben und seine Proliferation wesentlich ist¹. Dieser Zyklus besteht aus zwei Entwicklungsformen, dem Elementarkörper (EB) und dem Retikulatkörper (RB). Die EB ist Replikation inkompetent, aber vermittelt Zellinvasion durch Effektor induzierte Endozytose². Einmal im Host, reift der EB zum replizierenden RB. Die RB führt mehrere Replikationsrunden durch, bevor sie wieder in die EB konvertiert, um nachfolgende Infektionsrunden zu initiieren.

Die begrenzte Palette genetischer Werkzeuge hat den größten Teil der Chlamydienforschung auf biochemische Studien oder den Einsatz von Ersatzsystemen beschränkt. Infolgedessen war die Aufklärung der Genregulation und die Kontrolle des Entwicklungszyklus schwierig^3,4. Eine der wichtigeren Herausforderungen im Chlamydienfeld ist die hochauflösende zeitliche Verfolgung des Chlamydien-Entwicklungszyklus und die Identifizierung der Proteine, die an seiner Regulierung beteiligt sind. Die Genexpression während des Chlamydien-Entwicklungszyklus wurde traditionell mit destruktiven "Endpunkt"-Methoden wie RNAseq, qPCR und fester Zellmikroskopie^5,6durchgeführt. Obwohl diese Methoden unschätzbare Informationen geliefert haben, sind die angewandten Techniken mühsam und haben eine geringe zeitliche Auflösung^5,6.

Innerhalb des letzten Jahrzehnts hat die genetische Manipulation von Ctr mit der Einführung der Plasmidtransformation und Methoden zur Mutagenese^7,8,9Fortschritte gemacht. Für diese Studie wurde ein Plasmid-basiertes System entwickelt, um die Chlamydienentwicklung bei einzelnen Einschlüssen in Echtzeit im Verlauf einer Infektion zu überwachen. Es wurde ein Chlamydien-Transformant erstellt, das sowohl einen RB- als auch einen EB-Zell-spezifischen Promoter-Reporter ausdrückte. Der RB-spezifische Reporter wurde durch Dieminierung des Promotors des frühen RB-Gens euo vor dem fluoreszierenden Protein Clover konstruiert. EUO ist ein Transkriptionsregulator, der eine Teilmenge der späten EB-assoziierten Gene¹⁰unterdrückt. Der Promotor von hctB, der ein Histon-ähnliches Protein kodiert, das an der EB-Nukleoidkondensation beteiligt ist, wurde direkt vor mKate2 (RFP) geklont, um den EB-spezifischen Reporter¹¹zu erstellen. Das Rückgrat für hctBprom-mKate2/euoprom-Clover war p2TK2SW2⁷. Die hctB- und euo-Promotoren wurden aus der genomischen DNA von Ctr-L2 verstärkt. Jede Promotorsequenz bestand aus 100 Basenpaaren vor dem vorhergesagten Transkriptionsstartort für das angegebene Chlamydasid-Gen plus den ersten 30 Nukleotid (10 Aminosäuren) des jeweiligen ORF. Die fluoreszierenden FP-Varianten wurden kommerziell als Ctr-Codon-optimierte Genblöcke erhalten und im Rahmen mit den ersten 30 Nukleotiden jedes Chlamydengens und Promotors geklont. Der incD-Terminator wurde direkt flussabwärts von mKate2 geklont. Der zweite Promoter-Reporter wurde flussabwärts des IncD-Terminators eingesetzt. Das Ampicillinresistenzgen (bla) in p2TK2SW2 wurde durch das AadA-Gen (Spectinomycin-Resistenz) von pBam4 ersetzt. Dies führte zum endgültigen Konstrukt p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Abbildung 1A), das in Ctr-L2⁷umgewandelt wurde. Dieser RB/EB-Reporterstamm ermöglichte die Beobachtung des Entwicklungszyklus innerhalb einzelner Einschlüsse mittels Live-Zellmikroskopie (Abbildung 1B,C).

Unter Verwendung unseres Promoter-Reporter-Konstrukts in Kombination mit chemischer Mutagenese wurde ein Protokoll entwickelt, um einzelne Klone zu verfolgen und zu isolieren, die Entwicklungsanomalien aus mutagenisierten Populationen von Ctr serovar L2 aufwiesen. Dieses Protokoll ermöglicht die direkte Überwachung einzelner Chlamydieneinschlüsse, die Verfolgung der Genexpressionsprofile im Laufe der Zeit, die Identifizierung von Chlamydienklonen, die ein verändertes Entwicklungsgenexpressionsmuster exprimieren, und die klonale Isolierung von Chlamydien von einzelnen Einschlüssen.

Obwohl dieses Protokoll speziell für die Identifizierung von Genen erstellt wurde, die an der Entwicklung von Chlamyden beteiligt sind, könnte es leicht angepasst werden, um eine beliebige Anzahl von Chlamydien-Genwegen zu hinterfragen.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll verwendeten Python-Skripte sind auf Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Mutagenize Reporter Chlamydia

HINWEIS: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs wurden direkt mit Ethylmethansulfonat (EMS) in den axtischen Medien CIP-1 mutagenisiert, da dieses Medium den EB-Stoffwechsel und die Aufrechterhaltung der EB-Infektion¹²unterstützt.

1. Einen Chlamydienstock auf Eis auftauen, der 3 x 10⁷ EBs enthält, die mit dem p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover Reporter Plasmid und Pellet bei >14.000 x g für 30 min bei 4 °C umgewandelt werden.
   HINWEIS: Chlamydienorganismen, die für diese Experimente verwendet wurden, wurden 30 % Renografindichte gereinigt und bei -80 °C in 1x Saccharose-Phosphat-Glutamatpuffer (SPG) eingefroren.
2. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das EB-Pellet in 100 l CIP-1-Puffer mit Beschallung auf Eis bei 10 % Leistung für 10 s wieder aus. Teilen Sie die 100 l EB-Suspension in zwei 50-L-Aliquots für mutagenisierte und mock behandelte Proben auf.
3. Bereiten Sie 20 mg/ml EMS-CIP-1-Lösung in einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr vor. Fügen Sie dazu 6,8 L EMS in 375 L Gesamtvolumen hinzu.
4. Fügen Sie 50 L der EMS-CIP-1-Lösung in einen der Chlamydien-Aliquots für Mutagenese und 50 l CIP-1 nur dem anderen Chlamydien-Aliquot für Mock-Mutagenese hinzu.
   HINWEIS: Die endgültige EMS-Konzentration beträgt 10 mg/ml. Der Chlamydier-Titer, die EMS-Konzentration und der in diesem Protokoll verwendete Zeitpunkt der Exposition führen zu einer etwa 60-80% Reduktion der infektiösen Nachkommen. Dieser Reduktionsgrad entspricht 5-20 DNA-Läsionen pro Chlamydiengenom⁸.
5. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die mutagenisierten EBs werden in Abschnitt 2 direkt zur Infektion von Monolayern eingesetzt.
   VORSICHT: EMS ist ein bekanntes Karzinogen. Alle Geräte und Materialien, die mit EMS in Berührung kommen, müssen vor der Entsorgung in 1 M NaOH für 24 h eingeweicht werden, Handschuhe sollten während des Protokolls und der Reinigung von EMS-Materialien jederzeit verwendet werden.

2. Bildgebung des mutierten Ctr

1. Wirtszellkultur zur Bildgebung und Isolierung von mutagenisiertem Ctr
   1. Säen Sie eine 6 Well Glas Bodenplatte mit 6 x 10⁵ Cos-7 Zellen (ATCC) pro Brunnen in 2 ml komplette Medien (RPMI-1640 ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 10 mg/ml Gentamicin). Verwenden Sie diese Glasbodenplatte für die Abbildung von mutagenisiertem Ctr.
   2. Säen Sie eine 24 Brunnen Polystyrolplatte mit 1 x 10⁵ Cos-7 Zellen (ATCC) pro Brunnen in 1 ml Komplettmedium. Verwenden Sie diese Polystyrolplatte zur Erneutinfektion isolierter Chlamydien von Interesse.
   3. Inkubieren Sie beide Platten bei 5%_CO2, 37 °C für ca. 18 h. Sobald die Zellen die Koninfluenza erreichen, ersetzen Sie das Medium durch vollständige Medien, die durch 1 g/ml Cycloheximid ergänzt werden, und inkubieren Sie sie über Nacht.
2. Infizieren der Wirtszellkultur mit mutagenisiertem Ctr
   1. Infizieren Sie 5 Brunnen der Glasbodenplatte mit 6 x 10⁵ Mutagenisierten EBs in 1,5 ml/gut eiskalten HBSS. Dies wird zu einem MOI von 0,3 führen, da aufgrund der Mutagenese mit einer Sterblichkeitsrate von 70 % gerechnet wird.
   2. Infizieren Sie den Rest gut mit 2 x 10⁵ Mock-Mutagenisierten EBs in 1,5 ml/gut eiskalten HBSS. Ohne Mutagenese erwarten Sie weniger Sterblichkeit, so dass ein Drittel des Inokulums verwendet wird, um den MOI von 0,3 € zu erreichen.
      HINWEIS: Der MOI von 0,3 stellt sicher, dass Wirtszellen von einem einzigen EB infiziert werden, und ermöglicht eine ausreichende Trennung zwischen infizierten Zellen für die klonale Isolierung.
   3. Inkubieren Sie die Platte für 15 min, mit Schaukeln, bei 37 °C.
   4. Waschen Sie die infizierten Wirtszellen mit vorgewärmten (37 °C) HBSS, die 1 mg/ml Heparin enthalten, gefolgt von einer HBSS-Spülung. Heparinwaschen wiederholen und sofort 2x mit HBSS abspülen, um sicherzustellen, dass das Heparin entfernt wird.
      HINWEIS: Heparin hemmt und kann die frühen elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen der Wirtszelle und EBs¹³umkehren. Die Heparin-Wähfe entfernen EBs, die noch nicht in die Wirtszellen gelangen, und synchronisieren die Infektion. Beim Waschen von Zellen tun dies sanft, um zu verhindern, dass die Zellen von der Oberfläche der Brunnen entfernt werden. HBSS- und Heparin-Lösungen enthalten Rest-EMS und sollten vor der Entsorgung in einem Becher mit 1 M NaOH für 24 h platziert werden.
   5. Ersetzen Sie HBSS durch 4 ml/Well aus vorgewärmten (37 °C) Bildmedien (komplette Medien, 1 g/ml Cycloheximid, 20 mM HEPES und ohne Phenolrot).
   6. Füllen Sie die Zwischenräume mit vorgewärmten (37 °C) deionisierten_H2O, um die Temperaturregelung zu unterstützen und die Verdunstung zu reduzieren. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C Inkubator mit 5%_CO2 für 10 h.
3. Mikroskopaufbau und Bildgebung
   HINWEIS: Multicolor Multiposition automatisierte Live-Zell-Fluoreszenz-Bildgebung wird verwendet, um Zeitrafferbilder zu sammeln, um Chlamydienmutanten zu identifizieren, die sich in der Entwicklungsgenexpressionsdynamik unterscheiden. Dieses Protokoll nutzt das Open-Source-Softwarepaket "Manager" für die automatisierte Mikroskopsteuerung¹⁴.
   1. Beginnen Sie das Mikroskop-Setup 10 h nach der Infektion. Stellen Sie den Mikroskop-Stufen-Inkubator auf 5%_CO2, 37 °C. Legen Sie die infizierte 6 Well Glasbodenplatte in den Bühneninkubator und legen Sie den Probenthermistor in das Interwell H₂O ein.
   2. Kalibrieren Sie die XY-Stufe mit dem High Content Screening (HCS) Plugin. Klicken Sie auf Plugins | Akquisitionstools | HCS Site Generator in der Mikroskopsteuerungssoftware "Manager"(JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
   3. Wählen Sie die 6-Well-Plattenvorlage und generieren Sie eine Bildpositionsliste bestehend aus 12 Sichtfeldern (FOV) pro Well innerhalb des HCS-Plugins (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Öffnen Sie die Stage Position List und fokussieren Sie sie manuell und legen Sie die Erste-Z-Position für jeden FOV mithilfe des Stage Control Plugins (JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6) fest. Passen Sie die XY-Koordinaten aller FOV an, die fehlende Zellen haben oder keine einheitliche Monoschicht enthalten.
      HINWEIS: Aufgrund der Zeit, die für die Aufnahme jedes Bildes benötigt wird, kann eine maximale Anzahl von 72 FOV pro 30 min Intervall aufgenommen werden.
   4. Verwenden Sie eine 20-fache Objektivlinse für die Bildgebung. Mit dieser Vergrößerung können pro FOV 8 Einschlüsse abgebildet werden, während gleichzeitig die gewünschte Auflösung zur Verfügung steht.
   5. Speichern Sie die Positionsliste, da diese verwendet wird, um die Inklussiznachlungen nach der Datenanalyse (JoVE61365_screenfile7) zu finden.
   6. Verwenden Sie die Autofokus-Option in der Imaging-Software, um den Fokus für die automatisierte Bildgebung (JoVE61365_screenfile8) festzulegen.
   7. Verwenden Sie die folgenden Auswahlen und Werte, um die konsistentesten Fokusergebnisse mithilfe des bildbasierten Autofokus in der Funktion "Manager" zu erzielen. Wählen Sie im Fenster Autofokus-Eigenschaften OughtaFocus aus dem Dropdown-Menü aus und verwenden Sie die folgenden Einstellungen. OughtaFocus-SearchRange_m: 350, OughtaFocus-Tolerance_'m: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Yes, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Channel: DIC.
      HINWEIS: Das Reduzieren des Autofokus-Bildfensters durch Verringern des Erntefaktors ermöglicht eine konsistentere automatische Fokussierung. Wenn Sie Ja für OughtaFocus-ShowImages auswählen, kann der Benutzer das Autofokusbild anzeigen.
   8. Erfassen Sie die Kinetik des Entwicklungszyklus durch Bildgebung für 24 h mit 30 min Zeitintervallen (JoVE61365_screenfile9). Die Bildgebung zwischen 12-36 HPI stellt sicher, dass Chlamydien den Entwicklungszyklus abschließt, aber die Wirtszelle nicht lysiert.
   9. Stellen Sie die Zellmonolayer mit einer Exposition von 250 ms bei 4% bzw. 18% Intensität im GFP- bzw. RFP-Kanal (JoVE61365_screenfile10) ab. Erkennen Sie das Clover(GFP)-Signal durch Anregung bei 470 nm mit einem 514/30 nm Bandpass-Emissionsfilter. Erkennen Sie das mKate2 (RFP) Signal durch Anregung bei 595 nm und mit einem 641/75 nm Bandpass-Emissionsfilter.
      HINWEIS: Die Minimierung der Anregungsintensität ist entscheidend für die Minimierung der Fluorophor-Photobleichmittel und phototoxizität für Chlamydien. Die minimale Anregungsintensität zur Erzeugung eines gelösten Bildes mit einer Exposition von 200-300 ms sollte empirisch in Pilotstudien ermittelt werden.
   10. Erfassen Sie mehrere Z-Slices mit einem Fokusbereich, der auf beiden Seiten des Fokusbereichs endet. In diesem Experiment wurde dies bei 20-facher Vergrößerung mit 4 Scheiben bei 10 m Schritten (JoVE61365_screenfile11 )erreicht.
   11. Wählen Sie Relative Z für die Abbildung mehrerer Slices im Erfassungsfenster aus. Die Option Relative Z verwendet die in der Abbildungspositionsliste gespeicherte Position der Z-Ebene als Ausgangspunkt für das nächste Zeitintervall. Geben Sie die entsprechenden Z-Offset-Werte für Fluoreszenz-Bildgebungskanäle (JoVE61365_screenfile12) ein.
       HINWEIS: Das bildbasierte Fokussiersystem ist unvollkommen und führt über einen 24-Stunden-Bildzeitraum zu Fokusdrift. Es wurde festgestellt, dass durch die Erfassung von 3-4 Z Brennebenen für jeden Zeitpunkt ein Fokusbild beibehalten wurde. Z-Offset wird benötigt, um die Unterschiede in den Brennebenen zwischen den fluoreszierenden Bildkanälen und dem DIC-Kanal zu korrigieren. Eine empirische Bestimmung dieses Z-Offsets wird erforderlich sein.
   12. Speichern Sie Bilder, indem Sie das Stammverzeichnis auswählen und das Experiment benennen. Verwenden Sie die Option "Manager-Image-Stack-Datei", um Bilder als tiff-Stack-Dateien (JoVE61365_screenfile13) zu speichern.
   13. Zeichnen Sie die experimentellen Details im Feld Akquisitionskommentare im Fenster Multi-D-Erfassung (JoVE61365_screenfile13) auf. d.h., Gut A1: Unbehandelte Kontrolle. Nun A2-3 und B1-3: EMS Mutanten. Bildgebung: 12-36HPI. Starten Sie die Bildaufnahme mit 12 HPI.
       ANMERKUNG: Wenn Sie den Manager verwenden, lassen Sie das Programm, den Versuchsaufbau und die Mikroskophardware nach Abschluss des Experiments laufen. Die Bildgebungsstellen werden nach Abschluss der Analyse der mutagenisierten Population zur Isolierung der Inklusion überprüft.

3. Identifizieren und Isolieren mutagenisierter Chlamydien mit veränderten Entwicklungsphänotypen

1. Erstellen eines in-Fokus-Bildstapels
   1. Extrahieren Sie das fokussantesten Bild aus den Z-Stacks mit den gespeicherten Bilddaten, die 4 Z-Slices pro Zeitpunkt enthalten. Verwenden Sie die Messoption kurtosis (Analysieren | MessenSie ) in ImageJ/FIJI, um automatisch das fokussierte Z-Slice (höchste Kurtose-Punktzahl) zu identifizieren und einen neuen Bildstapel mit nur diesen in-Fokus-Bildern zu erstellen. Ein Python-Skript ist als zusätzliche Datei (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) enthalten, um diesen Prozess zu automatisieren.
2. Fluoreszenzexpression in einzelnen Einschlüssen quantifizieren
   HINWEIS: Um die ExpressionSkinetik der beiden Reporter zu quantifizieren, verwenden Sie die Open-Source-Bildanalyse-Anwendung ImageJ/FIJI und das Plugin Trackmate¹⁵. Trackmate identifiziert 'Spots' (in diesem Fall den Einschlüssen) und verfolgt sie durch einen Zeitraffer-Bildstapel, der die X,Y-Position und Signalintensität für jede Einschlussung im Zeitverlauf aufzeichnet (JoVE61365_screenfile14). Diese Informationen werden als CSV-Datei gespeichert und zur Analyse in ein benutzerdefiniertes Python-Notizbuch importiert.
   1. Öffnen Sie den in-fokus Z-reduzierten Bildstapel in ImageJ/FIJI mit Bio-Formatimport, indem Sie auf Plugins klicken | Bio-Formate | Bioformate Importeur. Wählen Sie Hyperstack und Composite (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
   2. Subtrahieren Sie den Bildhintergrund, indem Sie auf Prozess | Hintergrund mit einem Rolling-Ball-Radius von 50,0 Pixel subtrahieren und den Bildkontrast bei gesättigten Pixeln auf 0,3 % erhöhen (Prozess | Kontrast verbessern). Multiplizieren Sie die Bildwerte mit 10,0 (Prozess | Mathe | Multiplizieren) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
   3. In Trackmate (Plugins | Tracking | Trackmate), wählen Sie einen geschätzten Blobdurchmesser von 48 Pixeln (empirisch bestimmt basierend auf der Größe der Aufnahme am Ende der Bildgebung). Erzeugen Sie nicht fragmentierte Einschlussspuren, indem Sie einen Linking max Distance und Gap-closing max distance von 8.0 Pixel und Gap-closing max frame gap von 1 ( JoVE61365_screenfile23 -JoVE61365_screenfile25) auswählen.
      HINWEIS: Um Trackmates Fähigkeit zu verbessern, Einschlüsse über den gesamten Zyklus zu identifizieren und zu verfolgen, wird ein separater Bildkanal erstellt, indem die euoprom- und hctB-Prom-Kanälemithilfe der Bildmathematikfunktion in ImageJ/FIJI hinzugefügt werden. Dieser Kanal wird dann von Trackmate verwendet, um Einschlüsse im Laufe der Zeit zu identifizieren und zu verfolgen. Die Fluoreszenzwerte der Euo-Prom-und hctB-Prom-Kanälewerden dann in den Kanälen 2 und 3 aufgezeichnet.
   4. Aufzeichnungsspuren, die eine minimale Dauer erfüllen: Dauer der Strecke: 20 (JoVE61365_screenfile26). Analysieren Sie die Spuren und speichern Sie die Spots in der Spurstatistik als CSV-Datei (JoVE61365_screenfile27).
      HINWEIS: Dieser Prozess wurde mithilfe eines benutzerdefinierten Python-Skripts automatisiert, das in den zusätzlichen Daten (TrackMate_Zreduced_JOVE.py) bereitgestellt wird.
3. Identifizieren von Inklusionsspuren mit veränderten Entwicklungsprofilen
   ANMERKUNG: Um Einschlüsse zu identifizieren, die Chlamydia mit geänderten Entwicklungsprofilen wurde jede Einschlussspur mit dem Python-Notebook visualisiert. Diese Visualisierungen ermöglichen die Identifizierung von Einschlüssen mit kinetischen Genexpressionsprofilen, die sich von der mit Mock behandelten Population unterschieden. Das Python-Notebook zur Identifizierung von Einschlüssen mit veränderter Entwicklungsprogrammierung ist in den Zusatzdaten (EMS_Screen-Markdown).
   1. Importieren Sie die Einschlussspurdaten aus den Daten der Spots in Tracks-Statistiken CSV-Dateien in Pandas-Datenrahmen mithilfe der Importzelle im EMS_Screen-Markdown Python-Notebook.
   2. Baseline korrigieren jede Spur, indem der Mindestwert jeder Spur vom Rest der Spurwerte mithilfe der Basissubtrahierungszellen subtrahiert wird. Speichern Sie die resultierenden Werte als Beizdatei mit der Zelle Speichern als Pickle. Dadurch werden die Kanalwerte nach der Basisbasissubtraktion dauerhaft für den späteren Abruf gespeichert.
      HINWEIS: Die Baseline-Subtraktion legt die Anfangsfluoreszenzintensität jeder Einschlussung auf Null fest.
   3. Beseitigen Sie Spuren von Einschlüssen in der Nähe der Ränder des FOV mithilfe der Zelle Filterkanten, da ihre Fluoreszenzprofile möglicherweise nicht vollständig erfasst werden. diese Spuren können falsch positive Entwicklungsprofile erzeugen.
   4. Kalibrieren Sie die Framewerte (totalFrames) aus den Bildslices auf die Zeitwerte(startTime, Intervall) mit der Zeitrafferkalibrierungszelle unter Verwendung der experimentellen Startzeit und des Bildzeitintervalls. Schließen Sie partielle Einschlusslesungen aus, indem Sie Ablaufverfolgungen herausfiltern, die sich nicht über die letzten 20 h des Experiments (16-36 HPI) mit der Zelle Spurdauerfilter erstrecken.
   5. Trennen Sie Spuren in einzelne Datenrahmen durch experimentelle Bedingung mit der Assign Treatment Zelle. Filter für Einschlüsse, die ein ausreichendes Wachstum aufweisen, mit der Zelle Filter for Growth. Legen Sie in der Zelle Filter für Wachstum empirisch den Fluoreszenzintensitätsschwellenwert für den Euo-Prom-Kanal fest, indem Sie die Werte innerhalb der letzten beiden Codezeilen ändern. euo Dadurch wird Chlamydien herausgefiltert, die nicht gewachsen sind.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Festlegen von Schwellenwertfiltern, wenn der Filter zu niedrig ist, werden die resultierenden Streudiagramme laut sein, aber wenn die Filterung eingestellt ist, können zu hohe Mutanten eliminiert werden.
   6. Berechnen Sie die prozentuale Sterblichkeit, die durch EMS verursacht wird, indem Sie die Anzahl der mutagenisierten Spuren/gut durch die Anzahl der mit Mockbehandelten Tracks/Well behandelten Spuren dividieren. Multiplizieren Sie die Anzahl der mit Mock behandelten Spuren mit dem anfänglichen Verdünnungsfaktor 3, um die Anzahl der mit Mockbehandelten Spuren/Well zu berechnen. Verwenden Sie die Zellen "Einschlusse zählen" und "Prozentuale Sterblichkeit berechnen", um diese Aufgabe auszuführen.
   7. Berechnen Sie die Zeit bis zur Halbzeitmaximalexpression für frühe und späte Reporter für jede Spur mithilfe der Zelle Berechnen. Diese Werte werden verwendet, um mutagenisierte und verspottete Populationen zu vergleichen, um Entwicklungsmutanten zu identifizieren.
   8. Verwenden Sie innerhalb der Zelle Half-Max Plot das Bokeh-Plotting-Paket, um die Zeit bis zum halbmaximalen Ausdruck jedes Promotors zu visualisieren, indem Sie die Euo-Prom-Zeit auf den halbmaximalen Ausdruck mit dem von euo hctBprom grafisch darstellen. Identifizieren Sie Einschlüsse aus der mutierten Population, die außerhalb der mit Mock behandelten Streuwolke liegen, mithilfe des interaktiven Track-ID-Explorers bokeh. Notieren Sie sich die FOV- und XY-Koordinaten der Inklusigungseinschlüsse (Abbildung 2).
      HINWEIS: Wählen Sie Kandidateneinschlüsse, die visuell außerhalb der Kontrollwolke liegen, als Überprüfung und statistische Auswertung jedes Klons werden anschließend durchgeführt.
   9. Innerhalb der Animierten Plotzelle visualisieren Sie Änderungen in der Promotorexpression-Kinetik dynamisch im Laufe der Zeit, indem Sie die Expressionsintensitäten von EuoProm mit dem Plotwerkzeug Plotly¹⁶gegen hctBprom grafisch darstellen. Die Streufunktion von Plotly wird verwendet, um die Genexpression im Laufe der Zeit zu animieren (Video 1).
   10. Visualisieren Sie einen Schnappschuss aus dem Plotly animierten Diagramm in der Inclusion Locator-Zelle, indem Sie den Euo-Prom-und hctB-Prom-Ausdruckzu einem bestimmten Zeitpunkt (d. h. 28 HPI) mit dem Bokeh-Paket(Abbildung 3) darstellen. Identifizieren Sie Einschlüsse aus der mutierten Population, wie in Schritt 3.3.8 beschrieben.
       HINWEIS: Diese Analyse muss schnell durchgeführt werden (<4 h), da die Einschlüsse immer noch expandieren und nach der Infektion beginnen, Wirtszellen zu lysieren.
4. Isolieren von Entwicklungsmutanten von Inklusonen von Interesse
   HINWEIS: Um Chlamydien von den Einschlüssen zu isolieren, die entschlossen waren, eine veränderte Genregulation anzuzeigen, wurde ein Mikromanipulator mit Kapillarnadeln eingesetzt. Die Well-ID-, FOV- und X-Y-Koordinaten der ins Interesse sind den Einschlüssen wurden anhand der Datenvisualisierung in Abschnitt 3.3 ermittelt.
   1. Bereiten Sie Kapillarnadeln vor, indem Sie die Mitte des Kapillarrohres in einer Flamme halten und beide Enden des Kapillarrohres ziehen, bis es sich getrennt hat. Erstellen Sie eine Öffnung in der gezogenen Kapillarnadel, indem Sie die gezogene Spitze auf einem Mikroskopschlitten brechen. Um die Nadel zu brechen, legen Sie die geschlossene Spitze in einem Winkel auf den mattierten Teil des Mikroskopschlittens und setzen Sie Druck auf.
      HINWEIS: Die Spezifikationen für Kapillarrohre waren 1,0 mm O.D., 0,5 mm I.D.
   2. Prüfen Sie, ob die Nadelöffnung ungefähr die Größe eines Einschlusses unter dem Mikroskop ist, 20x Objektiv.
   3. Prepull 25-30 Kapillarnadeln für die Isolierung von Kandidateneinschlüssen (eine Nadel pro Einschluss).
   4. Füllen Sie den Mikroinjektor mit Mineralöl, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
   5. Befestigen Sie eine Glaskapillarnadel am Mikroinjektor und vertreiben Sie Öl an der Spitze der Nadel, wodurch Luftblasen ausgehoben werden. Legen Sie die Kapillarnadel in komplette Medien und zeichnen Sie Medien auf halbem Weg nach oben. Das Füllen der Kapillarnadel mit Medien verhindert eine Ölkontamination im Brunnen.
   6. Migrieren Sie mit der gespeicherten Positionsliste in 'Manager aus Schritt 2.3.5 zum Brunnen und FOV einer im Python-Visualisierungsnotizbuch identifizierten Einbeziehung von Interesse.
   7. Verwenden Sie den Joystick des Mikromanipulators, um die Kapillarnadel auf die XY-Koordinaten der Einbeziehung von Interesse zu lokalisieren.
   8. Verwenden Sie den 595 nm Anregungskanal, um EBs für die Extraktion und den Phase/DIC-Weißlichtkanal für die Nadelvisualisierung zu visualisieren. Manövrieren Sie die Kapillarnadel zur Aufnahme, brechen Sie die Aufnahme und ziehen Sie dann die EBs mit dem Mikroinjektor in die Kapillarnadel.
   9. Die EBs aus der Kapillarnadel in einen einzigen Brunnen der in Schritt 2.1.2 hergestellten 24 Brunnenpolystyrolplatte austreiben. Entfernen Sie die Kapillarnadel und ersetzen Sie sie durch eine frische Kapillarnadel für die nächste Aufnahmeextraktion. Wiederholen Sie Abschnitt 3.4 für alle Kandidateneinschlüsse.
      ANMERKUNG: Zur Erweiterung und zur Sicherstellung eines ausreichend hohen Titers für die Re-Imaging, inkubieren Mutantenisolate in einem 5%_CO2,37 °C Inkubator, bis die Mehrheit der Wirtszellen infiziert sind (ca. 1 Woche). Brunnen sollten genau überwacht werden, da verschiedene Isolate unterschiedliche Wachstumsraten aufweisen können.
5. Erntemutanten isolates
   1. Auf Eis die infizierte Monoschicht durch Kratzen mit einer 1 ml Mikropipette-Spitze stören. Übertragen Sie die Medien, Zellablagerungen und freigesetzten Chlamydien in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
   2. Pellet Chlamydien durch Zentrifugation für 30 min bei 4 °C, >14.000 x g. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 75 l eiskaltem 1x SPG wieder auf. Aliquot in drei 1,5 ml Schraubkappen-Mikrozentrifugenrohre. Bei -80 °C lagern.

4. Überprüfung mutierter Isolate-Phänotypen

1. Wirtszellkultur für bildgebende mutagenisierte Isolate
   1. Säen Sie eine 96 Well Glasbodenplatte mit 1,6 x 10⁴ Cos-7 Zellen (ATCC) pro Brunnen in 100 l Komplettmedien. Inkubieren Sie bei 5%_CO2, 37 °C. Die Zellen sollten die Konfluenz in etwa 24 h erreichen. Nachdem die Zellen konfluent sind, ersetzen Sie die Medien durch vollständige Medien, die durch 1 g/ml Cycloheximid ergänzt werden, über Nacht inkubieren.
2. Infizieren Sie Zellen mit Kandidatenisolaten für die phänotypische Verifizierung
   1. Taumutierte Klone und Wildtyp Chlamydien auf Eis.
   2. Führen Sie in der vorbereiteten 96-Well-Platte eine zweifache serielle Verdünnung von Mutantenisolaten mit einer Spalte pro Isolat (11 Spalten) durch. Beginnen Sie mit einer anfänglichen Verdünnung von 1:20 in 100 l HBSS.
      HINWEIS: Die serielle Verdünnung von Chlamydien wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass mutierte Proben an einem MOI < 1 abgebildet werden.
   3. Infizieren Sie die verbleibende (12.) Säule mit dem Wildtyp Chlamydia bei MOI 0,5.
      HINWEIS: Wildtype Chlamydien werden als Kontrollfürst für den Vergleich mit mutagenisierten Isolaten verwendet.
   4. 15 min Schaukeln bei 37 °C inkubieren.
   5. Waschen Sie infizierte Wirtszellen mit vorgewärmten (37 °C) HBSS mit 1 mg/ml Heparin und HBSS gemäß Abschnitt 2.2.
   6. Ersetzen Sie dies durch 200 l pro Bohrung des vorgewärmten (37 °C) Bildmediens.
   7. Füllen Sie die Zwischenräume mit vorgewärmten (37 °C) deionisierten H₂O.
   8. Bei 5%_CO2, 37 °C für 10 h inkubieren.
3. Mikroskop-Setup
   HINWEIS: Siehe Abschnitt 2.3 für die Einrichtung des Mikroskops, dieser Abschnitt enthält nur die erforderlichen Setup-Änderungen.
   1. Wählen Sie die 96 Well Plate Vorlage aus dem HCS Plugin.
   2. Empirisch bestimmen Brunnen, die einem MOI < 1 für jedes mutante Isolat entsprechen. Der Clover-Ausdruck unter Kontrolle des Euo-Promotors ist bei 10 PSI zu beobachten, was eine frühzeitige Visualisierung von Einschlüssen ermöglicht (Abbildung 1B).
   3. Wählen Sie drei Bohrungen pro Mutantenisolat, die einem MOI < 1 entsprechen, und erstellen Sie eine bildgebende Positionsliste, die aus zwei FOV pro Bohrgut besteht.
      HINWEIS: Aufgrund von Hardwareeinschränkungen können pro Zeitintervall nur 72 Bilder aufgenommen werden, was drei Verdünnungen (Bohrungen) pro Dehnung entspricht, die zwei Bildstellen pro Well verwenden, wenn 12 Samples abgebildet werden.
   4. Zeichnen Sie den Entwicklungszyklus jedes mutierten Isolats für 36 h in 30 min Zeitintervallen ab 12 HPI auf.
   5. Zeichnen Sie die experimentellen Details im Feld Akquisitionenkommentare auf. d.h. nun ABC1: Wildtypkontrolle. Nun ABC2: Mutant Stamm 1, ABC3: Mutant Stamm 2, etc... Bildgebung: 12-48 HPI.
   6. Starten Sie die Bildaufnahme mit 12 HPI.

5. Datenanalyse zur Isolatüberprüfung

1. Erstellen von Fokusbildstapeln und Quantifizierung der Fluoreszenzexpression in einzelnen Einschlüssen
   1. Generieren Sie fluoreszierende Intensitätsspuren für jede Einschlussaufnahme gemäß Abschnitt 3.1 - 3.2.
2. Überprüfen Sie Ctr mutagenisierte Isolate
   HINWEIS: Um die geänderten Entwicklungsprofile von Mutantenisolaten zu überprüfen, werden ihre Ausdrucksprofile mit dem Wildtype-Ausdrucksprofil mit dem Python-Notebook verglichen. Das Python-Notebook, das zur Überprüfung von mutierten Klonen mit veränderter Entwicklungsprogrammierung verwendet wird, ist in den zusätzlichen Daten (clone_check-Markdown )enthalten.
   1. Importieren und filtern Sie die Einschlussablaufverfolgungsdaten im clone_check-Markdown-Python-Notizbuch wie in Abschnitt 3.3.
   2. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung (STD) von den Spuren jeder Isolat- und Wildtype-Kontrollpopulation mithilfe der Zelle Mittelwert berechnen und STD.
   3. Mit dem Diagramm Der Graph Iso vs WT-Zellenplot der Mittelwert und Standardfehler des Mittelwerts (SEM) jedes mutierten Klons gegen das Wildtyp-Steuerelement, um zu bestimmen, ob die mutierte Expressionskinetik von der Wildtypprobe abweicht ( Abbildung4).
   4. Bestimmen Sie, ob die isolierte mutierte Population klonal ist, indem Sie die mutierten Spuren darstellen und sie mit Wildtyp-Einschlussspuren vergleichen, indem Sie ein Streudiagramm verwenden, wie in Abschnitt 3.3 (Schritte 3.3.7-3.3.10) (Abbildung 2, Abbildung 3). Wenn es sich bei dem Isolat um eine gemischte Population handelt, zeigt das Diagramm eine Population, die mit Wildtyp überlagert wird, und eine zweite unterschiedliche Population außerhalb der Wildtype-Streuwolke. Wenn die Population gemischt aussieht, kann die Mutante mit dem ursprünglichen Verfahren, das in Abschnitt 3.4 beschrieben wird, wieder isoliert werden.
      ANMERKUNG: Um festzustellen, ob sich das Entwicklungsprofil eines Isolats statistisch vom Wildtyp unterscheidet, sollten die Kurven für jedes Isolat mit dem Wildtyp mit ANOVA verglichen werden.

Ergebnisse

Die direkte EMS-Mutagenese unseres Promotor-Reporters-Chlamydienstamms führte zu einer Verringerung der Infektiosität um 75 %. Mit Hilfe des beschriebenen Live-Zell-Bildgebungsprotokolls wurden 600 Einschlüsse über einen Zeitraum von 24 h abgebildet und nachverfolgt. Die fluoreszierende Ausdruckskinetik beider Reporter in jeder Einschlussaufnahme wurde mithilfe benutzerdefinierter Python-Notebook-Skripte visualisiert. Zwei Visualisierungsansätze wurden implementiert, um kandidaten mutagenisierte Chlamydien für d...

Diskussion

Die Zersebung der Mechanismen, die den Chlamydien-Entwicklungszyklus steuern, wurde durch die Einschränkungen der derzeit verfügbaren genetischen Werkzeuge behindert. Mit unserem Promoter-Reporter Chlamydia in Verbindung mit der automatisierten Live-Zell-Mikroskopie wurde ein System entwickelt, das die Überwachung der Zelltypentwicklung bei einzelnen Einschlüssen über einen Zeitraum von 24 stunden ermöglicht. Dieses System hat in Kombination mit chemischer Mutagenese und direkter Inklusionsisolierung eine Method...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24-Well-Polystyrolplatten	Corning	3524	Zellkulturwachstum für die Reinfektion von Isolaten
6-Well-Glasbodenplatten	Cellvis	P06-1.5H-N	Zellkulturwachstum für die Bildgebung
96-Well-Glasbodenplatten	Nunc	165305	Zellkulturwachstum für die Bildgebung
Bold line CO2-Einheit	OKO Labs	CO2-Einheit BL	Tischinkubator CO2-Kontrolle
Bold line T Unit	OKO Labs	H301-T-UNIT-BL-PLUS	Stage Inkubator Temperaturregelung
Kapillarrohre aus Borosilikatglas	Sutter Instrument	B1005010	Kapillarrohre
BrightLine Bandpass-Emissionsfilter (514/30nm)	Semrock	FF01-514/30-25	Fluoeszierender Filterwürfel
BrightLine Bandpass-Emissionsfilter (641/75nm)	Semrock	FF02-641/ 75-25	Fluoeszierender Filterwürfel
CellTram Vario		Eppendorf 5196000030	Microinjector
Chlamydia trachmatis serovar L2	ATCC	VR-577	Chlamydia trachomatis
CIP-1 media	Hauseigene	NA	Axenic Medien. IPB ergänzt mit 1% FBS, 25 μ M-Aminosäuren, 0,5 mM G6P, 1,0 mM ATP, 0,5 mM DTT und 50 μ M GTP, UTP und CTP. (Omsland, A. 2012) im eigenen Haus hergestellt.
Cos-7-Zellen (ATCC)	ATCC	CRL-1651	Afrikanische grüne Affennierenzelle (Wirtszellen)
Cycloheximid	MP Biomedicals	194527	Wachstumshemmer der Wirtszellen
Ethylmethansulfonat, 99%	Acros Organics	AC205260100	Mutagen
Fetal Plex	Gemini Bio-Products	100-602	Ergänzung für basische Wachstumsmedien
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/Fiji	NA	sourse Bildanalyse-Software. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2-Inkubator	Eppendorf	CO1700100X	Zellkultur-Inkubation
gblocks (fluoreszierende FP-Varianten: Clover und mKate2)	Integrated DNA Technologies	NA	gblock ORFs von Ctr-optimierten FP-Varianten für die Klonierung in p2TK2SW2
Gentamycin 10mg/ml	Gibco	15710-064	Antibiotikum für Wachstumsmedien
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)	Corning	21-020-CM	Spülen der Wirtszellen
Heparin-Natrium	Amersham Life Science	16920	hemmt und kehrt die frühen elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen der Wirtszelle und EBs
um HEPES 1M	GE Life Sciences	SH30237.01	pH-Puffer für Wachstumsmedien
InjectMan	Eppendorf	5179 000.018	Mikromanipulator
Jupyter Notebook	https://jupyter.org/	NA	Visualisierung von Einschlussspuren. https://jupyter.org/
Lambda 10-3	Sutter Instrument	LB10-3	Filterradregler
Oko Touch	OKO Labs	Oko Touch	Interface zur Steuerung der fetten Linie T und CO2-Einheit
Vorherige XY-Stufe	Prior	H107	Motorisierter XY-Mikroskoptisch
PrismR Zentrifuge	Labnet	C2500-R	Temperaturgesteuerte Mikrozentrifuge
Problot Hybridisierungsofen	Labnet	H1200A	Schaukelinkubator für Infektionen mit Chlamydien
Proscan II	Prior	H30V4	XYZ-Mikroskoptischregler
Luftreiniger Klasse 2 Biosicherheitswerkbank	Labconco	362804	Zellkulturen
RPMI-1640 (kein Phenolrot)	Gibco	11835-030	Basis-Wachstumsmedien für die Bildgebung
RPMI-1640 (phenolrot)	GE Life Sciences	SH30027.01
(470 nm, 595 nm)	OszilloskopLED	F140	Anregungslicht
Sonic Dismembrator Modell 500	Fisher Scientific	15-338-550	Ultraschallgerät, resuspendierendes Chlamydien-Pellet
Inkubator Stage-Inkubator	OKO Labs	H301-K-FRAME	Cluster-Well-Platten-Inkubationskammer
Saccharose-Phosphat-Glutamat-Puffer 1X (SPG)	Hauseigener	NA	Chlamydien-Lagerpuffer. (10 mM Natriumphosphat [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM Saccharose, 0,50 mM L-Glutaminsäure; pH 7,4)
T-75 Kolben	Thermo Scientific	156499	Zellkulturwachstum
TE 300 inverses Mikroskop	Nikon	16724	Mikroskop
THOR LED	Thor Labs	LEDD1B	Weißlicht
Trypsin	Corning	25-052-CI	Verdrängt Wirtszellen aus dem Kolben zur Aussaat in Platten
Zyla sCMOS	Andor	ZYLA-5.5-USB3	Bildgebungskamera
&Mikro; Manager 2.0gamma	https://github.com/micro-manager/micro-manager	NA	Offenes Softwarepaket für die automatisierte Mikroskopsteuerung