Hier wird eine wirksame Methode beschrieben, wie man hohe virale Titerbestände an Hepatitis-E-Viren (HEV) produziert, um Häpatomzellen effizient zu infizieren. Mit der vorgestellten Methode können sowohl nicht umhüllte als auch umhüllte Viruspartikel geerntet und zur Impfung verschiedener Zelllinien verwendet werden.
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Methodenartikel
Ein Zellkulturmodell zur Herstellung von Hepatitis-E-Virus-Beständen mit hohem Titer
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hepatitis E Virus ist die Hauptursache für Leberzirrhose und Leberversagen mit zunehmender Prävalenz weltweit. Das einsträngige RNA-Virus wird überwiegend durch Bluttransfusionen, unzureichende hygienische Bedingungen und kontaminierte Lebensmittel übertragen. Bis heute ist das off-Label-Medikament Ribavirin (RBV) für viele Patienten die Behandlung der Wahl. Dennoch muss noch eine spezifische HEV-Behandlung identifiziert werden. Bisher wurde das Wissen über den HEV-Lebenszyklus und die Pathogenese durch das Fehlen eines effizienten HEV-Zellkultursystems stark behindert. Ein robustes Zellkultursystem ist für die Untersuchung des viralen Lebenszyklus unerlässlich, der auch die virale Pathogenese umfasst. Mit der hier beschriebenen Methode kann man virale Titer von bis zu 3 x 106 Fokusbildeinheit/ml (FFU/ml) von nicht umhüllter HEV und bis zu 5 x 104 FFU/ml umhüllter HEV produzieren. Mit diesen Partikeln ist es möglich, eine Vielzahl von Zellen unterschiedlicher Herkunft zu infizieren, einschließlich Primärzellen und menschlichen, sowie tierischen Zelllinien. Die Produktion von infektiösen HEV-Partikeln aus Plasmiden stellt eine unendliche Quelle dar, die dieses Protokoll außerordentlich effizient macht.
Einleitung
Hepatitis E ist eine ziemlich unterschätzte Krankheit mit zunehmender Verbreitung weltweit. Etwa 20 Millionen Infektionen führen zu mehr als 70.000 Todesfällen pro Jahr1. Das zugrunde liegende Mittel, das Hepatitis-E-Virus (HEV), wurde vor kurzem neu zugewiesen und ist nun in der Familie Hepeviridae einschließlich der Gattungen Orthohepevirus und Piscihepevirus klassifiziert. HEV verschiedener Herkunft werden innerhalb der Art Orthohepevirus A-D einschließlich Isolate n. Mensch, Schwein, Kaninchen, Ratten, Vögel und andere Säugetiere2eingestuft. Derzeit wurden acht verschiedene Genotypen (GT) des positiv-orienti....
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Protokoll
HINWEIS: Alle Experimente werden unter BSL-2-Bedingung durchgeführt. Alle Materialien, die mit DerHepatitis E-Virus-RNA oder infektiösem Virus in Berührung kommen, müssen vor der Entsorgung mit 4% Kohrsolin FF aus einem Abfallbehälter in der Haube richtig gespült werden.
1. Plasmid-Vorbereitung
- Inokulatieren Sie 200 ml LB-Medium mit 100 g/ml Ampicillin mit transformiertem Escherichia coli JM109 mit einer Plasmid-Codierung für die Sequenz HEV gt3 Kernow-C1p6 in voller Länge (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 oder pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). 16 h bei 37 °C unter permanente....
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Ergebnisse
In diesem Protokoll beschreiben wir die Produktion von Hochtiter-Infektier HEVcc. Der erste Schritt besteht darin, die Plasmid-DNA (pBluescript_SK_HEVp654 und pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Abbildung 8a) zu isolieren, die dann durch Restriktionsverdauung linearisiert und für die In-vitro-Transkription gereinigt wird (Abbildung 1). Eine erfolgreiche Linearisierung kann durch den Vergleich der nicht verdauten Plasmid.......
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Diskussion
Beginnend mit der Plasmidpräparation sollten die DNA-Erträge 150 ng/l überschreiten, um eine multiple Linearisierung aus demselben Plasmidbestand durchführen zu können, was das Risiko einer durch Bakterien induzierten Mutagenese wichtiger Genomsequenzen minimiert. Darüber hinaus ist es wichtig, den Restriktionsdigest für die vollständige Plasmid-Linearisierung durch Gelelektrophorese zu überprüfen (Abbildung 8b). Ein Mangel an linearisierter Plasmid-DNA würde eine Rollkreisverstärkung induzi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir sind Suzanne Emerson für den Klon des Hepatitis-E-Virus p6 dankbar. HEV-spezifisches Kaninchenhyperimmunserum wurde freundlicherweise von Rainer Ulrich, Friedrich-Loeffler-Institut, Deutschland, zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus danken wir allen Mitgliedern des Fachbereichs Molekulare und Medizinische Virologie der Ruhr-Universität Bochum für ihre Unterstützung und Diskussion. Die Zahlen 1-7 wurden mit BioRender.com erstellt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,45 &Mikro; m mesh | Sarstedt | 83.1826 | Ernte extrazelluläres Virus |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunfluoreszenz |
| Essigsäure | CarlRoth | 6755.1 | Kollagen-Arbeitslösung |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virusernte |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Auswahl von transformierten Bakterien |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro Transkription und Elektroporation |
| BioRender | BioRender | Figur Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R Lösung 0,4 % steril | Serva | 47256.01 | Kollagen Arbeitslösung |
| CTP | Roche | 11140922001in vitro Transkription | |
| Küvette | Biorad | 165-2088 | Elektroporation |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunfluoreszenz |
| DMEM | gibco | 41965-039 | |
| Zellkultur DNAse | Promega | M6101 | in vitro Transkription |
| DTT | Promega | enthalten in P2077 | in vitro Transkription |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
| Fötales Rinderserum | gibco | 10270106 | Zellkultur |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunfluoreszenz |
| GenePulser Xcell Elektroporationssystem | BioRad | 1652660 | Elektroporation |
| Gentamycin | gibco | 15710049 | Zellkultur |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro Transkription |
| H2O | Braun | 184238001 | Immunfluoreszenz |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Pferdeserum | gibco | 16050122 | Immunfluoreszenz |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | Zellkultur |
| L-Glutathion reduziert | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Zellkultur |
| MEM NEAA (100&fach;) | gibco | 11140-035 | Zellkultur |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Mikrovolumen-UV-Vis-Spektralphotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA-Konzentration |
| MluI-Enzym | NEB | R0198L | Linearisierung |
| NEB-Puffer | NEB | in R0198L | Linearisierung |
| enthaltenNucleoSpin Plasmid Kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmidvorbereitung |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA-Aufreinigung |
| PBS | gibco | 70011051 | Zellkultur |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Zellkultur Plasmid |
| kodiert für das HEV-Genom in voller Länge (p6_G1634R) | Todt et.al | Virusproduktion | |
| Plasmid kodiert für das HEV-Genom in voller Länge (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank-Beitrittsnummer JQ679013 | Virusproduktion |
| Primärer Antikörper 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunfluoreszenz |
| Primärer Antikörper 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich-Loeffler-Institut, Deutschland | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA-Extraktion |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro Transkription |
| RNase weg | CarlRoth | A998.3 | RNA-Aufreinigung |
| RNasin (RNase-Inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro Transkription |
| Sekundärer Antikörper Esel Anti-Maus 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunfluoreszenz |
| Sekundärer Antikörper Ziege Anti-Kaninchen 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunfluoreszenz |
| Natrium Pyruvat | gibco | 11360070 | Zellkultur |
| T7 RNA-Polymerase | Promega | P2077 | in vitro Transkription Transkriptionspuffer |
| Promega | in P2077 | in vitro Transkription | |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunfluoreszenz |
| Trypsin-EDTA (0,5 %) | gibco | 15400054 | Zellkultur |
| mit extrem niedrigem IgG | gibco | 1921005PJ | Zellkultur |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro Transkription |
Referenzen
- Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
- Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology
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Nachdrucke und Genehmigungen
