Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

C. quinquefasciatus, allgemein bekannt als die südliche Hausmücke, ist ein kompetenter Vektor zahlreicher Krankheitserreger, darunter West-Nil-Virus (WNV), Japanische Enzephalitis, Saint Louis-Enzephalitis und Östliche Pferdeenzephalitis. Insbesondere seit seiner ersten Erkennung in New York im Jahr 1999 hat sich WNV zu einer der wichtigsten vektorübertragenen Krankheiten in den kontinentalen Vereinigten Staaten (USA) entwickelt, mit über 50.000 gemeldeten menschlichen Fällen, die zwischen 1999 und 2018 zu rund 2.300 Todesfällen^{führten 1} sowie über 4.500 gemeldeten Pferdefällen zwischen 2008 und 2019^2. Darüber hinaus sind mindestens 23 in Nordamerika vorkommende Vogelarten von WNV-Infektionen betroffen, wobei mindestens 12 Arten aufgrund von WNV³als unwiederbringlich eingestuft wurden. Die Auswirkungen von WNV auf Menschliche, Pferde- und Vogelpopulationen sind auf das opportunistische Fressverhalten seiner Vektoren zurückzuführen. Typischerweise sind Vögel die primären Wirte für WNV, und Menschen und Pferde sind zufällige oder Sackgassenwirte. Einige von C. quinquefasciatus vektorisierten Krankheitserreger infizieren nur Vögel wie den Vogelmalariaparasiten Plasmodium relictum. In Hawaii ist C. quinquefasciatus ein Hauptvektor der Vogelmalaria und hat das Aussterben vieler einheimischer Vogelarten verursacht^4,5.

Um Krankheiten zu kontrollieren, die von C. quinquefasciatusübertragen werden, haben Forscher und Vektorkontrollbehörden häufig etablierte Instrumente zur Kontrolle der Mückenpopulation wie die Anwendung von Insektiziden⁶verwendet, diese Methoden sind jedoch kostspielig, nicht artspezifisch und haben eine begrenzte Wirksamkeit, da die Resistenz gegen Insektizide in vielen C. quinquefasciatus-Populationen hoch ist^6,7,8,9. Andere Kontrolltechniken, wie Wolbachia-basiertePopulationskontrollstrategien, wurden in den letzten Jahren^{entwickelt 10,11}, aber die mit wolbachia-Infektion verbundenen Fitnesskosten begrenzen die Machbarkeit dieses Ansatzes für diesen Vektor¹². Es gibt auch genetisch basierte Bekämpfungsmethoden, die bei anderen Mückenarten wie Aedes aegypti^{13 , 14,} Anopheles gambiae15 und Anopheles stephensi¹⁶ entwickelt wurden , einschließlich der Entwicklung von pathogenresistenten Moskitos^17,18,19, die auch für C. quinquefasciatus entwickelt werden könnten, wenn die erforderlichen Genom-Engineering-Werkzeuge entwickelt für diese Art. Die Biologie von C. quinquefasciatus unterscheidet sich jedoch stark von anderen Aedes- und Anopheles-Mückenvektoren, was die Entwicklung ähnlicher genetischer Technologien in diesem Vektor erschwert hat. Mit dem Aufkommen von CRISPR-basierten Genom-Engineering-Technologien ist präzises Genome Engineering immer trivialer, erschwinglicher und anpassungsfähiger geworden und hat folglich zur Entwicklung neuartiger genetischer Werkzeuge in einer Vielzahl von Arten geführt.

Um Mutationen mit CRISPR-basierten Technologien zu erzeugen, wird eine Mischung aus Cas9-Protein und synthetischer Leit-RNA (sgRNA), die die gewünschten Loci ergänzt, in Embryonen im Präblastodermstadium mikroinjektiert. Da C. quinquefasciatus Weibchen ihre Eier in Gruppen ablegen, die in einer schwimmenden Floßstruktur befestigt sind (Abbildung 1), im Gegensatz zum Ovipositieren einzelner Eier, einem Merkmal von Aedes und Anopheles Moskitos, werden Embryo-Mikroinjektionen bei dieser Art zunehmend komplizierter. Culex-Larven treten auch von der vorderen Seite jedes Eies auf, die mit der Wasseroberfläche in Kontakt kommt (Abbildung 1), so dass die Eiorientierung nach der Manipulation bei dieser Art wichtig ist. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Cas9-Protein und sgRNA in C. quinquefasciatus-Embryonen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Merkmale zu berücksichtigen, die für die Culex-Biologie einzigartig sind, um das Überleben von Embryonen und die Genommutationsraten durch bestimmte Schritte zu verbessern, die für die rechtzeitige Eizellentnahme und das Überleben von Eizellen entscheidend sind.

1. C. quinquefasciatus Kolonieaufzucht

1. Richten Sie mehrere Kolonien von C. quinquefasciatus-Erwachsenen in Käfigen von Insektenschlafsälen ein.
   HINWEIS: Die Kolonien wurden von Dr. Laura Harrington an der Cornell University²⁰zur Verfügung gestellt. Detaillierte Protokolle für die Aufzucht von Culex-Moskitos finden Sie in anderer Literatur²¹.
   1. Halten Sie die Moskitos bei 25 ± 1 ° C bei 30% Luftfeuchtigkeit mit einem Tag:Nacht-Zyklus von 12:12 h.
   2. 20% ige Zuckerlösung ad libitum bereitstellen, indem Sie einen Zuckerlösungsbehälter mit einem Docht in den Käfig einführen oder Wattebällchen mit der Zuckerlösung sättigen und in den Käfig legen.
2. Lassen Sie Moskitos sich mindestens 3 Tage vor der Blutfütterung paaren (Abbildung 2A).

2. Sammlung von Embryonen im Stadium von C. quinquefasciatus vor dem Blastodermstadium

1. Nach 3-6 Tagen nach der Eklosion den Weibchen 1-2 ml eines citrierten Rinderblutmehls durch eine synthetische Membran zuführen und in einem Blutfütterungssystem auf ca. 40 °C erhitzt werden (Abbildung 2B). Es gibt auch alternative Blutfütterungsprotokolle, die für Culex-Moskitos verwendet werden können (z. B. siehe Referenz²¹).
   HINWEIS: C. quinquefasciatus ist bekannt für eine Vorliebe für Vogelblut. Einige Labore verwenden betäubte lebende Vögel oder Vogelblut für ihre Blutmahlzeitquelle^21,22,23. Kolonien können jedoch trainiert / ausgewählt werden, um sich von Rinderblut oder kleinen Nagetieren zu ernähren, wenn dieses Merkmal über mehrere Generationen hinweg ausgewählt wird.
   1. Lassen Sie die Weibchen mindestens 3 Tage nach der Blutfütterung ruhen, um sich einer Oogenese und Eireifung zu unterziehen, bevor sie die Eiablage für Mikroinjektionsexperimente induzieren.
2. Erstellen Sie am Tag der embryonalen Mikroinjektionen einen Eiablagebecher mit organisch infundiertem Eiablagewasser. Eiablagewasser sollte durch Fermentieren von Kaninchenkot (50 g / L), Zersetzen von Gras (4,5 g / L) oder Fischfutter (25 g / L) in Wasser im Laufe von 5 oder mehr Tagen^24,25hergestellt werden.
3. Legen Sie den Eiablagebecher in den Käfig und stellen Sie den gesamten Käfig an einen dunklen Ort (Abbildung 2C).
4. Überprüfen Sie den Becher alle 30 Minuten auf Eierflöße.
   1. Wenn Eierflöße vorhanden sind, sammeln Sie die Flöße, indem Sie sie mit einem Pinsel schaufeln und auf ein nasses Filterpapier legen (Abbildung 2D, E).

3. Ausrichtung von Embryonen im Stadium von C. quinquefasciatus vor dem Blastodermstadium

1. Trennen Sie die Eier von den Flößen, indem Sie auf das Floß drücken und die Eier einzeln mit einem feinen Pinsel und einer Zette auseinander necken (Abbildung 2E).
2. Richten Sie einzelne Eier auf einem dünnen Streifen doppelseitigem Klebeband aus, der über die Oberseite eines Glasobjektträgers gelegt wird (Abbildung 2F).
3. Versuchen Sie beim Ausrichten, die vordere Seite jedes Eies in die gleiche Richtung zu richten, um die Zugänglichkeit zu erleichtern.
   HINWEIS: Eine alternative Methode zur Ausrichtung der Eizellen ohne doppelseitiges Klebeband finden Sie in einem zuvor veröffentlichten Nasonia vitripennis Embryo-Mikroinjektionsprotokoll²⁶.
4. Eier mit der Halogenkohlenstoffölmischung abdecken.
   HINWEIS: Die Halocarbon-Mischung kann im Voraus hergestellt werden, indem zwei Halogenkohlenstoffreagenzien und Wasser (9:1:20, Halogenkohlenstoff 700: Halogenkohlenstoff 27: Reinstwasser) sanft gemischt und dann über Nacht bei 25^οC inkubiert wird, um die Wassersättigung des Halogenkohlenwasserstofföls zu erleichtern.

4. Nadelvorbereitung für Mikroinjektionen

1. Erzeugen Sie die Aluminosilikatkapillarglasnadeln mit einem Glasmikropipettenzieher.
   1. Legen Sie ein Aluminosilikatkapillarglas in einen Nadelzieher, gemäß den Anweisungen aus der Bedienungsanleitung des Nadelziehers.
      HINWEIS: Quarz- und Borosilikatkapillarnadeln können ebenfalls verwendet werden, aber für dieses Experiment wird Aluminosilikat wegen seiner relativen Erschwinglichkeit und Haltbarkeit bevorzugt.
   2. Stellen Sie Heat auf 516, Velocity auf 100, Delay auf 70, Pull auf 97 und Pressure auf 500 am Nadelzieher ein.
   3. Aktivieren Sie den Nadelzieher gemäß den Anweisungen des Abziehers und wiederholen Sie ihn nach Bedarf für zusätzliche Nadeln.
      HINWEIS: Während des Injektionsprozesses werden Nadeln oft verstopft oder versehentlich gebrochen, daher wird dringend empfohlen, zusätzliche Nadeln für ein einzelnes Experiment zu ziehen.
2. Beschichten Sie die Nadelspitze, indem Sie die Spitze der gezogenen Nadel auf der rotierenden Diamantschleifplatte vorsichtig berühren, für ca. 10 s in einem Winkel von 50°.
   HINWEIS: Wenn Sie die Nadel anfassen, wird sie geöffnet, damit Flüssigkeit durchfließen kann, während gleichzeitig eine schärfere Spitze für ein leichteres Eindringen in den Embryo entsteht. Ein Beispiel für eine richtige Nadel kann in einem früheren Artikel²⁶gesehen werden.
3. Lagern Sie gezogene und abgeschränkte Nadeln, indem Sie sie in Linien aus Modellierton in einer Petrischale einbetten.
   HINWEIS: Um die beste Qualität für Nadelspitzen zu gewährleisten, sollten Nadeln so nah wie möglich am Zeitpunkt der Injektion frisch gezogen und abgeschrächt werden.

5. Einlegen des Injektionsgemisches

1. Bereiten Sie die Injektionsmischung aus Genommodifikationsreagenzien (z. B. 200 ng / μL sgRNA und 200 ng / μL Cas9-Mischung) oder bevorzugten Injektionslösungen vor und halten Sie sie auf Eis.
   HINWEIS: Diese Mischung kann zubereitet werden, während auf die Eizellen gewartet wird. Weitere Details zur Cas9- und sgRNA-Produktion und -Vorbereitung für die Mikroinjektion finden Sie in früheren Publikationen^27,28,29,30.
2. Laden Sie 2 μL Injektionsmischung mit einer Mikroladerspitze in die Injektionsnadel.

6. Mikroinjektion eingerichtet

1. Legen Sie die gefüllte Injektionsnadel in einen Mikromanipulator, der mit einem elektronischen Mikroinjektor verbunden ist.
2. Legen Sie den Glasträger mit den ausgerichteten Eiern auf die Bühne eines zusammengesetzten Mikroskops.
3. Richten Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator und dem zusammengesetzten Mikroskop so aus, dass sie in einem Winkel von 25-35 ° auf das hintere Ende des Embryos zielt.

7. Mikroinjektion des Embryos (Abbildung 2G)

1. Führen Sie die Nadel vorsichtig in den Embryo ein und injizieren Sie die Mischung mit einer Menge von etwa 10% des Volumens des Embryos (700-800 pL abhängig von der Größe der Eier).
   HINWEIS: Bei der Injektion sollte das Ei leicht anschwellen, aber wenn zu viel Flüssigkeit injiziert wird, können Eier platzen oder zytoplasmatische Flüssigkeit kann austreten.
2. Injizieren Sie etwa 20 Eier gleichzeitig, stoppen Sie dann und führen Sie Embryo-Genesungsverfahren durch.
   HINWEIS: Während der Injektion besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass Nadeln entweder verstopfen oder brechen. Wenn ein Verstopfung auftritt, der durch einen Mangel an Injektionsflüssigkeit, die durch die Nadel fließt, festgestellt werden kann, versuchen Sie entweder, die Nadel mit der Reinigungsfunktion des elektronischen Mikroinjektors zu reinigen oder versuchen Sie, die Nadel neu zu entränken. Wenn keiner der beiden Schritte funktioniert, wechseln Sie schnell zu einer neuen Nadel und stellen Sie sicher, dass die vorbereiteten Eier feucht bleiben.

8. Embryonenentstehung und Schlüpfen

1. Lassen Sie die Eier mindestens 5 Minuten ungestört. Entfernen Sie das Halogenkohlenwasserstofföl innerhalb von 20 Minuten nach der Injektion vorsichtig, indem Sie es leicht mit einem sauberen Pinsel bürsten(Abbildung 2H).
2. Heben Sie die Eier vorsichtig mit einem Pinsel an und legen Sie sie in eine Tasse doppelt destilliertes Wasser (Abbildung 2I). Achten Sie darauf, die Eier auf der Wasseroberfläche zu halten.
3. Überprüfen Sie die Eier täglich für 7 Tage auf Schlüpfen (Abbildung 2J).
4. Befolgen Sie die normalen Larvenaufzuchtverfahren²¹.

9. Screening auf Genomveränderung

1. Screenen Sie die injizierten Moskitos mit einem Stereoskop auf die mutierten Phänotypen (Abbildung 2K).
   1. Verifizierung von Mutationen, die keinen leicht erkennbaren Phänotyp aufweisen, durch PCR-Amplifikation, T7-Endonuklease-I-Assay und Sequenzierung durch Subklonierung der Zielregion³¹.
2. Richten Sie zusätzliche Kreuzungen zwischen injizierten Individuen ein, um vererbbare Mutationen innerhalb der Keimbahn zu erkennen.

In zuvor veröffentlichten Experimenten wurde diese Methode verwendet, um erfolgreich somatische und Keimbahnmutationen eines Gens zu erzeugen, das für die Entwicklung der Pigmentierung des dunklen Auges, weiß (CPIJ005542)30 (Tabelle 1) kritisch ist. CRISPR/Cas9-generierte somatische Mutationen wurden durch Screening auf Pigmentverlust in den Augen der Puppenstufe von injizierten Personen (G0)bewertet. Somatische Mutationen waren im Allgemeinen als Mosaikphänotypen vorhanden, bei denen einige, aber nicht alle Zellen den mutierten Phänotyp aufweisen. Zum Beispiel führten somatische Mutationen des weißen Gens zu einer Mischung von Ommatidien mit Phänotypen, denen es an Pigmentierung mangelt, und solchen mit einem Wildtyp-pigmentierten Phänotyp30. Als es jedoch zu einer Keimbahnmutation des weißen Gens kam, erbte die nächste Generation (G1)den vollen weißäugige Phänotyp. Keimbahnmutationsraten wurden durch Kreuzung von Mosaik G0 Individuen und Scoring für vollständig weißäugige Nachkommen bestimmt (G1). Diese Experimente führten zu einer Überlebensrate von 64% bis 82% der Embryonen sowie zu einer somatischen Mutageneserate von 37% bis 57% und einer Keimbahnmutageneserate von >61% (Tabelle 1). Durch das Multiplexing von sgRNAs, um mehrere Loci im selben Gen anzusprechen, stiegen die mutageneseraten der somatischen und Keimbahnen auf bis zu 86% an (Tabelle 1). Darüber hinaus werden seit vielen Generationen lebensfähige homozygote Bestände der weißen Mutanten erfolgreich im Labor gehalten.

Abbildung 1: C. quinquefasciatus Eierfloß und Einzeleimorphologie.
Dorsale (A), laterale (B) und ventrale (C) Ansichten von C quinquefasciatus Eierflößen. C. quinquefasciatus Weibchen legen ihre Eier mit der bauchigeren vorderen Seite, die die Wasseroberfläche berührt, während die spitzere hintere Seite von der Wasseroberfläche entfernt ist (D). A- anterior; P- posterior Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Zeitleiste für die Schaffung von C. quinquefasciatus-Mutanten durch Mikroinjektion.
Zeitleiste der Vorbereitung der C. quinquefasciatus-Kolonie und der Embryonentnahme für die Mikroinjektion (A-D). Gesammelte Eier werden dann getrennt (E) in der gleichen Ausrichtung ausgerichtet und mit Halogenkohlenstofföl (F) bedeckt. Die Eier werden dann injiziert (G) und mindestens 5 Minuten ruhen gelassen, bevor das Halogenkohlenstofföl (H) entfernt wird. Die Eier werden dann zum Schlüpfen in eine reinen Wasserquelle (I)überführt und auf mutierte Phänotypen ( K )untersucht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Überlebens- und Mutationsraten von Embryonen, die mit einzelnen und multiplexierten gRNAs injiziert wurden, die auf Weiße abzielen. Die Tabelle wird mit Genehmigung von30 nachgedruckt

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