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Methodenartikel

Makrorheologische Charakterisierung von Kiemen-Raker-Schleim im Silberkarpfen, Hypophthalmichthys molitrix

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DOI:

10.3791/61379

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10. Juli 2020

 ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, The George Washington University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur rheologischen Charakterisierung von Schleim vor, der sich auf Kiemenrechen (GRs) des Silberkarpfens befindet. Viskoelastische Eigenschaften von GR-Schleim, die durch Messung von Viskositäts-, Speicher- und Verlustmodulen erhalten werden, werden auf die scheinbare Streckgrenze untersucht, um den Filterfütterungsmechanismus in GRs zu verstehen.

Zusammenfassung

Der Silberkarpfen, Hypophthalmichthys molitrix, ist ein invasiver planktfressender Filterfüttererfisch, der aufgrund seines hocheffizienten Filterfütterungsmechanismus die natürlichen Wasserwege des oberen Mississippi-Beckens befallen hat. Die charakteristischen Organe, die als Kiemenrechen (GRs) bezeichnet werden und in vielen solchen Filterfütterern zu finden sind, erleichtern die effiziente Filtration von Lebensmittelpartikeln wie Phytoplankton, die einige Mikrometer groß sind.

Die Motivation, die Rheologie des GR-Schleims zu untersuchen, rührt von unserem Wunsch her, seine Rolle bei der Unterstützung des Filterfütterungsprozesses im Silberkarpfen zu verstehen. Die schleimreiche Flüssigkeit in einem "dicken und klebrigen" Zustand kann die Haftung von Lebensmittelpartikeln erleichtern. Die Permeation und der Transport durch die GR-Membran werden durch die Einwirkung externer Scherkräfte erleichtert, die unterschiedliche Scherdehnungsraten induzieren. Daher kann die Schleimrheologie einen wichtigen Hinweis auf die enorme Überkonformität des Silberkarpfens im Pool der filterfütternden Fische liefern. Auf dieser Grundlage wurde postuliert, dass GR-Schleim eine Klebefunktion für Lebensmittelpartikel bieten und als Transportmittel zur Unterstützung des Filterfütterungsprozesses fungieren kann.

Das Hauptziel des Protokolls ist es, die Streckgrenze des Schleims zu bestimmen, die auf die minimale Scherspannung zurückzuführen ist, die erforderlich ist, um eine Strömung zu initiieren, bei der eine irreversible plastische Verformung zuerst über ein strukturiertes viskoelastisches Material beobachtet wird. Dementsprechend wurden die rheologischen Eigenschaften des GR-Schleims, d.h. Viskositäts-, Speicher- und Verlustmodule, mit einem Rotationsrheometer auf seine nicht-newtonsche, scherverdünnende Natur untersucht.

Ein hier vorgestelltes Protokoll wird verwendet, um die rheologischen Eigenschaften von Schleim zu analysieren, der aus den Kiemenrechen eines Silberkarpfens gewonnen wird, der am Hart Creek-Standort des Missouri River gefischt wird. Das Protokoll zielt darauf ab, eine effektive Strategie für rheologische Tests und Materialcharakterisierung von Schleim zu entwickeln, von dem angenommen wird, dass er ein strukturiertes viskoelastisches Material ist.

Einleitung

Der Silberkarpfen( Hypophthalmichthys molitrix) ist ein planktivorer Filterfresser und eine invasive Art, die mehrere natürliche Wasserstraßen in den Vereinigten Staaten infiltriert hat. Diese Art wurde ursprünglich im oberen Mississippi River Becken eingeführt, um Algenblüten1,2,3zu kontrollieren. Der Silberkarpfen ist ein äußerst effizienter Feeder. Typischerweise reichen die Partikelgrößen der Verbrauchsmaterialien von 4 bis 20 μm bis zu größerem Zooplankton, das etwa 80 μm3,4,5beträgt. Diese Art hat andere einheimische Fische ihnen abverdlichtet und kann durch die Begrenzung der verfügbaren Ressourcen enorme Schäden an einheimischen Wasserstraßen verursachen1,2,6. So stellen filterfütterende Fische wie der Silberkarpfen und der Großkopfkarpfen eine große Bedrohung für die Großen Seendar 1,2,6,7,8.

Filterfütternde Fische besitzen spezielle Organe, die als Kiemenrechen (GRs) bezeichnet werden, wobei sich eine dünne Schleimschicht auf ihrer Oberfläche befindet. Diese Organe verbessern die Effizienz der Filtration und Aggregation kleiner Partikel aus der ankommenden Flüssigkeit. Ziel des hier vorgestellten Protokolls ist es, die nicht-newtonsche, scherverdünnende Materialeigenschaft und streckgrenze des GR-Schleims zu charakterisieren, der von der innenfläche der Kiemenrechen im Silberkarpfen gewonnen wird. Der mit einem Rotationsrheometer ermittelte Wert der Streckgrenze des GR-Schleims ist in dieser Studie von Interesse. Die gemessene Streckgrenze, auch "scheinbare Streckgrenze" genannt, hängt von den Prüfverfahren wie Steady Shear Rate- oder Dynamic Oscillatory Strain-Typ9,10ab. Die scherverdünnende " Streckgrenzerflüssigkeit" durchläuft einen Übergang von festem zu flüssigkeitsähnlichem Verhalten bei einer kritischen angelegten Spannung9,11. Die scheinbare Streckgrenze ist die minimale Scherspannung, die erforderlich ist, um eine Strömung einzuleiten, oder die, bei der eine irreversible plastische Verformung zuerst beobachtet wird, wenn der Schleim von einem gelartigen Material zu einem flüssigkeitsähnlichen Material übergeht. Dieses Verhalten kann in strukturierten viskoelastischen Materialien beobachtet werden. Der Übergang vom gelartigen zum flüssigkeitsähnlichen Verhalten des GR-Schleims beinhaltet zwei Funktionen, d.h. eine Kleberolle zum Sammeln von Lebensmittelpartikeln und eine Transportfahrzeugrolle zur Unterstützung des Partikelabgabe- und Filtrationsprozesses. Die erweiterte Funktion des Schleims umfasst die Schaffung von Diffusionsbarrieren bei krankheitsresistenz und Atmung, die kontrollierte Freisetzung von Ernährungsfaktoren, toxischen Komponenten und Ausscheidungen, die Schaffung von Stoffwechselwegen für die Fütterung und Verschachtelung, die Unterstützung beim Schutz von Raubtieren und die Erzeugung von Grenzschichtmodifikationen, die die Fortbewegung und die Antriebseffizienz verbessern12,13,14.

Im Gegensatz zu einfachen Flüssigkeiten besitzen komplexe Flüssigkeiten wie der Schleim Eigenschaften, die mit den Strömungsbedingungen variieren und zusätzliche Messparameter erfordern, um ihr physikalisches Verhalten im Großmaßstab zu definieren. Zur Überwachung der Viskosität und Streckgrenze von GR-Schleim werden rheologische Messungen mit einem Rotationsrheometer durchgeführt. Das Rotationsrheometer wendet eine stetige oder oszillierende Scherspannung oder -dehnung mittels einer rotierenden Scheibe in Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe an und misst deren Reaktion. Der Grund für die Verwendung dieses Instruments und dieser Technik ist, dass das Rheometer eine Reihe von Messungen liefern kann, um die Materialeigenschaften des GR-Schleims des Silberkarpfens zu beschreiben, die nicht allein durch viskose definiert werden können.

Der Schleim ist ein viskoelastisches Material und seine mechanische Reaktion auf eine auferlegte Verformung liegt zwischen der eines reinen Feststoffs (geregelt durch das Hookesche Elastizitätsgesetz) und der einer reinen Flüssigkeit (geregelt durch das Newtonsche Viskositätsgesetz)15,16. Das komplexe makromolekulare Netzwerk, das im Schleim enthalten ist, kann sich als Reaktion auf äußere Kräfte oder Verformungen dehnen und neu ausrichten. Ein Rotationsrheometer besteht aus einer Kegelgeometrie und einer Peltierplatte, wie in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigt (siehe Tabelle 1 für Die Spezifikationen der Instrumentierung). Ziel dieser Studie war es, ein Protokoll zur Bestimmung der rheologischen Eigenschaften des GR-Schleims zu entwickeln. Ein Vorteil des Rotationsrheometers gegenüber einem Viskosimeter ist seine Fähigkeit, dynamische Messungen mit kleinen Probenvolumina durchzuführen. Das GR-Schleimprobenvolumen in dieser Studie betrug etwa 1,4 ml. Das Viskosimeter hingegen ist auf konstante Scherraten beschränkt und erfordert große Probenvolumina.

Es wird erwartet, dass die rheologischen Eigenschaften des Schleims innerhalb der Anatomie des Silberkarpfens stark variieren. Zum Beispiel können sich die Eigenschaften des Schleims, der sich auf den GR-Oberflächen befindet, vom Epibranchialorgan unterscheiden. Um die potenzielle Variabilität der Schleimeigenschaften in verschiedenen Regionen der Fische zu berücksichtigen, wurde die erworbene GR-Schleimprobe verdünnt und Lösungen mit drei Konzentrationen wurden mit dem Rotationsrheometer erstellt und getestet. Die nach Der Durchführung des Protokolls gemeldeten Daten und Ergebnisse zur Schleimrheologie zeigten die Wirksamkeit der Messtechnik. Die in diesem Artikel vorgestellten illustrativen Daten sind nicht dazu gedacht, über die gesamte Silberkarpfenpopulation verallgemeinert zu werden. Das hier vorgestellte Protokoll kann erweitert werden, um die Schleimrheologie über größere Stichprobensätze hinweg zu untersuchen, um andere Hypothesen zu testen.

Ziel dieser Studie ist es, die Variation der rheologischen Eigenschaften der GR-Schleimrheologie mit drei verschiedenen Schleimkonzentrationen (400 mg/ml, 200 mg/ml und 100 mg/ml) nachzuweisen. Die Konzentration von 400 mg/ml stellt die rohe Schleimprobe dar, die aus den Fisch-GRs gewonnen wurde. Deionisiertes Wasser (DI) wurde verwendet, um die rohe Schleimprobe in Konzentrationen von 200 mg/ml und 100 mg/ml zu verdünnen. Die Verdünnung der Schleimproben ermöglichte die Beurteilung des Scherausdünnungsgrades und der scheinbaren Streckgrenze in Abhängigkeit von der Konzentration und die Bestimmung der Konzentration, bei der der GR-Schleim in ein nicht-newtonsches Verhalten übergeht. Ein Shaker wurde verwendet, um große Schleimklumpen in den Proben abzubauen, um Fehler in den rheologischen Daten aufgrund von Inhomogenität zu mildern.

Bei den meisten Wirbeltieren, einschließlich Fischen, sind die vorherrschenden schleimbildenden Makromoleküle Glykoproteine (Muzinine), die dazu neigen, durch Verwicklungen oder chemische Vernetzung im Wasser aufzuquellen und ein gelartiges Material zu erzeugen12,13,17,18,19,20. Die hochmolekularen, gelbildenden Makromoleküle und der hohe Wassergehalt spiegeln die Rutschigkeit im Schleimwider 13. Ein hohes Maß an intermakromolekularen Wechselwirkungen führt zur Gelbildung, während geringere intermakromolekulare Wechselwirkungen oder gebrochene Bindungen zu hochviskosen Flüssigkeiten führen21.

Die Prozesse der Lebensmittelpartikelfiltration in filterfütternden Fischen werden durch GR-schleimbezogene Eigenschaften wie Kohäsion und Viskosität unterstützt, die ihr Adhäsionspotenzial und ihre Haftung bestimmen22. Die Stärke der schleimbasierten Adhäsion hängt von spezifischen intermolekularen, elektrostatischen oder hydrophoben Wechselwirkungen ab23. Sanderson et al.24 führten eine Suspensionsfütterungsstudie an Schwarzfischen durch, in der sie die Beweise für schleimbasierte Adhäsion fanden. Sie stellten fest, dass auf die Adhäsion von schwebenden Lebensmittelpartikeln mit einer Schleimhautoberfläche der Transport von aggregierten Partikelklumpen folgt, die durch gerichteten Wasserfluss, der darauf einwirkt, mit Schleim verbunden sind24. Der Schleim, der Scherdehnungsraten ausgesetzt ist, die durch den Wasserfluss erzeugt werden, erleichtert die Abgabe von Nahrungspartikeln an die Verdauungsorgane. Endoskopische Techniken wurden verwendet, um gefilterte Partikel zu beobachten24.

Literatur über den Bereich der Scherraten und praktischen Grenzen bei der rheologischen Untersuchung von GR-Schleim ist knapp. Daher wurde eine Orientierung aus rheologischen Studien zu Magen-, Nasen-, Zervix- und Lungenschleim, Lachshautschleim, Hagfish-Schleim und Knochengelenk-Oberflächenschmiermittel gesucht, wobei die rheologische Charakterisierung und nicht-newtonsche Attribute untersucht wurden11,12,25,26,27,28,29,30,31. In jüngerer Zeit wurde die Wirkung von Fischhautschleim auf die Fortbewegung und die Antriebseffizienz mittels Viskosimetrie mit konstanter Scherrate untersucht. Untersuchungen zur Hautschleimrheologie (ohne Verdünnung oder Homogenisierung) in Bezug auf Brasse, Wolfsbarsch und magere Zeigten nicht-newtonsches Verhalten bei typischerweise niedrigen Scherraten14.  In einer anderen verwandten Studie wurde festgestellt, dass die rohen Hautschleimproben von dorsalen und ventralen Seiten der senegalesischen Seezunge ein nicht-newtonsches Verhalten zeigen, was auf eine höhere Viskosität des ventralen Schleims bei allen Scherraten hinweist, die als32betrachtet werden. Andere rheologische Protokolle zur Hydrogelgerüstentwicklung und für hochkonzentrierte Suspensionen unter Verwendung eines Viskosimeters mit konstanter Scherrate wurden ebenfalls in der Literatur33,34berichtet.

In dieser Studie wurden die GR-Schleimeigenschaften mit einem dehnungskontrollierten Rotationsrheometer untersucht, das in rheologischen Experimenten an komplexen biologischen Flüssigkeiten weit verbreitet ist25. Bei Newtonschen Flüssigkeiten bleibt die scheinbare Viskosität konstant, ist scherratenunabhängig und die Scherspannungen variieren linear mit den Scherdehnungsraten (Abbildung 3A, B). Für nicht-newtonsche Flüssigkeiten (z. B. Scherverdünnungsflüssigkeiten) ist die Viskosität scherratenabhängig oder verformungsverlaufsabhängig (Abbildung 3A, B). Der Verlustmodul (G") stellt das Ausmaß dar, in dem das Material der Strömungsneigung widersteht und ist repräsentativ für die Flüssigkeitsviskosität (Abbildung 4). Der Speichermodul (G') stellt die Tendenz des Materials dar, nach spannungsinduzierter Verformung seine ursprüngliche Form wiederzuerlangen und entspricht der Elastizität (Abbildung 4). Der Phasenwinkel (δ) oder Verlusttangentenwert wird aus der inversen Tangente von G"/G' berechnet. Es stellt das Gleichgewicht zwischen Energieverlust und -speicherung dar und ist auch ein gebräuchlicher Parameter zur Charakterisierung viskoelastischer Materialien (δ = 0° für einen Hookean-Feststoff; δ = 90° für eine viskose Flüssigkeit; δ < 45° für einen viskoelastischen Feststoff und δ > 45° für eine viskoelastische Flüssigkeit) (Abbildung 4)25. Die scheinbare Streckgrenze (σy)in strukturierten Fluiden stellt eine Zustandsänderung dar, die in rheologischen Daten aus stationären Sweeps und dynamischen Spannungs-Dehnungs-Sweeps10beobachtet werden kann. Wenn die extern angelegte Spannung geringer ist als die scheinbare Streckgrenze, verformt sich das Material elastisch. Wenn die Spannung die scheinbare Streckgrenze übersteigt (in Abbildung 3Bals "mittlere Spannung" gekennzeichnet), wechselt das Material von elastischer zu plastischer Verformung und beginnt in seinem flüssigen Zustand zu fließen35. Die Messung des Speichermoduls (G') und des Verlustmoduls (G") in der Schleimprobe unter oszillierenden Spannungsbedingungen (oder Dehnungsbedingungen) quantifiziert die Änderung des Materialzustands von gelartigem zu viskoelastischem flüssigkeitsähnlichem Verhalten.

Die Arten von Rheometertests, die zur Überwachung von Daten in Bezug auf Speichermodul (G'), Verlustmodul (G") und scheinbare Viskosität (η) durchgeführt werden, werden hier beschrieben. Die dynamischen Schwingungstests (Dehnungs-Sweeps und Frequenz-Sweeps) überwachten G' und G' unter kontrollierter Schwingung der Kegelgeometrie. Die dynamischen Dehnungsfegentests bestimmten den linearen viskoelastischen Bereich (LVR) des Schleims durch Überwachung der intrinsischen Materialreaktion (Abbildung 4). Dehnungsfegen wurden verwendet, um das Nachgiebverhalten bei konstanter Schwingungsfrequenz und Temperatur zu bestimmen. Die dynamischen Frequenz-Sweep-Tests überwachten die Materialreaktion auf steigende Frequenz (Verformungsrate) bei konstanter Amplitude (Dehnung oder Spannung) und Temperatur. Für die dynamischen Frequenz-Sweep-Tests wurde die Dehnung im linearen viskoelastischen Bereich (LVR) aufrechterhalten. Die stationären Scherratentests überwachten die scheinbare Viskosität (η) unter stetiger Rotation der Kegelgeometrie. Der GR-Schleim wurde inkrementellen Belastungsschritten ausgesetzt und die scheinbare Viskosität (η, Pa.s) auf unterschiedliche Scherrate (ý, 1/s) überwacht.

Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll behandelt den GR-Schleim als ein komplex strukturiertes Material unbekannter Viskoelastizität mit einem bestimmten linearen viskoelastischen Reaktionsbereich. Der Fischschleim wurde aus den GRs des Silberkarpfens während eines Angelexpeditions am Hart Creek im Missouri River von Professor L. Patricia Hernandez (Department of Biological Sciences, The George Washington University) 1,2,36extrahiert.  Eine Anordnung von GRs im Mund eines Silberkarpfens ist in Abbildung 5A und eine schematische Zeichnung in Abbildung 5Bdargestellt. Ein ausgeschnittener GR ist in Abbildung 5Cdargestellt.  Die Extraktion von Schleim aus GRs des Silberkarpfens wird als Beispiel in den schematischen Zeichnungen dargestellt, Abbildung 5D, E. Alle Rheometertests wurden unter einer konstanten, kontrollierten Temperatur von 22 ± 0,002 °C durchgeführt, die temperatur aufgezeichnet am Fangort1,2,36.  Jede Schleimprobe wurde dreimal mit dem Rheometer getestet, und die gemittelten Ergebnisse werden zusammen mit den statistischen Fehlerbalken dargestellt.

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Protokoll

1. Herstellung der Schleimlösungen verschiedener Konzentrationen

HINWEIS: Für dieses Experiment werden drei Konzentrationen der Schleimlösung (400 mg/ml, 200 mg/ml und 100 mg/ml mit ungefähren Volumina, 1 ml, 1 ml bzw. 2 ml) vorbereitet.

  1. Um die Masse des Schleims zu berechnen, messen Sie die durchschnittliche Masse der Fläschchen mit (Mmit Schleim ; mg) und ohne Schleim (MFläschchen ; mg). Dann subtrahieren Sie die Masse der Fläschchen mit Schleim mit der masse ohne schleim (Mschleim = M mitschleim - Mfläschchen ; mg).
  2. Verdünnen Sie den Schleim in drei Konzentrationen (400, 200, 100, mg/ ml) mit deionisiertem (DI) Wasser.
    1. Bereiten Sie die erste Konzentration der Schleimlösung, 400 mg / ml, vor, indem Sie dem Schleim 0,6 ml DI-Wasser mit einer Mikropipette hinzufügen.
      HINWEIS: Da das ungefähre Volumen des extrahierten Schleims 1,4 ml betrug, hat die 400 mg / ml Lösung ein Gesamtvolumen von ~ 2 ml.
    2. Legen Sie die Durchstechflasche mit 400 mg / ml Schleimlösung auf einen Shaker, um sicherzustellen, dass die Schleimlösung ausreichend homogenisiert ist und jede Schleimpartikelagglomeration gemildert wird.
    3. Bereiten Sie die zweite Konzentration der Schleimlösung, 200 mg / ml, vor, indem Sie die Hälfte des Volumens der Schleimlösung der ersten Konzentration mit einer Mikropipette in eine neue Durchstechflasche ziehen und 1 ml DI-Wasser in die neue Durchstechflasche geben.
    4. Wiederholen Sie Schritt 1.2.2 für die erste und zweite Durchstechflasche mit Schleimlösungen.
    5. Bereiten Sie die dritte Konzentration der Schleimlösung, 100 mg / ml, vor, indem Sie die Hälfte des Volumens (1 ml) der 200 mg / ml-Lösung mit einer Mikropipette in eine neue Durchstechflasche ziehen und DI-Wasser in die neue Durchstechflasche geben.
    6. Wiederholen Sie Schritt 1.2.2 für alle drei Konzentrationen von Schleimlösungen in ihren jeweiligen Durchstechflaschen (siehe Ergänzende Abbildung 1).
    7. Bewahren Sie die Durchstechflaschen mit der Schleimlösung in einem Kühlschrank auf, bis die Kalibrierung und Prüfung des Rheometers durchgeführt ist.

2. Messungen und Datenerfassung mit einem Rheometer

HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete Software zur Gerätesteuerung und Datenerfassung mit Rheometer ist in der Materialtabelle vermerkt. Diese Software wird als "Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware" bezeichnet.

  1. Richten Sie das Rheometer ein und kalibrieren Sie es.
    1. Schalten Sie die Druckluftversorgung des Rheometers ein und stellen Sie sicher, dass der pneumatische Tisch und das Rheometer mit einem Blasenmessgerät nivelliert sind. Drehen Sie die Schutzkappe am Rheometerschaft ab und halten Sie die Welle beim Abschrauben still.
    2. Schalten Sie die Rheometer-Hauptschalter ein, um die Magnetlager am Rheometer zu aktivieren.
    3. Schalten Sie den Rheometersteuerungscomputer mit der darin installierten Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware ein und starten Sie die Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware (siehe Ergänzende Abbildung 2).
    4. Führen Sie die Gerätekalibrierung durch, indem Sie die Registerkarten "Kalibrierung | Instrument' aus dem Softwarefenster. Wählen Sie die Option' Instrument'. Klicken Sie unter 'Trägheit' auf 'Kalibrieren'. Notieren Sie den Kalibrierwert der Instrumententrägheit in μN.m.s2 und wiederholen Sie die Kalibrierung mindestens 3x, um sicherzustellen, dass die Kalibrierwerte innerhalb von 10 % voneinander liegen (siehe Ergänzende Abbildung 3).
  2. Installieren Sie die Rheometergeometrie auf dem Schaft des Rheometers.
    1. Klicken Sie in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware auf die Registerkarte" Geometrien".
    2. Reinigen Sie den Kegel mit der gewünschten Geometrie (40 mm Durchmesser, 1◦ 0' 11'' Kegel) und Peltierplatte mit Isopropanol (siehe Tabelle 1, Materialtabelle, Abbildung 1und Abbildung 2).
      HINWEIS: Die Peltier plate wird auf dem Rheometer installiert; Es kann mit Isopropanol gereinigt werden, während es direkt am Rheometer befestigt ist.
    3. Stellen Sie sicher, dass die Peltier-Plattenhalterung frei von sichtbarem Staub ist und reinigen Sie sie gegebenenfalls mit Isopropanol. Installieren Sie die Peltierplatte, wenn sie nicht im Rheometer vorinstalliert ist, und schließen Sie die Kühlkörperanschlüsse an.
    4. Drücken Sie die 'Lock-Taste' am Rheometer an der Verriegelungswelle, die mit der Kegelgeometrie verbunden ist. Dies blockiert die Position der Welle, kann sich aber an der Position frei drehen.
    5. Klicken Sie auf 'Smart Swap | Aktiviert' in der Registerkarte Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, um eine automatische Erkennung der Geometrie zu ermöglichen (siehe Ergänzende Abbildung 4).
    6. Drehen Sie die Welle auf dem Rheometer, um die Geometrie zu verschrauben. Die Software erkennt in diesem Stadium die Kegelwinkelgeometrie von 40 mm Durchmesser, 1◦ 0' 11'' (siehe Tabelle 1 und Materialtabelle).
    7. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.5 bis 2.2.6, um sicherzustellen, dass die Geometrie erkannt wird.
    8. Wählen Sie 'Spalt' unter dem 'Control Panel' der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, klicken Sie auf 'Optionen' Symbol und wählen Sie 'Axial force' Option . Stellen Sie die axiale Kraft auf '1 Newton'; Dadurch soll sichergestellt werden, dass die Kegelgeometrie die Peltierplatte für die Nullspaltinitialisierung berührt (siehe Ergänzende Abbildung 5).
  3. Führen Sie die Kalibrierung der Rheometergeometrie durch.
    1. Wählen Sie im Softwarefenster die Registerkarte' Geometrie'. Klicken Sie unter 'Trägheit' auf 'Kalibrieren'. Notieren Sie den Kalibrierwert für die Geometrieträgheit in μN.m.s2 und wiederholen Sie diesen 2-3 Mal, um sicherzustellen, dass die Kalibrierwerte innerhalb von 10% voneinander liegen.
    2. Klicken Sie im Softwarefenster unter 'Reibung' auf 'Kalibrieren'. Notieren Sie den Kalibrierwert für die Geometriereibung in μN.m/(rad/s) und wiederholen Sie diesen 2-3 Mal, um sicherzustellen, dass die Kalibrierwerte innerhalb von 10% voneinander liegen (siehe Ergänzende Abbildung 6).
  4. Ausführen der Null-Lücken-Initialisierung
    HINWEIS: Da die Geometrie nicht genau über die Peltierplatte angehoben werden kann, um Messungen ohne eine Referenzposition "Null" durchzuführen, wird eine Null-Spalt-Initialisierung durchgeführt. Für die Messzwecke hat die Geometrie einen eingebauten Geometriespalt von 24 μm und einen Trimmspalt von 28 μm. Der Trimmspalt ist so eingestellt, dass die überschüssige Flüssigkeit, die außerhalb der Oberfläche der Geometrie auslaufen kann, effektiv gereinigt wird. Diese Lücken sind unerlässlich, um die Daten mit der Probe und dem Rheometer genau zu messen. Der Schritt 2.4.1 ist unbedingt erforderlich, um sicherzustellen, dass die Geometrie auf Nullspalt eingestellt ist, um die Geometrie- und Trimmlücken von 24 μm bzw. 28 μm zu erreichen.
    1. Klicken Sie auf das Symbol 'Zero gap' unter 'Gap' Tab in der 'Systemsteuerung' im Softwarefenster. Die Initialisierung ist abgeschlossen, wenn die axiale Kraft, die von der Geometrie erfahren wird, größer oder gleich 1 N ist, da sie die Peltierplatte berührt. Stellen Sie sicher, dass der Rheometerspalt auf Null gesetzt ist, damit seine Referenzposition korrekt ist (siehe Ergänzende Abbildung 7 und Ergänzende Abbildung 8).
    2. Drücken Sie die Tasten "pfeil nach oben und unten" auf dem Rheometerinstrument oder die Symbole " Geometrieanheben und senken" unter der Registerkarte "Lücke" in der Steuerungssoftware des Rheometerinstruments, um die Geometrie auf eine beliebige Höhe zu heben. Der Kontrollbildschirm des Rheometerinstruments und das Bedienfeld der Steuerungssoftware des Rheometerinstruments zeigen die (gleiche) Spalthöhe an.
  5. Richten Sie das experimentelle Verfahren in der Steuerungssoftware des Rheometerinstruments ein. Führen Sie die Charakterisierung rheologischer Eigenschaften durch, indem Sie eine Kegel-auf-Peltier-Plattengeometrie bei 22 °C verwenden.
    HINWEIS: Die Website des US Geological Survey wurde verwendet, um die Wassertemperatur des Flusses am 20. September 2018 zu bestimmen, als die für die GR-Schleimexperimente verwendeten Silberkarpfen am Hart Creek-Standort36gefischt wurden. Die Temperatur des Schleims kann die rheologischen Eigenschaften beeinflussen. Die Bedeutung der Anpassung der Werte an die Flusstemperatur besteht darin, ungefähr der Temperatur zu entsprechen, unter der die Schleimeigenschaften realistisch geschätzt werden können.
    1. Wählen Sie die Registerkarte "Experimente" in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware und geben Sie die relevanten Informationen wie "Name", "Bediener", "Projekt" usw. ein.  (siehe Ergänzende Abbildung 9)
    2. Wählen Sie die Registerkarte 'Geometrie' und stellen Sie sicher, dass die Informationen mit den Schritten 2.2.5 übereinstimmen. - 2.2.7. (siehe Ergänzende Abbildung 10).
    3. Wählen Sie die Registerkarte 'Prozedur' und verwenden Sie die Pfeiltasten, die '1: Oszillationsamplitude' einrichten. (siehe Ergänzende Abbildung 11).
    4. Initialisieren Sie die Einstellungen für dieUmgebungskontrollewie folgt: "Temperatur = 22 °C"; 'Einweichzeit = 120 s' und aktivieren Sie das Kontrollkästchen 'Auf Temperatur warten' (siehe Ergänzende Abbildung 11).
    5. Initialisieren Sie die Einstellungen 'Testparameter' wie folgt: 'Frequenz = 1 Hz'; Set 'Logarithmischer Sweep'; "Drehmoment = 10 bis 10000 μN.m"; "Punkte pro Jahrzehnt = 5" (siehe Ergänzende Abbildung 11).
  6. Richten Sie das Experiment ein, um den linearen viskoelastischen Bereich (LVR) des Schleims bekannter Konzentration (100 mg / ml) zu bestimmen
    1. Mit einer geeigneten Mikropipette und Pipettenspitze ca. 0,3 ml Fischschleimlösung der Konzentration 100 mg/ml ziehen (siehe Schritt 1.2, Materialtabelle).
    2. Die Schleimlösung wird mit der Mikropipette auf die Peltierplatte einträuft (siehe Abbildung 2).
    3. Drücken Sie die Taste 'Trim Gap' am Rheometer, um die Geometrie auf die Peltierplatte zu senken. Alternativ können Sie in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware unter der Registerkarte "Spalt" in der Option "Systemsteuerung" auf das Symbol " Spalttrimmen" klicken (siehe Ergänzende Abbildung 12).
    4. Verwenden Sie die Mikropipette mit der Pipettenspitze, um überschüssige Schleimlösung zu entfernen und sicherzustellen, dass sich die Flüssigkeit unter der Geometrie befindet, ohne dass sie in der Nähe der Peripherie der Geometrie verschüttet wird.
      HINWEIS: Eine unsachgemäße Beladung der Flüssigkeit führt zu Fehlern bei den Messungen. Untergefüllte Probe verringert die Drehmomentverteilung und übergefüllte Probe führt zu fehlerhaften Spannungsverteilungen aufgrund von Verschütten entlang der Kanten.
    5. Wählen Sie abwechselnd die Registerkarten "Motor' und 'Geschwindigkeit' auf 5 rad/s und 0 rad/s, bis die Probe unterhalb der Geometrie nur minimale Trägheit und Geschwindigkeit aufweist. Der Kontrollbildschirm des Rheometerinstruments und das Bedienfeld der Steuerungssoftware des Rheometerinstruments zeigen die Geschwindigkeit an (siehe Ergänzende Abbildung 13).
    6. Drücken Sie die Taste 'Geometry Gap' auf dem Rheometer, um die Geometrie auf den voreingestellten geeigneten Spalt für die spezifische Geometrie zu senken. Alternativ können Sie in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware unter der Registerkarte "Spalt" in der Option "Systemsteuerung" auf das Symbol "Geometrielücke" klicken (siehe Ergänzende Abbildung 14).
  7. Führen Sie das Experiment durch, um den linearen viskoelastischen Bereich (LVR) des Schleims der bekannten Konzentration (100 mg / ml) zu bestimmen.
    1. Klicken Sie in der Steuerungssoftware des Rheometers auf das Symbol" Start" (siehe Ergänzende Abbildung 15).
      HINWEIS: Das Rheometer führt automatische Messungen durch; Sobald die Taste "Start" gedrückt wird, dauert es ca. 20 Minuten, bis das Rheometer den Test abgeschlossen hat. Die Einstellung "Punkte pro Jahrzehnt" in Schritt 2.5.5 bestimmt, wie viel Zeit das Rheometer benötigt, um Messungen abzuschließen.
    2. Führen Sie das Experiment aus, indem Sie im angezeigten Popup-Fenster auf "Ja" klicken und vorschlagen, dass der Geometrieabstand auf den richtigen Abstand abgesenkt wird, um das Experiment zu starten, falls nicht bereits abgesenkt.
    3. Beobachten Sie das Echtzeitdiagramm, das vom Rheometer generiert wird und die Speicher- (G') und Verlustmodule (G'') meldet.
      HINWEIS: Das G' und G" sind die Speicher- bzw. Verlustmodule. Der Speichermodul stellt die Tendenz des Materials dar, nach spannungsinduzierter Verformung seine ursprüngliche Form wiederzuerlangen und entspricht der Elastizität. Der Verlustmodul stellt das Ausmaß dar, in dem das Material der Strömungsneigung widersteht und ist repräsentativ für die Flüssigkeitsviskosität (siehe Abbildung 4).
    4. Setzen Sie die X-Achse des Diagramms auf 'Oszillationsdehnungsprozentsatz'. Klicken Sie dazu mit der rechten Maustaste auf das angezeigte Diagramm und wählen Sie die Registerkarte "Graphvariablen " (siehe Ergänzende Abbildung 16).
    5. Zeichnen Sie den prozentualen Schwingungsdehnungsbereich aus dem Diagramm auf, bevor das Material in den nichtlinearen viskoelastischen Bereich eintritt, sobald der Test abgeschlossen ist.
    6. Drücken Sie die Tasten "nach oben und unten" auf dem Rheometerinstrument oder " Geometrie erhöhen undsenken" Symbole unter der Registerkarte "Lücke" in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, um die Geometrie auf eine beliebige Höhe über der Peltierplatte zu heben.
    7. Speichern Sie die Datei, die sowohl das experimentelle Verfahren als auch die Ergebnisse enthält, im nativen Dateiformat der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, um die lineare viskoelastische Region (LVR) der Schleimprobe zu ermitteln.
      HINWEIS: Dies kann durch Einstellen der X-Achse des Diagramms auf Dehnungsamplitude (%) und/oder Statische Gleichgewichtsgleichung, Spannungssymbol (σ̄), Diagramm; Schlüssel in der Mechanik. Schwingungsspannung erfolgen, bevor die Daten in den nichtlinearen viskoelastischen Bereich (NLVR) gelangen (siehe Ergänzende Abbildung 16).
  8. Führen Sie die dynamischen Sweeps und Steady-State-Scherraten-Flow-Tests im linearen viskoelastischen Bereich (LVR) für den Schleim der bekannten Konzentration 100, mg / ml durch, um Ergebnisse aus drei unabhängigen Schleimproben von 100 mg / ml zu generieren. Führen Sie diese Schritte an den verfügbaren Schleimkonzentrationsproben einzeln durch.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 2.5.1 – 2.5.4.
    2. Initialisieren Sie die Einstellungen 'Testparameter' wie folgt: 'Frequenz = 1 Hz'; Set 'Logarithmischer Sweep'; "Stamm % = 100 bis 10000 %; "Punkte pro Jahrzehnt = 10".
    3. Wählen Sie die Registerkarte 'Prozedur' und verwenden Sie die Pfeiltasten, die die Prozedur '2: Schwingungsfrequenz' einrichten.
    4. Initialisieren Sie die Einstellungen für dieUmgebungskontrollewie folgt: "Temperatur = 22 °C"; 'Einweichzeit = 0,0 s'.
    5. Initialisieren Sie die Einstellungen 'Testparameter' wie folgt: 'Dehnung % = 1 %'; Set 'Logarithmischer Sweep'; "Frequenz = 20 bis 1 Hz"; "Punkte pro Jahrzehnt = 10".
    6. Wählen Sie die Registerkarte 'Prozedur' und verwenden Sie die Pfeiltasten, um die Prozedur '3: Flow Sweep' einzurichten.
    7. Initialisieren Sie die Einstellungen für dieUmgebungskontrollewie folgt: "Temperatur = 22 °C"; 'Einweichzeit = 0,0 s'.
    8. Initialisieren Sie die Einstellungen 'Testparameter' wie folgt: 'Scherrate = 1 bis 10000 1/s'; "Punkte pro Jahrzehnt = 10"; Kontrollkästchen 'Steady State Sensing'.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 2.7.1 – 2.7.2 und warten Sie, bis das Experiment abgeschlossen ist, etwa 45 Minuten.
    10. Drücken Sie die Bedienelemente "nach oben und unten" auf dem Rheometerinstrument oder die Symbole "Geometrie erhöhen und senken" unter der Registerkarte "Spalt" in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware, um die Geometrie auf eine beliebige Höhe zu heben.
    11. Verwenden Sie Einwegtücher und Handschuhe, um den Schleim auf der Peltierplatte mit Isopropanollösung zu entfernen und zu reinigen (siehe Materialtabelle).
    12. Speichern Sie die Datei, die sowohl das experimentelle Verfahren als auch die Ergebnisse enthält, im nativen Dateiformat der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware.

3. Wiederholen Sie das Protokoll für andere Konzentrationen von Schleimlösungen von 200 mg/ ml und 400 mg / ml.

  1. Führen Sie die Schritte 2.5 – 2.8 einschließlich aller darin aufgeführten Unterschritte für die verbleibenden zwei Konzentrationen von Schleimlösungen, 200 mg/ml und 400 mg/ml, durch.

4. Grafische Darstellung und Datenanalyse

HINWEIS: Der in der zusätzlichen Codedatei bereitgestellte Code führt eine Datenmittelung durch und generiert Wiederholbarkeitsfehler, überlagert die Daten aus allen Experimenten. Die Standardabweichungsberechnungsfunktionen sind in der Software zur Steuerung des Rheometerinstruments nicht verfügbar. Der Code ist in einer Programmiersprache für Datenanalyse, Nachbearbeitung und grafische Darstellung geschrieben (siehe Materialtabelle für Details).

  1. Exportieren Sie die aus Schritt 2.8 generierten Daten über die Schleimkonzentration von 100 mg/ml GR und Schritt 3.1 über die Schleimkonzentrationen von 200 mg/ml und 400 mg/ml GR in tabellenformat, indem Sie auf die Registerkarte 'Datei | | exportieren Excel' in der Rheometer-Instrumentensteuerungssoftware (siehe Ergänzende Abbildung 17).
  2. Führen Sie zusätzliche Codes aus, um Diagramme der scheinbaren Viskosität (η) für variierende Scherdehnungsraten ( ## ρ̇ Gleichungssymbol in der Dynamikanalyse ) und Verlustmodul (G), Speichermodul (G') und Phasenwinkel (δ) für variierende Schwingungsspannungen ( Statische Gleichgewichtsgleichung, Spannungssymbol (σ̄), Diagramm; Schlüssel in der Mechanik. ) zu generieren und repräsentative Ergebnisse zu generieren.

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Ergebnisse

In diesem Abschnitt stellen wir die Ergebnisse der Experimente an GR-Schleim mit einem Rotationsrheometer mit Kegelgeometrie (40 mm Durchmesser, 1° 0' 11'') und einer Peltierplatte vor. Die Experimente halfen bei der Charakterisierung des nicht-newtonschen, scherverdünnenden Verhaltens des GR-Schleims und der scheinbaren Streckgrenze, die den Schleimübergang von einem gelartigen Material zu einem flüssigkeitsähnlichen Material darstellt. Die repräsentativen Ergebnisse beinhalten quantitative Beschreibungen von Drehmoment...

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Diskussion

Eines der Hauptziele bei der Entwicklung dieses Protokolls ist es, festzustellen, dass es sich gut für die rheologische Charakterisierung von GR-Schleim eignet, wenn sehr kleine Probenvolumina verfügbar sind. Wir erkennen an, dass mehr Proben aus einer Schule von Silberkarpfen benötigt werden, um die rheologischen Eigenschaften des GR-Schleims vollständig zu charakterisieren, und die hier vorgestellten Daten stellen keine Verallgemeinerung über die gesamte Silberkarpfenpopulation dar. Unsere Technik ist wegen ihrer Wirks...

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Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte deklariert.

Danksagungen

Die Autoren würdigen die Unterstützung und Finanzierung durch das GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. Wir danken Professor L. Patricia Hernandez vom Department of Biological Sciences der George Washington University für die Inspiration der Untersuchung und die laufende Zusammenarbeit, die Bereitstellung biologischer Expertise zur Physiologie des Silberkarpfens und die Bereitstellung der Schleimproben. Wir danken den Studenten, Herrn David Palumbo, Frau Carly Cohen, Herrn Isaac Finberg, Herrn Dominick Petrosino, Herrn Alexis Renderos, Frau Priscilla Varghese, Herrn Carter Tegen und Herrn Raghav Pajjur für die Hilfe im Labor und Herrn Thomas Evans und Herrn James Thomas von TA Instruments, New Castle, DE für die Unterstützung bei der Ausbildung und Wartung des Rheometers. Die Bilder für die Abbildungen 5A,C wurden während einer Sezierung aufgenommen, die von Professor L. Patricia Hernandez vom Department of Biological Sciences der George Washington University durchgeführt wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Materials
Kim TücherVWR470224-038Zum Reinigen der Probe von
der Platte HandschuheVWR89428-750Zur Vermeidung einer Kontamination der Probe
PipetteVWR89079-974Zum Transport der Probe vom Fläschchen zum Rheometer
PipettenspitzenThermo Scientific72830-042Zum Transport der Probe vom Fläschchen zum Rheometer
SchüttlerVWR89032-094Zum homogenen Mischen der Schleimprobe
FläschchenVWR66008-710Enthält gemessene Probenvolumina
WaageOhausScout – SPX WaagenZum Wiegen der Masse von Schleimproben
Chemische Reagenzien
Deionisiertes Wasser (H20)--Flüssig
steril 70% Isopropanol (C3H8O)VWR89108-162Flüssig
GR Schleim
100 mg/ml-Konzentration, 2ml--Viskoelastisches Material
400 mg/mL Konzentration, 1 mL-Viskoelastisches Material
200 mg/mL Konzentration, 1 mL-Viskoelastisches Material
Software
MATLABMathworksR2017aDatenanalyse, Nachbearbeitung und grafische Darstellung
TriosTA Instrumentsv4.5.042498Steuerungs- und Analysesoftware für Rheometergeräte

Referenzen

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