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Isolierung von L-förmigen Bakterien aus dem Urin mit Hilfe der Filtrationsmethode

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DOI:

10.3791/61380

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13. Juni 2020

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1Centre for Bacterial Cell Biology, Biosciences Institute, Medical School, Newcastle University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Isolierung von L-förmigen Bakterien aus dem Urin unter Verwendung einer Filtrationsmethode vor. Ergänzende Methoden zur Aufbereitung von L-Form-Medium, zur Betrachtung von L-Formen mittels Phasenkontrastmikroskopie und zur Induktion von L-Formen unter Laborbedingungen werden ebenfalls beschrieben.

Zusammenfassung

Es wird angenommen, dass der Übergang von Bakterien in den L-Form-Zustand eine mögliche Rolle bei der Immunevasion und bakteriellen Persistenz während der Behandlung mit Antibiotika spielt, die auf die Zellwand abzielen. Die Isolierung und Handhabung von L-förmigen Bakterien ist jedoch eine Herausforderung, vor allem aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen der Osmolarität. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für die Aufbereitung von L-Form-Medium, die Isolierung von L-Formen aus dem Urin mittels einer Filtrationsmethode, den Nachweis von L-Formen in Urinproben mittels Phasenkontrastmikroskopie und die Induktion von L-Formen in vitro. Die genauen Anforderungen an das Überleben und Wachstum von L-Formen können von Stamm zu Stamm variieren. Daher sollen die hier vorgestellten Methoden als grundlegende Richtlinien für die Etablierung von L-Form-Protokollen innerhalb einzelner Labore und nicht als genaue Anweisungen dienen. Die Filtrationsmethode kann zu einer Verringerung der Anzahl der L-Formen in einer Probe führen und sollte nicht zur Quantifizierung verwendet werden. Es ist jedoch die einzige Methode, die bisher zur effektiven Trennung von Zellwanddefizienten Varianten von ihren wandigen Gegenstücken und zur Identifizierung von Bakterienstämmen verwendet wird, die in der Lage sind, die L-Form bei Patienten mit Harnwegsinfektionen zu wechseln. Die Filtrationsmethode hat das Potenzial, für die Isolierung von L-Formen von Patienten mit anderen Kategorien bakterieller Infektionen und aus Umweltproben angepasst zu werden.

Einleitung

Praktisch alle Bakterien sind von einer Struktur umgeben, die als Zellwand bezeichnet wird. Die Wand ist wichtig zum Schutz vor Umwelteinflüssen, hilft bei der regelmäßigen Teilung und gibt Bakterien ihre Form1. Die Mauer ist jedoch auch ein Ziel für Teile des Immunsystems und einige der besten und am häufigsten verwendeten Antibiotika, einschließlich Penicillin 2,3. Trotz ihrer Bedeutung können sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien gelegentlich ohne die Mauer überleben 4,5,6,7,8. Wenn die Umgebungsbedingungen einen ausreichenden Osmoprotektion bieten, um ein Bersten zu verhindern, und auch Zellwand-Targeting-Wirkstoffe vorhanden sind, können Bakterien in einen wandlosen Zustand übergehen, der als L-Formbezeichnet wird 4,5,6,7,8.

Zahlreiche Berichte deuten darauf hin, dass der Wechsel in einen L-Form-Zustand und zurück in einen gemauerten Zustand in vivo wichtig sein kann, da Bakterien sowohl den Angriff des Wirtsimmunsystems als auch die Behandlung mit Antibiotika überleben können, die auf die Zellwand abzielen 9,10,11,12,13,14,15. Ein solcher Übergang bietet möglicherweise eine leistungsfähige Strategie für das Wiederauftreten bakterieller Infektionen 9,10,11,12,13,14,15. Das Verständnis der grundlegenden Biologie von L-Form-Bakterien und ihrer Interaktionen mit dem Wirt ist entscheidend, um ihre Rolle in der Pathogenese zu entschlüsseln. Der Umgang mit L-förmigen Bakterien ist jedoch eine Herausforderung.

Erstens neigen L-förmige Bakterien aufgrund des Fehlens der Zellwand dazu, als Reaktion auf Veränderungen der Osmolarität zu platzen. Darüber hinaus teilen sich L-Formen sehr unregelmäßig, haben unvorhersehbare Wachstumsmuster (in der Regel viel langsamer als ihre wandigen Gegenstücke) und können sich je nach Dehnung besser auf halbflüssigen Medien als auf festen oder flüssigen Medien ausbreiten. All diese Überlegungen erschweren die Quantifizierung und den Vergleich von Wachstumsraten. Unterschiedliche Bakterienarten (oder sogar Stämme) haben unterschiedliche metabolische Anforderungen an den Wechsel und das Wachstum der L-Form. Zum Beispiel sind L-Formen bestimmter grampositiver Bakterien, die auf aerobe Atmung angewiesen sind, empfindlicher gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies als ihre wandigen Pendants16.

Die Induktion von L-Formen unter Laborbedingungen und im Wirt wird in der Regel durch Zellwand-Targeting-Wirkstoffe wie Antibiotika und Lysozymgesteuert 9. Eine solche Behandlung könnte nur zu einem teilweisen Zellwandverlust führen, und daher könnten einige wandige (oder teilweise wandige) Bakterien in den Proben vorhanden sein, was es schwierig macht, zu unterscheiden, ob die beobachteten experimentellen Ergebnisse auf das Vorhandensein von L-Formen oder wandigen Formen von Bakterien zurückzuführen sind. Die Häufigkeit von L-Formen, die in vivo induziert werden, ist tendenziell gering, was bedeutet, dass sie schwer zu finden und zu isolieren sein können. Schließlich können L-Formen aufgrund ihrer polymorphen Morphologie in situ leicht mit Strukturen eukaryotischen Ursprungs verwechselt werden, wie z. B. apoptotischen Körpern oder verschiedenen Granulaten.

Seit ihrer Entdeckung im Jahr 193517 wurden verschiedene Methoden entwickelt, um L-Formen im Labor zu behandeln. Die meisten von ihnen beruhen auf der Zugabe eines osmoprotektiven Mittels zum Wachstumsmedium; Normalerweise ein Zucker oder ein Salz 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Wie oben erwähnt, treten L-Formen in Patientenproben oft Seite an Seite mit wandigen Bakterien auf, und die Trennung der beiden Populationen kann schwierig sein. Es wurde jedoch gezeigt, dass L-Formen im Gegensatz zu wandigen Bakterien aufgrund ihrer Flexibilität und variablen Größe einen 0,45 μm-Filter passieren können. Ein Verfahren, das einen solchen Filter verwendet, wurde verwendet, um L-Formen aus dem Urin 10,19,20,21 zu isolieren.

Hier stellen wir ein Protokoll für die Isolierung von L-förmigen Bakterien aus dem Urin unter Verwendung einer Filtrationsmethode vor (Abbildung 1). Ergänzende Protokolle für die Herstellung von L-Form-Medium, die mikroskopische Betrachtung von L-Formen und die Induktion von L-Formen in vitro werden ebenfalls beschrieben.

Protokoll

1. Aufbereitung des L-Form-Mediums (LM)

  1. Wiegen Sie Saccharose (Menge, die angepasst wurde, um eine Endkonzentration von 0,58 M zu erreichen), MgSO4 (Endkonzentration 8 mM) und Brain Heart Infusion (BHI) (vom Lieferanten empfohlene Menge) in einer Glasflasche ab, die doppelt so groß ist wie das gewünschte Volumen des Mediums. Zur Herstellung von 0,5 l des Mediums werden 100 g Saccharose, 1 g MgSO4 und 18,5 g BHI abgewogen und in eine 1-Liter-Glasflasche gegeben. Dies ermöglicht eine einfachere Resuspension der Inhaltsstoffe vor dem Autoklavieren.
  2. Wenn feste oder halbfeste Medien benötigt werden, fügen Sie eine gewünschte Menge Agar hinzu. Bei festen Medien fügen Sie 5 g Agar hinzu, um eine Endkonzentration von 1 % in 0,5 l Medium zu erreichen. Bei halbfesten Medien 1 g Agar hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,2 % in 0,5 l Medium zu erreichen.
  3. Mit entionisiertem (DI) Wasser auf das gewünschte Volumen auffüllen.
  4. Die Flasche verschließen und durch Schütteln gut vermischen. Es ist nicht notwendig, die Zutaten vollständig zu resuspendieren, sondern nur darauf zu achten, dass sie am Boden der Flasche nicht verklumpen. Lösen Sie die Kappe und autoklavieren Sie bei einem empfindlichen Medienzyklus (115 °C für 15 min). Es wird empfohlen, die Zutaten vor dem Autoklavieren zu mischen und einen empfindlichen Medienzyklus zu verwenden, um ein Verklumpen der Inhaltsstoffe und eine Saccharosekaramellisierung zu verhindern.
  5. Untersuchen Sie das Medium nach dem Autoklavieren visuell. Es sollten keine Klumpen vorhanden sein und das Medium sollte bernsteinfarben sein (Abbildung 2A).
  6. Lassen Sie das Medium nach dem Autoklavieren auf eine Temperatur abkühlen, die es ermöglicht, die Flasche bequem in der Hand zu halten.
  7. Wenn das Medium für die Induktion von L-Formen benötigt wird, fügen Sie an dieser Stelle ein Antibiotikum und/oder ein Lytikum hinzu (z. B. Phosphomycin in einer Endkonzentration von 400 μg/ml, Penicillin G in einer Endkonzentration von 200 μg/ml, D-Cycloserin in 400 μg/ml, Ampicillin in Höhe von 100 μg/ml, Moenomycin in Höhe von 50 μg/ml, Lysozym in einer Endkonzentration von 100 μg/ml oder Lysostaphin in 5 μg/ml). Empirische Feststellung der Art des L-Form-Induzierenden Mittels (oder der Wirkstoffe, wenn mehr als eines erforderlich ist) und seiner Konzentration für jede der getesteten Bakterienarten.
  8. Tragen Sie zur Herstellung einzelner Aliquoten Handschuhe und arbeiten Sie in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank oder verwenden Sie einen Bunsenbrenner. Die Medien müssen möglicherweise über längere Zeiträume inkubiert werden, und Sterilität ist von größter Bedeutung.
    1. Zur Herstellung von Aliquoten aus festem Medium werden 25 mL in einzelne 92/16 mm Petrischalen umgefüllt und fest werden gelassen. Es wird empfohlen, eine Pipette anstelle von direkten Ausgießplatten zu verwenden, um das Risiko einer Kontamination zu verringern. Trocknen Sie die Platten nicht zu stark.
    2. Zur Herstellung von halbflüssigen Aliquoten werden 5 ml Medium mit einer Pipette in mehrere 30 ml Polystyrol-Universalbehälter überführt und aushärten lassen.
  9. Verwenden Sie das Medium sofort oder lagern Sie es vor der Verwendung bis zu einer Woche bei 4 °C. Überprüfen Sie die Empfehlungen des Herstellers, bevor Sie Medien lagern, die Antibiotika enthalten, da die Konzentration aufgrund des Abbaus der Verbindung im Laufe der Zeit abnehmen kann.

2. Isolierung von L-Formen aus dem Urin

HINWEIS: Tragen Sie während der Laboreingriffe Handschuhe und einen Laborkittel. Arbeiten Sie in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank oder verwenden Sie einen Bunsenbrenner. Tragen Sie während der Filtration eine Sicherheitsbrille.

  1. Mindestens 1 h vor dem vorhergesagten Eintreffen der Urinproben den Arbeitsbereich mit 70 %igem Ethanol abwischen und die erforderliche Anzahl an halbflüssigen LM-Medium-Aliquoten festlegen.
    HINWEIS: Zur Demonstration des Protokolls wird eine Suspension von E. coli ST14410 L-Formen, die im Labor in flüssigem LM-Medium anstelle von menschlichen Urinproben induziert wurde, verwendet.
  2. Wischen Sie den Arbeitsbereich erneut mit 70% Ethanol ab, bevor Sie die Proben verarbeiten. Legen Sie an einer Seite der Bank die gewünschte Anzahl von 0,45 μl Cut-off-Filtern, 20 mL Spritzen und mehrere leere sterile 30 mL Polystyrol Universalbehälter entsprechend der Anzahl der Proben aus. Fügen Sie mehrere Ersatzfilter zu der Anzahl der erwarteten Urinproben hinzu, nur für den Fall, dass mehr als ein Filter benötigt wird, um einige der Proben zu verarbeiten. Legen Sie die LM-Medium-Aliquoten und die leeren sterilen 30-ml-Universalbehälter aus Polystyrol in ein stabiles Gestell in der Mitte der Bank. Wenn parallel eine mikroskopische Untersuchung durchgeführt werden soll, bereiten Sie auch Glasobjektträger, 22 x 22 mm Deckgläser, 2 μL und 1 mL Pipetten, sterile 10 μL und 1 mL Spitzen, sterile 1,5 mL Röhrchen vor und stellen Sie sicher, dass eine Tischmikrozentrifuge zur Verfügung steht.
  3. Transportieren Sie die Urinproben des Spenders so schnell wie möglich nach der Spende ins Labor, um eine mögliche Verschlechterung der L-Form-Bakterien in der Probe zu verhindern.
  4. Ziehen Sie Handschuhe und eine Schutzbrille an, nehmen Sie die Urinproben aus dem Sicherheitsbeutel, besprühen Sie sie mit Ethanol, wischen Sie sie ab und legen Sie sie in das Rack, in der Nähe der LM-Medium-Aliquots und sterilen 30-ml-Ersatzbehälter aus Polystyrol. Verarbeiten Sie ab diesem Zeitpunkt jeweils eine Probe.
  5. Lösen Sie die Kappen eines Röhrchens mit LM-Medium, eines Ersatz-Universalbehälters aus Polystyrol und eines Röhrchens mit Urin.
  6. Nehmen Sie die Spritze aus der Verpackung, entfernen Sie den Kolben und platzieren Sie sie zu Ihrer Rechten.
  7. Ziehen Sie das Sicherheitspapier von der Rückseite der Filterverpackung ab und befestigen Sie die Spritze fest am Filter (bewahren Sie den Filter mit der Vorderseite nach unten in der Kunststoffhalterung des jeweiligen Herstellers auf, um sicherzustellen, dass er steril bleibt).
  8. Gehen Sie schnell, aber vorsichtig vor, entfernen Sie die Kappe von der Tube LM medium und setzen Sie den Filter mit der Spritze auf das Röhrchen.
  9. Entfernen Sie die Kappe von der Urinprobe und gießen Sie ~10 ml vorsichtig in die Spritze (nur 2 ml werden filtriert, aber überschüssiges Volumen verhindert Spritzer), stellen Sie sicher, dass mehr als 1 ml für eine mikroskopische Untersuchung übrig bleibt. Es werden nur 0,5 mL verwendet, aber es ist unpraktisch, ein solches Volumen während der Vorfiltration genau zu messen, daher wird ein ungefähres Überschussvolumen beibehalten.
  10. Setzen Sie den Kolben sehr vorsichtig in die Rückseite der Spritze ein. Ein geringer Widerstand ist zu spüren, bevor der Kolben in eine voll funktionsfähige Position gebracht wird, und es ist leicht, die Probe über diesen Punkt hinaus zu verschütten. Üben Sie mehrmals mit Wasser, bevor Sie Urinproben verarbeiten.
  11. Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben und leiten Sie 2 ml Urin durch den Filter, bis ein zunehmender Widerstand zu spüren ist. Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auszuüben, um zu verhindern, dass die Probe überläuft und der Filter bricht. Wenn die Probe besonders dicht ist und zu viel Widerstand erzeugt, leiten Sie die Probe durch mehrere Filter, anstatt sie durch einen zu zwingen.
  12. Klopfen Sie den Filter vorsichtig gegen das Röhrchen mit dem LM-Medium, um die verbleibende gefilterte Probe zu entfernen, heben Sie den Filter und die Spritze an und setzen Sie die Kappe aus dem 30-ml-Universalbehälter aus Polystyrol schnell auf das Röhrchen mit dem LM-Medium und dem gefilterten Urin, wobei Sie darauf achten, dass die Innenseite des Röhrchens nicht mit dem Rand der Kappe berührt wird. Entsorgen Sie den Filter, die Spritze und den Ersatzbehälter aus Polystyrol sicher.
  13. Inkubieren Sie die Proben in stationärer Position bei 30 °C für bis zu 1 Monat. Auf diese Weise können L-Formen, die den Filter passiert haben, ihre Wände regenerieren und als ummauerte Bakterien zu wachsen beginnen.
  14. Beobachten Sie die Proben jeden Tag auf Anzeichen von Wachstum, indem Sie die Röhrchen mit den gefilterten Proben gegen eine Lichtquelle halten. Bei positiven Proben tritt das Wachstum in der Regel innerhalb von 3 bis 7 Tagen auf.
  15. Sobald der Bewuchs festgestellt wurde, überführen Sie die Probe in eine mikrobiologische Sicherheitswerkbank oder in die Nähe eines Bunsenbrenners. Öffnen Sie die Probe und tauchen Sie sie vorsichtig in eine 5-μl-Kunststoffschlaufe, wobei Sie auf den Wachstumsbereich abzielen, und streifen Sie die Proben dann auf festes Standard-BHI-Medium ohne Osmoschutz, um einzelne Kolonienzu erhalten 22.
  16. Gleichzeitig wird eine kleine Menge der Probe zusammen mit einer Fraktion des halbflüssigen Mediums (~5 μL) mikroskopisch untersucht, wie in Schritt 3 beschrieben. Durch das Übertragen der Probe auf einen mikroskopischen Objektträger zusammen mit dem Medium wird sichergestellt, dass eventuell noch in der Probe vorhandene L-Formen nicht platzen und nachgewiesen werden können. Es wird jedoch erwartet, dass die Mehrheit der Bakterien zu diesem Zeitpunkt zu wandigen Formen zurückgekehrt ist und als normale Stäbchen oder Kokken erscheint.
  17. Die auf den BHI-Platten gestreiften Proben werden über Nacht stationär bei 37 °C inkubiert.
  18. Untersuchen Sie auf Anzeichen von Wachstum, entnehmen Sie mit einer 5-μl-Schleife eine einzelne Kolonie aus jeder Platte und inokulieren Sie sie in 5 ml flüssiges BHI. Über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubieren.
  19. Verwenden Sie die Übernachtkulturen zur Vorbereitung von Glycerinbrühen oder zur Isolierung von DNA für die Speziesidentifizierung mit einer bevorzugten Methode (z. B. Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit).

3. Untersuchung von Urinproben auf das Vorhandensein von L-Formen mittels Phasenkontrastmikroskopie

  1. Geben Sie die restlichen 0,5 mL Urinprobe in ein Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie sie 1 Minute lang bei 8.000 x g in einer Mikrozentrifuge.
  2. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, lassen Sie ca. 20 μl zurück und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es vorsichtig 3 Mal auf und ab pipettieren.
  3. Legen Sie 1 μl auf einen Objektträger aus Glas und decken Sie es mit einem 22 x 22 mm Deckglas ab (um eine 5 μl Probe zu untersuchen (siehe Schritt 2.16), verwenden Sie ein Deckglas von 22 x 50 mm, um sicherzustellen, dass das Deckglas gut auf dem Objektträger haftet). Drücken Sie das Deckglas vorsichtig mit einem sterilen Wattepad nach unten, um eine Abdichtung zu erzeugen und zu überprüfen, ob sich das Deckglas nicht bewegen kann. Entsorge das Wattepad.
  4. Untersuchen Sie den Objektträger mit einem Mikroskop, das mit einem 100-fachen Phasenkontrastobjektiv ausgestattet ist, auf das Vorhandensein von L-Form-ähnlichen Strukturen (Abbildung 3).
    HINWEIS: Um den bakteriellen Ursprung von L-Form-ähnlichen Strukturen in Patientenproben zu bestätigen, wird empfohlen, die Proben durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung von Oligonukleotidsonden zu untersuchen, die spezifisch für bakterielle Sequenzensind 10,23.

4. Induktion von L-Formen in vitro

  1. Streifen Sie wandige Bakterien Ihrer Wahl zu einzelnen Kolonien22 auf einer Platte, die nicht-osmoprotektives Medium (z. B. BHI) enthält, und inkubieren Sie stationär bei 37 °C über Nacht.
  2. Bereiten Sie am nächsten Tag osmoprotektives LM-Medium vor, das L-Form-Induktionsmittel Ihrer Wahl enthält, wie in Schritt 1 beschrieben. Bereiten Sie die gewünschte Anzahl an Platten mit festem Medium vor.
  3. Nehmen Sie mit einer sterilen 5-μl-Plastikschlaufe oder einem Zahnstocher eine großzügige Menge (~4-5 Kolonien wert) aus der nicht osmoprotektiven BHI-Platte, die in der Nacht zuvor inkubiert wurde.
  4. Streifen Sie die Bakterien auf der LM-Platte mit der flachen Oberfläche der Schlaufe (und nicht mit der Kante). Streifen Sie die Bakterien mit einer kontinuierlichen Bewegung am Rand der Platte und drehen Sie die Platte dann um 90°. Berühren Sie die Schlaufe mit dem Rand des ersten Streifens und verteilen Sie den Streifen mit einer kontinuierlichen Bewegung über einen Quadranten der Platte, wobei Sie die Bakterien nach und nach mit mehreren überlappenden Streifen verdünnen (auf Wunsch kann die gesamte Platte verwendet werden). Wenn nur ein Quadrant der Platte verwendet wird, können andere Quadranten für mehrere Induktionen verwendet werden).
    HINWEIS: Abbildung 4A zeigt schematisch die Richtung der Schlierenbildung. Ziel ist es, eine Wuchsfläche zu erhalten, die möglichst viele reine L-Formen und nicht einzelne Völker enthält. Aus diesem Grund ist es nicht erforderlich, die Schleifen zwischen den Streifen zu ändern. Einzelne Kolonien von L-Formen können sehr schwer zu gewinnen sein, und die Verwendung einer zu kleinen Anzahl von Bakterien kann dazu führen, dass überhaupt kein Wachstum der L-Form entsteht. Auf der anderen Seite, wenn zu viele wandige Bakterien für die Induktion verwendet wurden, werden nicht alle Bakterien den Wechsel durchlaufen und einige können die Wand noch behalten. Der beste L-förmige Wachstumsbereich ist in der Regel in der Mitte des Streifens zu erkennen.
  5. Legen Sie die Platte in eine Plastiktüte oder einen anderen Behälter, um ein Austrocknen zu verhindern, und inkubieren Sie bei 30 °C (L-Formen einiger Bakterienarten können unter anaeroben Bedingungen besser wachsen, sodass eine anaerobe Kammer auf ein effizienteres Wachstum der L-Form getestet werden kann). Untersuchen Sie die Platte jeden Tag auf Anzeichen von Wachstum. Dies tritt in der Regel innerhalb von 3 bis 7 Tagen auf. Das Ausmaß des Wachstums ist stammspezifisch. Ein Beispiel für das Wachstum der L-Form ist in Abbildung 4B dargestellt.
  6. Bestätigen Sie das Vorhandensein von L-Formen mit einem Mikroskop. Geben Sie einen 2-μl-Tropfen LM-Medium auf einen mikroskopischen Objektträger und entnehmen Sie mit einer Pipettenspitze eine kleine Menge Zellen aus der Mitte des Streifens und resuspendieren Sie sie in dem Tröpfchen.
    1. Deckel mit einem 22 x 22 mm Deckglas abdecken und mit einem Mikroskop mit einem Objektiv mit 100x Phasenkontrast auf das Vorhandensein von L-Formen untersuchen. Ein repräsentatives Beispiel ist in Abbildung 4C zu finden.

Ergebnisse

L-Form-Medien, die Saccharose enthalten, können nach dem Autoklavieren unterschiedlich stark karamellisiert werden, was mit einer Farbveränderung verbunden ist. Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse von Autoklaviermedien, die Saccharose enthalten. Abbildung 2A zeigt ein typisches Beispiel für LM-Medium, das sich nach dem Autoklavieren bernsteinfarben verfärbt hat. Abbildung 2B zeigt ein typisches Beispiel für 1,16 M Saccharoselösung (2 x Konzentration, die zur Herstellung von LM Medium erforderlich ist) nach dem Autoklavieren. Gelegentlich kann LM-Medium oder Saccharose während des Autoklavierens einer starken Karamellisierung unterzogen werden, und es wird nicht empfohlen, das Medium in diesem Fall zu verwenden. Abbildung 2C zeigt ein Beispiel für überkaramellisiertes Saccharosemedium.

L-Form-Bakterien können sehr heterogen sein, und Abbildung 3 zeigt Beispiele für L-Form-ähnliche Strukturen, die in Urinproben von Patienten beobachtet werden können. Um den bakteriellen Ursprung der in Urinproben gefundenen L-Form-ähnlichen Strukturen zu bestätigen, wird FISH mit Fluoreszenzsonden empfohlen, die auf bakterielle Sequenzen abzielen10,23.

Die unter Laborbedingungen induzierten Wachstumsraten von L-Formen sind stammspezifisch. Abbildung 4B zeigt ein Beispiel für das Wachstum der L-Form von Bacillus subtilis und Abbildung 4C zeigt das mikroskopische Erscheinungsbild der L-Formen, die in Abbildung 4B induziert werden.

Prozess der Urinprobe: Stammidentifizierung, DNA-Isolierung; Das Diagramm zeigt die Inkubation und die Kulturphasen.
Abbildung 1: Isolierung von L-Formen mit Hilfe der Filtrationsmethode – schematische Darstellung. Die Urinprobe wird durch einen 0,45-μm-Filter in einen Polystyrol-Universalbehälter geleitet, der osmoprotektives LM-Medium enthält, das mit 0,2 % Agar versetzt ist. Die Probe wird dann bis zu einem Monat lang in einer stationären Position bei 30 °C inkubiert und täglich visuell auf Anzeichen von Wachstum überprüft. Diese Inkubationszeit ermöglicht es allen in der Probe vorhandenen L-Formen, ihre Zellwände zu regenerieren. Sobald das Wachstum festgestellt wurde, können die Bakterien erneut auf eine Platte gestreift werden, die normales, festes, nicht osmoprotektives Medium (wie Nähragar oder Gehirn-Herz-Infusion) enthält, um einzelne Kolonien zu isolieren, die dann einer DNA-Extraktion und Sequenzierung unterzogen werden können, um die isolierten Bakterienarten zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse von Flüssigkeitenchromatographie-Experimenten; Farbvariationen in den Proben A, B, C.
Abbildung 2: Medien in L-Form. (A) LM-Medium nach dem Autoklavieren. (B) 1,16 M Saccharose (2-fache Konzentration) nach dem Autoklavieren. (C) Stark karamellisiertes LM-Medium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zellmorphologie-Analyse mit Mikroskopbildern A-H; Verschiedene Zellstrukturen, rote Pfeile markieren Merkmale.
Abbildung 3: Beispiele für L-form-ähnliche Strukturen, die im Urin von Patienten mit rezidivierenden Harnwegsinfektionen mittels Phasenkontrastmikroskopie beobachtbar sind. (A,B) Strukturen, die typisch für die Teilung bakterieller L-Formen sind, die im Urin suspendiert sind. (C,D) Strukturen, die typisch für die Teilung bakterieller L-Formen sind, die mit eukaryotischen Zellen assoziiert sind. (E,F) Sichelförmige Struktur, charakteristisch für gramnegative L-Formen (roter Pfeil). (F,G) Strukturen, die typisch für Zwischenstadien des Übergangs zwischen den wandigen Zellen und den L-Formen sind (roter Pfeil in G). (H) Intrazelluläre Vesikel, typisch für große L-Formen. Maßstabsleiste = 5 μm. Diese Zahl wurde von10 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Techniken der Bakterienkultur; Streifenplattendiagramm, Petrischalenschlieren, Mikrokoloniemikroskopbild.
Abbildung 4: Streak-Plate-Technik zur Induktion von L-Formen auf festen Medien. (A) Schematische Darstellung von streifenförmigen Bakterien unter Verwendung einer Viertelplatte zur Induktion von L-Formen. Der Pfeil zeigt die Richtung an, in der die Bakterien gestreift werden sollen. (B) Ein Beispiel für das Wachstum von Bacillus subtilis L-Form nach Streifenbildung, wie in (A) gezeigt, nach 3-tägiger Inkubation bei 30 °C. (C) L-Formen, die in (B) induziert wurden, sichtbar durch Phasenkontrastmikroskopie. Maßstabsleiste = 5 μm. Die Felder B und C wurden von16 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle wurden verwendet, um L-Formen verschiedener Bakterienarten aus dem menschlichen Urin zu isolieren und zu behandeln, darunter E. coli, Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Enterococcus und Enterobacter spp., die alle typischerweise mit Harnwegsinfektionen assoziiert sind10,24. Allerdings funktionieren Methoden zur Behandlung von L-Formen, die in einem Labor etabliert wurden, möglicherweise nicht sofort in einem anderen, und das, was bei einem Bakterienstamm funktioniert, funktioniert möglicherweise nicht bei einem anderen. Daher sind bei den hier beschriebenen Protokollen wahrscheinlich mehrere Versuche und zusätzliche Optimierungen erforderlich. Insbesondere der Nährstoffbedarf, die Sauerstoffverfügbarkeit, die Konzentration des Osmoprotektivums und die Fließfähigkeit des Mediums müssen möglicherweise getestet werden. Die Bedingungen, die für den Übergang und das Wachstum der L-Form optimal sind, könnten sich von den Bedingungen unterscheiden, die für das Wachstum von Wandformen derselben Art optimal sind. Darüber hinaus konnten beim Versuch der Protokolle mehrere technische Probleme auftreten.

Ein häufiges Problem bei der Herstellung von L-Form-Medien ist die Saccharosekaramellisierung nach dem Autoklavieren. Wenn das Medium dunkelbraun wird, sollte es verworfen und eine neue Charge zubereitet werden. Es kann notwendig sein, die Saccharose in einer Flasche in Wasser und die restlichen Zutaten in einer anderen Flasche zuzubereiten, beide in 2-facher Konzentration. 2x konzentrierte Lösungen können dann nach dem Autoklavieren im Verhältnis 1:1 kombiniert werden, um die gewünschten Endkonzentrationen zu erreichen. Separat autoklavierte Saccharose kann sich leicht gelb verfärben (Abbildung 2B), was akzeptabel ist, aber wenn sie dunkelbraun wird (Abbildung 2C), sollte sie nicht für Experimente verwendet werden. Eine Anpassung der Länge und der Temperatur des Autoklavierzyklus kann erforderlich sein, um die Saccharosekaramellisierung zu lindern. Es wird empfohlen, die Sterilität der mit einem angepassten Autoklavzyklus hergestellten Medien zu testen, indem ein Aliquot jedes Mediums mindestens 3 Tage lang bei 37 °C inkubiert wird. Schließlich könnte es notwendig sein, ein alternatives osmoprotektives Mittel, wie z. B. Salz, zu testen, wenn das Problem der Karamellisierung weiterhin besteht18.

Auch bei der Isolierung von L-Formen aus Patientenproben können mehrere Probleme auftreten. Wie im Protokoll erwähnt, können sich die in den Proben vorhandenen L-Formen möglicherweise verschlechtern. Daher ist es wichtig, die Proben so schnell wie möglich nach der Spende ins Labor zu transportieren. Aus dem gleichen Grund wird dringend davon abgeraten, Proben bei niedrigen Temperaturen zu lagern oder die Probenzusammensetzung zu ändern (z. B. durch Zugabe von PBS).

Die Filtrationsmethode selbst hat ihre Grenzen. Einige L-Formen können aufgrund von Scherkräften, die durch die Strömung des Mediums durch den Filter erzeugt werden, auseinandergerissen werden. In der Studie von Mickiewicz et al. passierten nur 41% der L-Formen in Kontrollproben, die laborinduzierte E. coli L-Formen enthielten, den Filter10. Dies zeigt, dass die Filtrationsmethode zu einer Unterschätzung der Anzahl positiver Proben führen kann und für quantitative Studien nicht empfohlen wird.

In sehr seltenen Fällen kann nach der Filtration am nächsten Tag ein signifikantes Wachstum in den Aliquoten der halbflüssigen Medien beobachtet werden, die für die Isolierung der L-Form verwendet werden. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass entweder der Filter während des Protokolls kaputt gegangen ist, wodurch wallige Bakterien passieren konnten, oder dass die Probe kontaminiert war. Es empfiehlt sich, solche Proben zu entsorgen oder zumindest mit Vorsicht zu behandeln. Die tägliche visuelle Untersuchung der Proben ist entscheidend, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Vor der Verarbeitung von Urinproben durch Filtration wird empfohlen, mehrere Proben von laborinduzierten L-Formen, wandigen Bakterien und sterilem Medium durch den Filter der Wahl zu leiten, um die Effizienz der L-Form-Trennung, den möglichen Durchgang von wandigen Bakterien aufgrund von Filterbruch zu kontrollieren und sicherzustellen, dass die verwendete sterile Technik gut funktioniert.

In seltenen Fällen können stabile L-Formen durch Filtration isoliert werden, wobei keine wandigen Formen mikroskopisch nachweisbar sind. Um lebensfähige L-Form-Bakterien zu erhalten, wird empfohlen, mehrere "Loop-Fulls" der Probe in ein Röhrchen mit frischem halbflüssigem LM-Medium zu überführen oder alle 3-7 Tage erneut auf festes osmoprotektives Medium zu streichen, je nach Effizienz des Wachstums. Wenn nach mehreren Passagen keine wandigen Formen auftreten, könnte versucht werden, Proben in 40 % Glycerin bei -80 °C einzufrieren, um das Isolat zu konservieren. Einige L-Formen vertragen ein solches Verfahren jedoch möglicherweise nicht gut.

Trotz ihrer Einschränkungen ist die Filtrationsmethode die einzige, die bisher für die Trennung von L-Formen von walled Formen in Patientenproben verwendet wird. Es ermöglicht die Identifizierung von Bakterienstämmen, die in vivo in der Lage sind, die L-Form zu wechseln. Es besteht das Potenzial, die Filtrationsmethode für die Isolierung von L-Formen aus anderen Arten von menschlichen oder Umweltproben (z. B. Blut oder Pflanzen) zu entwickeln und anzupassen.

Unter Berücksichtigung all der oben genannten Überlegungen empfehlen wir die in diesem Manuskript skizzierten Protokolle als guten Ausgangspunkt für die Entwicklung maßgeschneiderter L-Form-Protokolle in einzelnen Laboratorien und nicht als starre Anweisungen. Die Arbeit mit L-Formen erfordert große Sorgfalt, Hingabe und Geduld, aber mit etwas Übung kann sie äußerst lohnend sein. Wir hoffen, dass die in diesem Manuskript skizzierten Leitlinien zu einem Maßstab für die Entwicklung von L-Form-Protokollen werden und mehr Grundlagen- und klinische Forschungsgruppen dazu ermutigen, diese faszinierenden Bakterienformen zu untersuchen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von einem Europäischen Forschungsrat (Fördernummer 670980) an Jeff Errington (Direktor des Centre for Bacterial Cell Biology, Newcastle University) finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45 &Mikro; L SperrfilterSarstedt83.1826
20 mL SpritzenFisher17955460
30 mL Polystyrol UniversalröhrchenStarlabE1412-3010
92 x 16 mm PetrischalenStarstedt82.1473
AgarOxoidLP0011
AmpicillinSigma-AldrichA9518
Gehirn Herz InfusionOxoidCM1135
Deckgläser (22 x 22 mm, 22 x 50 mm)VWR631-0137/-0125
D-CycloserinSigma-AldrichC6880
Glas-ObjektträgerVWR631-1550P
LysostaphinSigma-AldrichL7386
LysozymSigma-AldrichL4919
MgSO4VWR25165.26
MoenomycinSigma-Aldrich32404
Penicillin GSigma-Aldrich13752
PhosphomycinSigma-AldrichP5396
SaccharoseSigma-Aldrich84100

Referenzen

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