Methodenartikel

Quantitative Echtzeit-PCR-Bewertung von microRNA-Expressions in der Mausniere mit einseitiger ureteraler Obstruktion

DOI:

10.3791/61383

⸱

27. August 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der microRNA-Expression in den Nieren von Mäusen mit einseitiger Harnleiterobstruktion (UUO) durch quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion. Dieses Protokoll eignet sich zur Untersuchung von Nieren-MicroRNA-Expressionsprofilen bei Mäusen mit UUO und im Kontext anderer pathologischer Erkrankungen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) sind einsträngige, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die typischerweise die Genexpression auf posttranskriptionaler Ebene regulieren, indem sie an teilweise komplementäre Zielstandorte in der 3' unübersetzten Region (UTR) von Messenger RNA (mRNA) binden, was die Translation und Stabilität der mRNA reduziert. Die miRNA-Expressionsprofile in verschiedenen Organen und Geweben von Mäusen wurden untersucht, standardmethoden zur Reinigung und Quantifizierung von miRNA in der Mausniere waren jedoch nicht verfügbar. Wir haben eine effektive und zuverlässige Methode zur Extraktion und Bewertung der miRNA-Expression in der Mausniere mit renaler interstitielle Fibrose durch quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) etabliert. Das Protokoll erforderte fünf Schritte: (1) Schaffung von Schein- und einseitigen Harnleiter-Obstruktions-Mäusen (UUO); (2) Extraktion von Nierenproben von den UUO-Mäusen; (3) Extraktion der gesamten RNA, einschließlich miRNA, aus den Nierenproben; (4) komplementäre DNA-Synthese (cDNA) mit umgekehrter Transkription aus miRNA; und (5) qRT-PCR mit dem cDNA. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich bestätigt, dass im Vergleich zu den Kontrollen die Expression von miRNA-3070-3p signifikant erhöht wurde und die von miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p signifikant in den Nieren eines Mausmodells der renalen interstitiellen Fibrose verringert wurden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die miRNA-Expression in den Nieren von Mäusen mit UUO zu bestimmen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) – die kurzen, nicht kodierenden RNAs, die den Abbau und die transkriptionelle Hemmung von Boten-RNA (mRNA)1 verursachen – regulieren nachweislich die Expression verschiedener mRNAs, die sowohl in der Physiologie als auch bei Krankheiten eine entscheidende Rolle spielen (z. B. Entzündungen, Fibrose, Stoffwechselstörungen und Krebs). Einige der miRNAs können daher Kandidaten neuartige Biomarker und therapeutische Ziele für eine Vielzahl von Krankheiten2,3,4,5. Obwohl miRNA-Expressionsprofile in Mausorganen und Geweben einschließlich Gehirn, Herz, Lunge, Leber und Niere beschrieben wurden6,7,8,9,10, gab es keine Standardmethoden für die Extraktion und Bewertung von miRNAs in der Mausniere mit renaler interstitielle Fibrose.

Wir haben ein Protokoll entwickelt, um die Ausdrücke von miRNAs in den Nieren von Mäusen mit renaler interstitielle Fibrose zuverlässig zu reinigen und zu detektieren. Das Protokoll umfasst fünf Hauptschritte, wie folgt. (1) 8 Wochen alte C57BL/6-Mäuse werden in Gruppen von Mäusen eingeteilt, die einer Scheinoperation (Kontrollen) unterzogen werden, und Mäusen, die einer Operation unterzogen werden, die einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) bietet, die mit renaler interstitielle Fibrose verbunden ist. (2) Nierenproben werden aus den Schein- und UUO-Mäusen extrahiert, in einem Siliziumhomogenisator getrennt homogenisiert und dann auf eine Mikrozentrifugen-Spin-Säule11,12in ein Biopolymer-Zerkleinerungssystem übertragen. (3) Die gesamte RNA, die miRNA enthält, wird aus den Nierenproben durch eine Kieselsäuremembran-basierte Spinsäule12,13extrahiert. (4) Mit Dieser extrahierten Gesamt-RNA wird komplementäre DNA (cDNA) aus der gesamten RNA unter Verwendung von Reverse-Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primer14,15synthetisiert. (5) Die Ausdrücke von miRNAs werden durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) mit einem interkalierenden Farbstoff14,15ausgewertet.

Dieses Protokoll basiert auf Untersuchungen, die sinnvolle Extraktionen und Auswertungen von miRNAs in einer Vielzahl von Geweben erhaltenhaben 11,12,13,14,15, und das im Protokoll verwendete Biopolymer-Zerkleinerungssystem wurde 2006 nachweislich hochwertige, gesamte RNA aus Geweben gereinigt12. Darüber hinaus haben frühere Studien die Genauigkeit und Empfindlichkeit von Aspekten des Protokolls (d. h. der cDNA-Synthese mit Reverse-Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primern aus extrahierter Gesamt-RNA) zur Bestimmung der miRNA-Expression durch qRT-PCR mit einem interkalierenden Farbstoff14,15bestätigt. Da das neue Protokoll die Vorteile der Einfachheit, Zeitersparnis und Reduzierung von technischen Fehlern hat, kann das Protokoll in der Forschung verwendet werden, die eine genaue und sensible Identifizierung des miRNA-Profils in der Mausniere erfordert. Darüber hinaus könnte das Protokoll auf Untersuchungen unter vielen pathologischen Bedingungen angewendet werden.

Als nächstes beschreiben wir die Bestimmung der miRNA-Expressionsprofile bei Mäusen mit UUO, die mit renaler interstitielle Fibrose verbunden ist. Beim Menschen, renale interstitielle Fibrose ist ein häufiges und wichtiges Merkmal sowohl der chronischen Nierenerkrankung und im Endstadium Nierenerkrankungen, unabhängig von ihrer Ätiologie16,17. Diese renale interstitielle Fibrose ist mit dem Fortschreiten des Nierenversagens verbunden und zeichnet sich durch erhöhte Ausdrücke extrazellulärer Matrixkomponenten in den interstitiellen Räumen (z.B. Kollagen, Fibronectin und α-glatten Muskelakt)17,18aus.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Tierversuchsprotokolle wurden von der Animal Ethics Committee der Jichi Medical University genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren des Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals durchgeführt.

1. Die Scheinoperation

  1. Bereiten Sie folgende Artikel vor: Isofluran, Korkblatt, Enthaarungscreme, Labortücher, Petrischale mit phosphatgepufferter Saline (PBS), 4-0 Nylon, Pinzette, chirurgische Schere, Wattestäbchen und 8 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse.
  2. Anästhesisieren Sie eine Maus mit 1,5% Isofluran und halten Sie bei 1,5%. Dann tragen Sie Enthaarungscreme auf den Bauch der Maus auf. Nach einigen Minuten die Enthaarungscreme mit einem PBS-getränkten Labortuch abwischen.
  3. 70% Ethanol in den Bauch der Maus injizieren und dann die Maus auf das Korkblatt in die Supine-Position legen.
  4. Mit chirurgischer Schere und Pinzette, machen einen Schnitt in der Haut am Bauch und schneiden Sie den Muskel und peritoneale Membran von der Blase bis zum linken unteren Rand der Rippen.
  5. Befeuchten Sie zwei Wattestäbchen mit PBS und ziehen Sie dann den Darm vorsichtig zur Seite. Legen Sie die befeuchteten Tupfer, um die linke Niere und Harnleiter zu identifizieren.
  6. Schließen Sie die Peritonealmembran und schließen Sie dann den Schnitt mit 4-0 Nylon.

2. Die UUO-Chirurgie

  1. Bereiten Sie folgende Artikel vor: Isofluran, Korkblech, Enthaarungscreme, Labortücher, Petrischale mit PBS, 4-0 Seide, 4-0 Nylon, eine 2,5 ml Spritze, Wattestäbchen, Pinzette, chirurgische Schere und 8 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse.
  2. Anästhesisieren Sie eine Maus mit 1,5% Isofluran und halten Sie bei 1,5%. Dann Enthaarungscreme auf den Bauch der Maus auftragen. Nach einigen Minuten die Enthaarungscreme mit einem PBS-getränkten Labortuch abwischen.
  3. Injizieren Sie 70% Ethanol in die Bauchmaus der Maus und legen Sie die Maus dann in die Supine-Position auf dem Korkblatt.
  4. Mit chirurgischer Schere und Pinzette, machen einen Schnitt in der Haut am Bauch und schneiden Sie den Muskel und peritoneale Membran von der Blase bis zum linken unteren Rand der Rippen.
  5. Legen Sie die 2,5 ml Spritze unter die Maus. Nehmen Sie zwei Wattestäbchen und befeuchten Sie sie mit PBS. Ziehen Sie den Darm vorsichtig zur Seite mit der Pinzette, und legen Sie die befeuchteten Tupfer entsprechend, um den linken Harnleiter zu identifizieren. Heben Sie mit der Pinzette die linke Niere an.
  6. Verwenden Sie die 4-0 Seide, um den linken Harnleiter an zwei Stellen ca. 1 cm auseinander zu ligieren. Schneiden Sie den Harnleiter am Mittelpunkt der beiden Ligationen, und verwenden Sie dann 4-0 Nylon Nähte, um die Peritonealmembran und Inzision zu schließen.

3. Entnahme von Nierenproben

  1. Bereiten Sie folgendes vor: 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre, Isofluran, Korkblech, 70% Ethanol, Petrischale mit PBS, Pinzette und chirurgische Schere.
  2. Anästhesisieren Sie eine Maus mit 1,5% Isofluran und halten Sie bei 1,5%. 70% Ethanol in den Bauch injizieren und die Maus auf das Korkblatt in die Rückenlage legen.
  3. Mit chirurgischer Schere und Pinzette, machen einen Schnitt in der Haut am Bauch und schneiden Sie den Muskel und peritoneale Membran von der Blase bis zum linken unteren Rand der Rippen.
  4. Heben Sie die Peritonealmembran mit der Pinzette an. Mit der chirurgischen Schere, machen Sie einen seitlichen Schnitt am oberen Rand der Peritonealmembran, und setzen Sie den Schnitt entlang der untersten Kante der Rippen.
  5. Als nächstes identifizieren Sie die linke Niere, refluxes sie mit PBS, bis die Niere gelb-weiß wird, um Blut aus den Gefäßen auszuwaschen, und entfernen Sie die Niere, indem Sie die linke Nierenarterie und Vene mit der chirurgischen Schere schneiden. Die Niere in die Petrischale geben und sorgfältig mit PBS waschen.
  6. Schneiden Sie die Niere in 10 mg Proben mit der chirurgischen Schere und Pinzette (10 mg ist eine geeignete Größe für den nächsten Schritt). Legen Sie jedes Stück der Niere in ein eigenes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und schließen Sie die Kappe des Rohres.
  7. Übertragen Sie jedes Mikrozentrifugenrohr in flüssigen Stickstoff und halten Sie die Rohre vor gebrauchen bei 80 °C für eine langfristige Lagerung.

4. Extraktion der gesamten RNA aus den Nierenproben

  1. Bereiten Sie folgende Artikel vor: 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre, 2,0 ml Mikrozentrifugenrohre, 100% Ethanol, Chloroform, Siliziumhomogenisator, Eis, Ein Wirbelmischer, Biopolymer-Spinsäulen in 2,0 ml Sammelröhrchen11,12, membranverankerte Spinsäulen in 2,0 ml Sammelröhrchen12,13, Phenol-/Guanidin-basiertes Lysereage, Waschpuffer mit Guanidin und Ethanol (Waschpuffer 1), Waschpuffer mit Ethanol (Waschpuffer 2) und RNase-freies Wasser.
  2. Legen Sie eine 10 mg Nierenprobe in den Siliziumhomogenisator. 700 l des phenol-guanidinbasierten Lysereagenzes in den Homogenisator geben.
  3. Bereiten Sie den Homogenisator vor und drücken/drehen Sie dann langsam den Stößel des Homogenisators gegen die Nierenprobe, um die Probe zu homogenisieren. Wiederholen Sie das Pressen/Verdrehen, bis die Nierenprobe vollständig im Phenol-/Guanidin-basierten Lysereagenz gelöst ist.
  4. Um die Probe weiter zu homogenisieren, übertragen Sie das homogenisierte Lysat (in einem 2,0 ml Sammelrohr) in die Biopolymer-Spinsäule.
  5. Das homogenisierte Lysat bei 14.000 x g 3 min bei Raumtemperatur (RT) drehen und dann das ausgefällte Lysat in ein ungenutztes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen.
  6. Kombinieren Sie das Lysat im Rohr mit 140 l Chloroform und schließen Sie dann die Rohrkappe fest. Um das Lysat und Chloroform zu mischen, das Rohr 15 Mal invertieren.
    HINWEIS: Das Chloroform kann ohne Haube verwendet werden.
  7. Jede Probe für 2–3 min bei RT inkubieren und dann jede Probe bei 12.000 x g für 15 min bei 4°C drehen.
  8. Ohne den Niederschlag zu stören, übertragen Sie den Überstand (der typischerweise 300 l) auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr überträgt, und fügen Sie dann das 1,5-fache seines Volumens (typischerweise 450 , L) von 100 % Ethanol hinzu. Wirbel die Mischung für 5 s.
  9. Laden Sie 700 l der Probe auf eine membranverankerte Spinsäule in einem 2,0 ml Sammelrohr. Schließen Sie die Spaltenkappe und drehen Sie die Spalte bei 15.000 x g für 15 s. Werfen Sie das gefällte Lysat im Sammelrohr weg.
  10. Waschen Sie die Probe gründlich, indem Sie der membranverankerten Spinsäule in einem 2,0 ml Sammelrohr 700 l Waschpuffer 1 hinzufügen. Schließen Sie die Spaltenkappe, und drehen Sie die Spalte bei 15.000 x g für 15 s. Werfen Sie das gefällte Lysat im Sammelrohr weg.
  11. Laden Sie 500 l Waschpuffer 2 auf die membranverankerte Spinsäule in ein 2,0 ml Sammelrohr, um Spurensalze zu entfernen. Schließen Sie die Spaltenkappe, und drehen Sie die Spalte bei 15.000 x g für 15 s. Werfen Sie das gefällte Lysat im Sammelrohr weg.
    HINWEIS: Eine membranverankerte Spinsäule kann RNA und DNA trennen.
  12. Führen Sie Schritt 4.11 erneut aus.
  13. Drehen Sie die membranverankerte Spinsäule in einem 2,0 ml Sammelrohr 1 min bei 15.000 x g erneut. Werfen Sie das gefällte Lysat im Sammelrohr weg.
  14. Übertragen Sie die membranverankerte Spinsäule in ein neues 1,5 ml Sammelrohr. Lösen Sie die gesamte RNA auf, indem Sie der Säule 30 L RNase-freies Wasser hinzufügen. Schließen Sie die Säulenkappe, und warten Sie 5 min bei Raumtemperatur. Drehen Sie dann die Säule bei 15.000 x g für 1 min.
  15. Übertragen Sie die Gesamtmenge der Probe, die die gesamte RNA enthält, in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Legen Sie jede der Röhren auf Eis und messen Sie die Konzentration der gesamten RNA durch Spektrophotometrie.
  16. Bewahren Sie die Rohre mit Proben bei 80 °C für die Langzeitlagerung vor Gebrauch auf.

5. Synthese von cDNA mit der umgekehrten Transkription der gesamten RNA

ANMERKUNG: Die MIQE-Leitlinien (Minimum Information for the Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) wurden herausgegeben, um bessere experimentelle Verfahren zu fördern und zu zuverlässigen und eindeutigen Ergebnissen beizutragen19. In diesem Protokoll wird cDNA in einem zweistufigen Verfahren mit Reverse-Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primer aus 1,0 g gereinigter Gesamt-RNA synthetisiert.

  1. Bereiten Sie folgendes vor: 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre, acht-Well-Bandrohre mit Kappen, die Kappe jedes achtbandigen Rohres, destilliertes Wasser, Eis, ein Reverse-Transkriptase-Kit (siehe Materialtabelle)14,15 im geschmolzenen Zustand, ein thermischer Cycler und ein Wirbelmischer.
  2. Starten Sie den Thermischen Cycler.
  3. Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung vor: Fügen Sie 2,0 l Reverse-Transkriptase-Mix (im Kit enthalten) und 2,0 l 10x Nukleinsäure-Mix in 4,0 l 5x Hi-Spec-Puffer (um insgesamt 8,0 L Master-Mix pro Tube zu erhalten).
  4. Legen Sie 8,0 l der Master-Mix-Lösung in jedes Rohr eines Acht-Well-Bandrohrs.
  5. Passen Sie die gesamte RNA-Dichte an. Um 1,0 g Gesamt-RNA aus den Nierenproben in 12 l RNase-freiem Wasser zu isolieren, übertragen Sie die entsprechende Menge an Gesamt-RNA in destilliertes Wasser, unter Verwendung der in Schritt 4.15 beschriebenen Dichtedaten.
    HINWEIS: Wenn eine DNA-Kontamination vorliegt, wird die kontaminierte DNA in der qRT-PCR mitverstärkt.
  6. Legen Sie ein 12-L-Aliquot der gesamten RNA in jede Röhre und schließen Sie die Kappe der Röhre. Zentrifugieren Sie das Rohr für 15 x.
  7. Legen Sie das Rohr in den thermischen Cycler und inkubieren Sie die Probe für 60 min bei 37 °C. Als nächstes sofort die Probe für 5 min bei 95 °C für die Synthese von cDNA inkubieren.
  8. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, übertragen Sie die cDNA in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und verdünnen Sie die cDNA zehnmal (1:10) mit destilliertem Wasser. Wirbel und Zentrifugieren sie das Rohr für 5 s.
  9. Die verdünnte cDNA vorübergehend auf Eis aufbewahren und die Proben vor gebrauchen auf 80 °C verschieben.

6. qRT-PCR von miRNA

HINWEIS: Wir haben die Intercalator-Methode verwendet, um die qRT-PCR von miRNA durchzuführen. Primer für RNA sind U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p wurden verwendet.

  1. Bereiten Sie folgendes vor: 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre, ein Wirbelmischer, eine 96-Well-Reaktionsplatte für die qRT-PCR, Klebefolie für die 96-Well-Reaktionsplatte, ein Klebefolienapplikator, ein 96-Well-Zentrifugenrotor, miRNA-spezifische Primer, ein Echtzeit-PCR-Instrument und ein grünes, farbbasiertes PCR-Kit (siehe Materialtisch)14,15 mit 2x PCR-Master-Mix und 10x Universal-Primer.
  2. Nach dem Mischen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren die folgenden Elemente wirbeln: 6,25 l destilliertes Wasser, 1,25 l je 5 M miRNA-Grundierung in Nuklease-freiem Wasser, 12,5 l von 2× PCR-Master-Mix und 2,5 l 10x Universalprimer.
  3. Bereiten Sie die in Schritt 5 beschriebene cDNA vor und schmelzen Sie sie. Vortex und Zentrifugieren der cDNA für 5 s.
  4. Legen Sie einen 22,5 L Aliquot des Reagenzes (erstellt wie in Schritt 6.2 beschrieben) in jeden Brunnen der 96-Well-Platte.
  5. Legen Sie einen 2,5-L-Aliquot cDNA in jede Bohrung der Platte.
  6. Mit dem Klebefolienapplikator den Klebefilm fest auf der 96-Well-Platte festhalten. Zentrifugieren Sie die Platte mit dem 96-Well-Zentrifugenrotor bei 1.000 x g für 30 s, um die Reaktionen an der Unterseite jedes Brunnens zu begleichen.

7. PCR-Zyklus

  1. Starten Sie das Echtzeit-PCR-System, und platzieren Sie die in Schritt 6.6 erstellte Platte. im Echtzeit-PCR-System. Legen Sie die Experimenteigenschaften als Nächstes fest. den Versuchsnamen zu identifizieren. Wählen Sie Folgendes aus: "96-well (0.2 mL)" als Experimenttyp des Systems, "Comparative CT ('CT)' als Quantitationsmethode, "SYBR Green Reagents" als Reagenzien zur Erkennung der Zielsequenz und "Standard" als Systemlauf.
  2. Weisen Sie dem Beispiel und der Ziel-miRNA einen Namen zu, und weisen Sie dann der Probe und der Ziel-miRNA in jedem Brunnen einen Namen zu. Die Proben sollten in zweifacher Ausfertigung zugewiesen werden, um geeignete Daten zur Bestätigung der Ergebnisse zu erhalten. Wählen Sie eine Referenzprobe und eine endogene Kontrolle aus, und wählen Sie "keine" für den Farbstoff aus, der als passive Referenz verwendet werden soll. Stellen Sie sicher, dass Sie die negative Reverse-Transkriptase und die Nicht-Vorlagen-Kontrolle für die miRNA-Expression festlegen, um die Kreuzkontamination von Reagenzien zu beseitigen.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Einstellung des Reaktionsvolumens "20 l" ist und die PCR-Zyklusbedingungen 15 min auf 95 °C eingestellt sind, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 15 s, Glühen bei 55 °C für 30 s und Verlängerung bei 70 °C für 30 s.
  4. Nachdem der qRT-PCR-Prozess abgeschlossen ist, verwenden Sie das Softwareprogramm des Systems, um die qRT-PCR-Daten zu analysieren. Stellen Sie sicher, dass die Schwellenwertzeile, die automatisch vom Softwareprogramm ausgewählt wird, für jeden Brunnen geeignet ist.
  5. Überprüfen Sie den Schwellenwert des Schwellenwerts (CT) der endogenen Kontrolle und zielgerichteten miRNA, die in jeder Probe analysiert werden. Der CT-Wert wird durch den Schnittpunkt der Verstärkungskurve und der Schwellenlinie bestimmt. In der vorliegenden Studie verwendeten wir RNU6-2 als endogene Kontrolle für die Ziel-miRNA-Expressionsebene, und wir verwendeten die Methode "CT", um den relativen Expressionspegel jedes Ziels miRNA20zu bestimmen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein UUO-Mausmodell wurde durch linke Harnleiterligation erstellt, wie21 in 8 Wochen alten männlichen Mäusen mit einem Gewicht von 20–25 g beschrieben. Ureters wurden durch Doppelligation mit 4:0 Seidennähten völlig behindert. Ein Schmerzmittel (Meloxicam 5 mg/kg, subkutane Injektion) wurde vor der Operation und auch täglich an den 2 Tagen nach der Operation verabreicht. Nach 8 Tagen nach der Operation wurden Nieren gesammelt, mit PBS abgerinnen, seziert und zur weiteren Analyse in flüssigem Sticks...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das oben beschriebene Protokoll mit qRT-PCR hat erfolgreich die Expressionsebenen der zielgerichteten miRNAs bestimmt. Die Bewertung der extrahierten miRNAs ist wichtig, wenn man sinnvolle qRT-PCR-Daten erhalten möchte, und um die Qualität der miRNAs vor der Durchführung der qRT-PCR zu bestätigen, sollte das Verhältnis der Absorption bei 260 nm zu dem bei 280 nm mit einem Spektralphotometer überprüft werden. Wenn eine einzelne PCR-Verstärkung der erwarteten Länge und Schmelztemperatur oder eine monomodale Schmelzkurve ni...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Michelle Goody, PhD, von der Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Qiagen79216Waschpuffer 2
Qiagen1067933Waschpuffer 1
Tokyo Laboratory Animals ScienceNicht zugeordnet
Thermo Fisher Scientific431681396-Well-Reaktionsplatte
Thermo Fisher Scientific4311971Klebefolie für 96-Well-Reaktionsplatte
QiagenMS000017015'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen
MS000651415'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3'Qiagen
MS000680675'-UGCAGGGUUUAGUGUAGGG-3'Qiagen
MS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen
217004Membran verankerter Spin Säule in einem 2,0-ml-Sammelröhrchen
Qiagen218161Reverse-Transkriptase-Kit
Qiagen218073Green PCR-Kit
Qiagen79654Biopolymer-Spin-Säulen in einem 2,0-ml-Sammelröhrchen
Qiagen79306Lysereagenz auf Phenol-/Guanidin-Basis
Echtzeit-PCR-Gerät
Thermo Fisher Scientific4472380Software für Echtzeit-PCR-Geräte
Qiagen129112
QiagenMS00033740Nicht offengelegt
Takara Bio9790BSilizium-Homogenisator
ASKULGA04SW
ALS EINER1004NA45-KF2,62 - 9968-32
auf Farbstoffbasis Thermo Fisher Scientific 4472380

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
  2. Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
  3. Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
  4. Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147(2018).
  5. Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. Pathogenesis of liver cirrhosis. World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).
  6. Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645(2014).
  7. Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
  8. Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192(2018).
  9. Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802(2019).
  10. Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
  11. Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
  12. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  13. Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94(2014).
  14. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  15. Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536(2012).
  16. Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
  17. Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
  18. Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  20. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
  21. Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
  22. Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
  23. Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
  24. Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

MicroRNA ExpressionRNA ExtraktioncDNA SynthesemiRNA 3070 3pmiRNA 7218 5pmiRNA 7219 5prenale Fibrose

Verwandte Artikel