RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Summary

Diese Methode demonstriert die Verwendung der nördlichen Hybridisierungstechnik, um miRNAs aus dem gesamten RNA-Extrakt zu detektieren.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse endogen exprimierter nicht-kodierender, 21 nt kleiner RNAs, die an der Regulierung der Genexpression sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren beteiligt sind. Die meisten miRNAs fungieren als negative Schalter der Genexpression, die auf Schlüsselgene abzielen. In Pflanzen werden primäre miRNAs (pri-miRNAs) Transkripte durch RNA-Polymerase II erzeugt und bilden unterschiedliche Längen stabiler Stammschleifenstrukturen, die als pre-miRNAs bezeichnet werden. Eine Endonuklease, Dicer-like1, verarbeitet die pre-miRNAs zu miRNA-miRNA*-Duplexen. Einer der Stränge aus miRNA-miRNA* Duplex wird ausgewählt und auf das Argonaute 1-Protein oder dessen Homologe geladen, um die Spaltung von Ziel-mRNAs zu vermitteln. Obwohl miRNAs wichtige Signalmoleküle sind, wird ihre Detektion oft mit weniger als optimalen PCR-basierten Methoden anstelle einer empfindlichen Nordfleckanalyse durchgeführt. Wir beschreiben eine einfache, zuverlässige und extrem empfindliche nordeuropäische Methode, die ideal für die Quantifizierung von miRNA-Spiegeln mit sehr hoher Empfindlichkeit ist, buchstäblich aus jedem Pflanzengewebe. Zusätzlich kann diese Methode verwendet werden, um die Größe, Stabilität und die Fülle von miRNAs und ihren Vorläufern zu bestätigen.

Introduction

Die jüngste Entdeckung kleiner regulatorischer RNAs, microRNAs, hat die Forschung dazu geführt, sie und ihre Rolle bei Pflanzen und Tieren zu verstehen¹. Lange Vorläufer von miRNAs werden von HYL1 und spezifischen dicer-ähnlichen Proteinen^2,3zu 21 bis 24 nt reifen miRNAs verarbeitet. Eine 22 nt miRNA kann Kaskaden-Silencing initiieren, indem sekundäre siRNAs⁴generiert wird. Studien haben die Rolle von miRNAs und sekundären siRNAs bei der Entwicklung, dem Zellschicksal und den Stressreaktionen^5,6gezeigt.

Protocol

1. Herstellung eines 15% denaturierenden Polyacrylamid-Gels

1. 4,8 g Harnstoff wiegen und hinzufügen, 3,75 ml 40% Acrylamid: Bisacrylamid (19:1) Lösung und 1 ml 10x TBE pH 8,2 in ein steriles 50 ml-Rohr geben.
2. Den Harnstoff mit einem bei 60 °C eingestellten Wasserbad in eine klare Lösung auflösen.
3. Make-up das Volumen auf 10 ml mit frisch autoklaviertem sterilem Wasser und kühlen Sie die Gelmischung auf Raumtemperatur.
4. Bereiten Sie frische 10% (w/v) Ammoniumpersulfatlösung vor.

2. Montage der Glasplatten und Elektrophoreseeinheit

1. Waschen Sie alle Geräte, die für die Gelelektrophorese und E....

Results

In dieser Demonstration haben wir die Expression von miR397 in verschiedenen Geweben von Indica-Reis var whiteponni nachgewiesen und quantifiziert (Abbildung 1). miR397 ist eine 22 nt miRNA und konservierte miRNA. Die Expression von miR397 kann in allen getesteten Proben nachgewiesen werden. Gemäß den Sequenzierungsdaten der nächsten Generation hat Probe 1 (Seedling Tissue) miR397 bei 5 Lesevorgängen pro Million (rpm). Wir haben sein Signal bequem erkannt, was darauf hindeu.......

Discussion

Diese Methode kann ausgiebig für die Detektion und Quantifizierung kleiner RNAs einschließlich weniger reichlich vorhandener miRNAs verwendet werden. Das Protokoll beschreibt hauptsächlich die Schritte zur Denaturierung der gesamten RNA in einem Ladepuffer, Größentrennung durch Gelelektrophorese, Übertragung von RNA auf eine Membran, Vernetzung der RNA auf Membran und Hybridisierung mit gewünschten radioaktiv markierten Oligosonden.

Der entscheidende Schritt für jedes Blotting-Experiment ist d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung	Sigma	A9926
Ammoniumpersulfat (APS)	BioRad	1610700
Löschpapier	whatmann Löschpapier I	1001-125
Bromphenolblau	Sigma	B5525-5G
Kapillarladespitzen	BioRad	2239915
deionisiert Formamid	Ambion	AM9342
Heizblock	Eppendorff	5350
Hybond N+Nylon Membran	GE	RPN203B
Hybridisierungsflasche	Sigma	Z374792-1EA
Hybridisierungsofen	Thermo Scientific	1211V79
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)	Sigma	T7024-25ml
PhosphorImager	GE- Typhoon Scanner 29187194
PhosphorImager Bildschirm und Kassette	GE healthcare	GE28-9564-75
Pipetten	Gilson, Modelle: P20 und P10	FA10002M, FA10003M
Kunststoffpipette	Falcon	357550
Polyacrylamid Gelgerät	BioRad	1658003EDU
Sephadex G-25 Säule	GE Healthcare	27532501
Speed Vac Konzentrator	Thermo Scientific	20-548-130
Spinwin	Tarsons	1010
T4 Polynukleotidkinase (PNK)	NEB	M0201S
Transblot	Gerät BioRad	1703946
ULTRAHyb Hybridisierungspuffer	Ambion	AM8670
Harnstoff	Fischer Scientific	15985
UV-Vernetzer	UVP	CL-1000L
Vortex	Tarsons	3020
Wasserbad	NEOLAB	D-8810
Xylolcyanol	Sigma	X4126-10G