Diese Methode demonstriert die Verwendung der nördlichen Hybridisierungstechnik, um miRNAs aus dem gesamten RNA-Extrakt zu detektieren.
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Diese Methode demonstriert die Verwendung der nördlichen Hybridisierungstechnik, um miRNAs aus dem gesamten RNA-Extrakt zu detektieren.
MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse endogen exprimierter nicht-kodierender, 21 nt kleiner RNAs, die an der Regulierung der Genexpression sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren beteiligt sind. Die meisten miRNAs fungieren als negative Schalter der Genexpression, die auf Schlüsselgene abzielen. In Pflanzen werden primäre miRNAs (pri-miRNAs) Transkripte durch RNA-Polymerase II erzeugt und bilden unterschiedliche Längen stabiler Stammschleifenstrukturen, die als pre-miRNAs bezeichnet werden. Eine Endonuklease, Dicer-like1, verarbeitet die pre-miRNAs zu miRNA-miRNA*-Duplexen. Einer der Stränge aus miRNA-miRNA* Duplex wird ausgewählt und auf das Argonaute 1-Protein oder dessen Homologe geladen, um die Spaltung von Ziel-mRNAs zu vermitteln. Obwohl miRNAs wichtige Signalmoleküle sind, wird ihre Detektion oft mit weniger als optimalen PCR-basierten Methoden anstelle einer empfindlichen Nordfleckanalyse durchgeführt. Wir beschreiben eine einfache, zuverlässige und extrem empfindliche nordeuropäische Methode, die ideal für die Quantifizierung von miRNA-Spiegeln mit sehr hoher Empfindlichkeit ist, buchstäblich aus jedem Pflanzengewebe. Zusätzlich kann diese Methode verwendet werden, um die Größe, Stabilität und die Fülle von miRNAs und ihren Vorläufern zu bestätigen.
Die jüngste Entdeckung kleiner regulatorischer RNAs, microRNAs, hat die Forschung dazu geführt, sie und ihre Rolle bei Pflanzen und Tieren zu verstehen1. Lange Vorläufer von miRNAs werden von HYL1 und spezifischen dicer-ähnlichen Proteinen2,3zu 21 bis 24 nt reifen miRNAs verarbeitet. Eine 22 nt miRNA kann Kaskaden-Silencing initiieren, indem sekundäre siRNAs4generiert wird. Studien haben die Rolle von miRNAs und sekundären siRNAs bei der Entwicklung, dem Zellschicksal und den Stressreaktionen5,6gezeigt.
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1. Herstellung eines 15% denaturierenden Polyacrylamid-Gels
2. Montage der Glasplatten und Elektrophoreseeinheit
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In dieser Demonstration haben wir die Expression von miR397 in verschiedenen Geweben von Indica-Reis var whiteponni nachgewiesen und quantifiziert (Abbildung 1). miR397 ist eine 22 nt miRNA und konservierte miRNA. Die Expression von miR397 kann in allen getesteten Proben nachgewiesen werden. Gemäß den Sequenzierungsdaten der nächsten Generation hat Probe 1 (Seedling Tissue) miR397 bei 5 Lesevorgängen pro Million (rpm). Wir haben sein Signal bequem erkannt, was darauf hindeu.......
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Diese Methode kann ausgiebig für die Detektion und Quantifizierung kleiner RNAs einschließlich weniger reichlich vorhandener miRNAs verwendet werden. Das Protokoll beschreibt hauptsächlich die Schritte zur Denaturierung der gesamten RNA in einem Ladepuffer, Größentrennung durch Gelelektrophorese, Übertragung von RNA auf eine Membran, Vernetzung der RNA auf Membran und Hybridisierung mit gewünschten radioaktiv markierten Oligosonden.
Der entscheidende Schritt für jedes Blotting-Experiment ist d.......
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Keine Interessenkonflikte deklariert.
Die Autoren bestätigen den Zugang zum Strahlenlabor des Gastinstituts und BRIT für Radioisotope. PVS-Labor wird unterstützt vom National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research und Stipendien (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) vom Department of Biotechnology, Government of India. MP erkennt DBT-Research Associateship, DBT, Regierung von Indien.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 40% Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung | Sigma | A9926 | |
| Ammoniumpersulfat (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Löschpapier | whatmann Löschpapier I | 1001-125 | |
| Bromphenolblau | Sigma | B5525-5G | |
| Kapillarladespitzen | BioRad | 2239915 | |
| deionisiert Formamid | Ambion | AM9342 | |
| Heizblock | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+Nylon Membran | GE | RPN203B | |
| Hybridisierungsflasche | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridisierungsofen | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon Scanner 29187194 | ||
| PhosphorImager Bildschirm und Kassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipetten | Gilson, Modelle: P20 und P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Kunststoffpipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamid Gelgerät | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 Säule | GE Healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Konzentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynukleotidkinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot | Gerät BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb Hybridisierungspuffer | Ambion | AM8670 | |
| Harnstoff | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-Vernetzer | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Wasserbad | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylolcyanol | Sigma | X4126-10G |
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