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Methodenartikel

Neisseria meningitidis Infektion von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Gehirnendothelzellen

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DOI:

10.3791/61400

⸱

14. Juli 2020

 ,  ,  , 
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg, 2Department of Biological Sciences, University of Alabama

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

Das hier beschriebene Protokoll zeigt die wichtigsten Schritte bei der Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus gehirnähnlichen Endothelzellen, der Vorbereitung von Neisseria meningitidis auf eine Infektion und der Probenentnahme für andere molekulare Analysen.

Zusammenfassung

Meningokokken-Meningitis ist eine lebensbedrohliche Infektion, die auftritt, wenn Neisseria meningitidis (Meningokokken, Nm) Zugang zum zentralen Nervensystem (ZNS) erlangen kann, indem sie in hochspezialisierte Gehirnendothelzellen (BECs) eindringt. Da es sich bei Nm um einen humanspezifischen Krankheitserreger handelt, macht der Mangel an robusten In-vivo-Modellsystemen die Untersuchung der Wirt-Pathogen-Interaktionen zwischen Nm und BECs schwierig und begründet die Notwendigkeit eines humanbasierten Modells, das native BECs nachahmt. BECs besitzen im Vergleich zu peripheren Endothelzellen, die durch komplexe Tight Junctions und einen erhöhten transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER) gekennzeichnet sind, engere Barriereeigenschaften. Viele In-vitro-Modelle , wie z. B. primäre BECs und immortalisierte BECs, fehlen jedoch entweder oder verlieren schnell ihre Barriereeigenschaften, nachdem sie aus der nativen neuronalen Mikroumgebung entfernt wurden. Jüngste Fortschritte in der humanen Stammzelltechnologie haben Methoden zur Ableitung gehirnähnlicher Endothelzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) entwickelt, die BECs im Vergleich zu anderen In-vitro-Humanmodellen besser phänokopieren. Die Verwendung von iPSC-abgeleiteten BECs (iPSC-BECs) zur Modellierung der Nm-BEC-Interaktion hat den Vorteil, dass menschliche Zellen verwendet werden, die BEC-Barriereeigenschaften besitzen, und kann zur Untersuchung der Barrierezerstörung, der Aktivierung des angeborenen Immunsystems und der bakteriellen Interaktion verwendet werden. Hier zeigen wir, wie man iPSC-BECs aus iPS-Zellen ableiten kann, zusätzlich zur bakteriellen Vorbereitung, Infektion und Probenentnahme für die Analyse.

Einleitung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) und die meningeale Blut-Liquor-Schranke (mBCSFB) sind extrem dichte zelluläre Barrieren, die den Kreislauf vom zentralen Nervensystem (ZNS) trennen und hauptsächlich aus hochspezialisierten Gehirnendothelzellen (BECs) bestehen1,2. Zusammen sorgen BECs für eine ordnungsgemäße Homöostase des Gehirns, indem sie Nährstoffe und Abfallprodukte in und aus dem Gehirn regulieren und gleichzeitig viele Toxine, Medikamente und Krankheitserreger ausschließen 1,2. Eine bakterielle Meningitis tritt auf, wenn durch Blut übertragene Bakterien in der Lage sind, mit der von BECs gebildeten Barriere zu interagieren und diese zu durchdringen und Entzündungen zu verursachen. Neisseria meningitidis (Nm, Meningokokken) ist ein gramnegatives Bakterium, das den Nasenraum von 10 bis 40 % der gesunden Menschen besiedelt, aber in einigen Fällen schwere systemische Erkrankungen verursachen kann3. Bei betroffenen Personen kann Nm Zugang zum Blutkreislauf erhalten, wo es Purpura fulminans verursachen und in BECs eindringen kann, um Zugang zum ZNS zu erhalten, was zu Meningitisführt 3. Nm ist weltweit eine der Hauptursachen für bakterielle Meningitis und trotz Impfbemühungen immer noch eine der Hauptursachen für Meningitis4. Moderne medizinische Eingriffe, wie z. B. die Behandlung mit Antibiotika, haben diese Erkrankungen überlebensfähig gemacht, aber die Betroffenen mit Meningitis bleiben oft mit bleibenden neurologischen Schäden zurück 5,6.

Frühere Studien haben bakterielle Faktoren und Wirtssignale identifiziert, die zu Nm-BEC-Interaktionen beitragen 7,8,9,10,11. Die identifizierten Adhäsine und Invasine wie das Opazitätsprotein Opc und Typ-IV-Pili sowie Rezeptoren wie CD147 wurden an verschiedenen BEC-Modellen in vitro durchgeführt, diesen Modellen fehlen jedoch viele definierende BHS-Eigenschaften7,9,11,12. Ein vollständiges Verständnis der Nm-BEC-Wechselwirkungen ist nach wie vor schwer fassbar, was zum Teil auf die Unfähigkeit, In-vivo-Modelle zu verwenden, den unvollständigen Impfschutz und das Fehlen robuster menschlicher BEC-Modelle in vitro zurückzuführen ist.

Die Modellierung von hBECs in vitro war aufgrund der einzigartigen Eigenschaften von BECs eine Herausforderung. Im Vergleich zu peripheren Endothelzellen weisen BECs eine Reihe von Phänotypen auf, die ihre Barriereeigenschaften verbessern, wie z. B. einen hohen transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER) aufgrund komplexer Tight Junctions12. Einmal aus der Mikroumgebung des Gehirns entfernt, verlieren BECs schnell ihre Barriereeigenschaften, was die Nützlichkeit von primären oder immortalisierten In-vitro-Modellen, die nur eine schwache Barriere bilden, einschränkt12,13. Die Kombination aus der menschlichen Spezifität von Nm-Infektionen, dem Mangel an robusten In-vivo-Modellen und den Herausforderungen bei der Modellierung menschlicher BECs in vitro schafft einen Bedarf an besseren Modellen, um die komplexe Wirt-Pathogen-Interaktion zwischen Nm und BECs zu verstehen. In jüngster Zeit wurden BEC-ähnliche Zellen aus iPS-Zellen abgeleitet, die BECs in vivo besser nachahmen 12,13,14,15. iPSC-BECs sind menschlichen Ursprungs, leicht skalierbar und besitzen im Vergleich zu ihren primären oder immortalisierten Gegenstücken die erwarteten BEC-Phänotypen12,13,14,15. Darüber hinaus haben wir und andere gezeigt, dass iPSC-BECs nützlich sind, um verschiedene Erkrankungen des ZNS zu modellieren, wie z.B. Wirt-Pathogen-Interaktion, Chorea Huntington und MCT8-Mangel, der das Allan-Hurndon-Dudley-Syndrom verursacht 16,17,18,19,20,21. In dieser Arbeit zeigen wir, wie iPSC-BECs aus erneuerbaren iPSC-Quellen abgeleitet werden können und wie die Infektion von iPSC-BECs mit Nm zur Aktivierung der angeborenen Immunantwort führt. Wir glauben, dass dieses Modell nützlich ist, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, die in anderen In-vitro-Modellen nicht rekapituliert werden können, und besonders nützlich ist, wenn Interaktionen mit humanspezifischen Krankheitserregern wie Nm untersucht werden.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Medien-/Reagenzienvorbereitungs-, Stammzellpflege- und Differenzierungsschritte wurden von Stebbins et al.22 übernommen.

1. Vorbereitung der für die iPSC-Kultur und die BEC-Differenzierung erforderlichen Materialien.

  1. Matrixbeschichtung von Gewebekulturkunststoff (TC) für IMR90-4 iPSC-Kultur
    1. Basalmembran-Matrix-Gel (z. B. Matrigel) in 2,5 mg Aliquots aliquotieren und bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, wenn Sie mit dem Matrixgel und dem Aliquot auf Eis umgehen, da es über 4 °C ein Gel bildet und nach dem Erstarren nicht mehr aliquotiert werden kann.
    2. Für die Beschichtung von TC-Kunststoff geben Sie schnell ein Aliquot Matrixgel zu 30 ml Modified Eagle Medium (DMEM)/F12-Medium von Dulbecco in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Geben Sie 1 ml des Mediums auf das gefrorene Matrixgel, pipettieren Sie es auf und ab, bis es aufgetaut ist, und geben Sie es sofort mit dem restlichen Medium in das konische 50-ml-Röhrchen.
    3. Verwenden Sie 1 ml dieser Matrix-Gelbeschichtungslösung pro Well einer 6-Well-Platte und 12 ml pro T75-Kolben.
      HINWEIS: Matrix gelbeschichteter TC-Kunststoff kann bis zu zwei Wochen vor der Verwendung vorbereitet werden. Es ist jedoch wichtig zu vermeiden, dass die Matrix-Gel-Lösung austrocknet, was eine gelegentliche Zugabe von mehr DMEM/F12 auf die Vertiefungen erfordern kann.
  2. Bereiten Sie Stammzell-Erhaltungsmedium vor, indem Sie 50 ml 50-faches Präparat zu 450 ml Stammzell-Erhaltungs-Basalmedium in der sterilen Umgebung einer Biosicherheitswerkbank hinzufügen.
    ANMERKUNG: Andere Stammzellerhaltungsmedien (mTeSR und E8) wurden in anderen Studien verwendet 13,14,15, 22,23,24,25.
  3. Zur Herstellung von 500 ml unkonditioniertem Medium (UM) werden 392,5 ml DMEM/F12 mit 100 ml Knock-out-Serumersatz (KOSR), 5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, L-Glutamin in einer Endkonzentration von 1 mM und 3,5 μl β-Mercaptoethanol kombiniert. Filtersterilisieren und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern.
  4. Zur Herstellung von 200 ml Endothelzellmedium (EC) plus Retinsäure (RA) plus bFGF werden 198 ml humanes endotheliales serumfreies Medium (hESFM), 2 ml filtersterilisiertes, plättchenarmes Serum (PDS) und 20 ng/ml bFGF kombiniert. Filter sterilisieren und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern. Kurz vor der Zugabe zu den Zellen 10 μM RA in das EC-Medium geben.
    HINWEIS: Da PDS eingestellt wurde und daher eingeschränkt sein kann, wurde dieses Protokoll erfolgreich mit B27 anstelle von PDS 15,23,26 durchgeführt.
  5. Um 200 ml EC-Medium ohne RA oder bFGF herzustellen, kombinieren Sie 198 ml hESFM und 2 ml filtersterilisiertes PDS und sterilisieren Sie den Filter. Bis zu 4 Wochen bei 4 °C lagern.

2. Wartung IMR90-4 Zellkultur

HINWEIS: Hier verwenden wir die IMR90-4-Zelllinie als Beispiel, aber auch andere induzierte pluripotente Stammzelllinien wie CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR und CS03iCTRn2 wurden erfolgreich zur Differenzierung in BECs 13,14,15,16,17,23,27,28 eingesetzt.

  1. Kultivieren Sie iPS-Zellen bei 37 °C in 5 % CO 2 und bewahren Sie sie in der Regel auf 6-Well-Platten bei verschiedenen Dichten mit2 ml Stammzell-Erhaltungsmedium pro Well auf.
  2. Um die iPSC-Kultur zu erhalten, wählen Sie eine einzelne Vertiefung für die Passage aus, die nicht konfluiert ist und offene Räume zwischen den Kolonien aufweist.
    1. Das Kulturmedium wird abgesaugt, 1 ml nicht-enzymatisches Zelldissoziationsreagenz hinzugefügt und 7 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Während die Inkubation läuft, ersetzen Sie die Matrix-Gel-Lösung auf einer neuen 6-Well-Platte durch 2 ml frisches Stammzell-Erhaltungsmedium pro Well.
    2. Saugen Sie das Reagenz für die nicht-enzymatische Zelldissoziation vorsichtig an und achten Sie darauf, dass keine Zellen abgesaugt werden, die noch an der Platte haften.
    3. Fügen Sie 6 ml Stammzellen-Erhaltungsmedium hinzu und spülen Sie den Boden der Vertiefung einige Male, bis sich alle Zellen vollständig gelöst haben. Säen Sie dann die neue 6-Well-Platte mit unterschiedlichen Dichten aus, typischerweise 1:6 oder 1:12 für die normale Wartung.
      HINWEIS: Unter Verwendung der oben genannten Verhältnisse werden die Zellen etwa zweimal pro Woche geteilt.
    4. Bewegen Sie die Platte zum Inkubator und verteilen Sie die ausgekeimten Zellen gleichmäßig über die Vertiefungen, indem Sie die Platte hin und her und von links nach rechts schütteln und zwischen den abwechselnden Schüttelbewegungen eine Pause einlegen, bis sich das Medium gesetzt hat.

3. Differenzierung von Gehirnendothelzellen aus humanen iPS-Zellen

  1. Beschichtung von iPS-Zellen zur Differenzierung (Tag -3 des Differenzierungsprotokolls)
    1. Gemäß der IMR90-4-Erhaltungskultur, die zur Platte für die Differenzierung verwendet wird, wird das Kulturmedium abgesaugt, 1 ml enzymatisches Zelldissoziationsreagenz pro Vertiefung hinzugefügt und bei 37 °C für 7 Minuten inkubiert.
    2. Inaktivieren Sie das Reagenz der enzymatischen Zelldissoziation, indem Sie die 1 ml der dissoziierten Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit mindestens 2 ml frischem Stammzellerhaltungsmedium pro 1 ml Zellen überführen. Schleudern Sie die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 1.500 x g herunter.
    3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Stammzellerhaltungsmedium pro Vertiefung der verwendeten IMR90-4-Zellen und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
      HINWEIS: Es kann hilfreich sein, 1:1 mit 0,4% Trypanblau zu verdünnen, um beim Zählen zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Abhängig von der Dichte der iPS-Zellen ergibt eine Vertiefung einer 6-Well-Platte in der Regel 1 bis 106 Zellen.
    4. Für die Differenzierung in einem T75-Kolben werden 7,5 x 105-Zellen in 12 ml Stammzellerhaltungsmedium und ROCK-Inhibitor (Y27632-Dihydrochlorid) in einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben. Die Matrix-Gelbeschichtungslösung wird aus einem T75-Kolben abgesaugt und die Zellsuspension in den Kolben überführt. Die Zellen werden gleichmäßig verteilt, indem der Kolben hin und her und von links nach rechts geschüttelt wird (siehe Schritt 2.2.4) und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert werden.
      HINWEIS: Es ist wichtig, in diesem Schritt einen ROCK-Inhibitor hinzuzufügen, um das Überleben der dissoziierten Einzelstammzellen zu verbessern25,29. Die Zellen sollten gleichmäßig über den Kolben und in Singuletts verteilt sein, die aufgrund der ROCK-Inhibitor-Behandlung eine gespreizte, mesenchymalartige Morphologie aufweisen22.
  2. Wechseln Sie an Tag -2 und Tag -1 das Medium auf frisches Stammzellen-Erhaltungsmedium; 12 ml pro T75.
  3. Beginnen Sie an Tag 0 mit der Differenzierung, indem Sie das Medium auf UM umstellen. 12 ml pro T75.
  4. Wechseln Sie UM täglich (Tag 1 – Tag 5).
    HINWEIS: Die Zellen erreichen in der Regel nach 2 bis 3 Tagen in UM eine Konfluenz, die mit bloßem Auge oder durch ein invertiertes Hellfeldmikroskop beobachtet werden kann. Im weiteren Verlauf der Differenzierung werden nestin+ "Nervenbahnen" mit PECAM-1+ Zellen dazwischen sichtbar, wie zuvor beschrieben13,14.
  5. Selektive Erweiterung der Endothelzellpopulation durch Umstellung auf EC-Medium mit 20 ng/mL bFGF und 10 μM Retinsäure (RA) (Tag 6) und Inkubation für zwei Tage. EC-Medium mit bFGF kann bis zu zwei Wochen vorher zubereitet werden. RA wird am Tag der Anwendung aus gefrorenem Fond zugegeben (z. B. 1 μl 10 mM RA-Stamm pro 1 ml EC + bFGF).
    HINWEIS: Eine erfolgreiche Differenzierung kann auch ohne Supplementierung von RA an den Tagen 6 und 8 erreicht werden. Der Verzicht auf RA führt jedoch zu BECs mit reduziertem TEER12,13,14.
  6. Beschichten Sie Zellkulturplatten und Membraneinsätze (z. B. Transwell) mit Kollagen IV und Fibronektin (Tag 7) zur Aufreinigung der BECs und zur anschließenden Experimentierung.
    1. Für die Beschichtung von Membraneinsätzen 4 Teile Kollagen IV (1 mg/ml in 0,5 mg/ml Essigsäure), 1 Teil Fibronektin (1 mg/ml) und 5 Teile steriles Wasser in Gewebequalität kombinieren. Die ECM-Lösung kann für die Beschichtung von Zellkulturplatten im Verhältnis 1:5 verdünnt werden (d. h. 4 Teile Kollagen IV, 1 Teil Fibronektin, 45 Teile Wasser). Mit Beschichtungslösung bei 37 °C über Nacht inkubieren.
      HINWEIS: Platten und Membraneinsätze können auch mindestens 4 Stunden vor der Subkultivierung am selben Tag des Reinigungsschritts beschichtet werden.
  7. Reinigen Sie BECs durch Subkultivierung der differenzierten Zellen auf Kollagen IV und Fibronektin-beschichteten Platten oder Membraneinsätzen (Tag 8).
    1. EC-Medium absaugen und enzymatisches Zelldissoziationsreagenz (12 ml pro T75) hinzufügen. Bei 37 °C inkubieren, bis sich 90 % der Zellen aus dem Kolben gelöst haben.
      HINWEIS: Die Zelldissoziation kann bis zu 1 h dauern.
    2. Während der Inkubationszeit die Kollagen IV/Fibronektin-Beschichtungslösung von zuvor vorbereiteten Platten/Einsätzen entfernen und in einer sterilen Haube trocknen lassen. Es dauert ca. 20 Minuten, bis die Einlagen getrocknet sind.
    3. Sobald sich die Zellen gelöst haben, waschen Sie sie mit einer 10-ml-Pipette vom Kolben ab. Pipettieren Sie nach oben und unten, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
      HINWEIS: Die Einzelzellsuspension ist wichtig für eine zuverlässige Zellzählung und um feste Monoschichten zu erzielen.
    4. Verdünnen Sie mit mindestens dem gleichen Volumen frischem hESFM in einem konischen 50-ml-Röhrchen und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
    5. Pelletieren Sie die Zellen bei 1.500 x g für 10 Minuten.
    6. Resuspendieren Sie die Zellen in einer geeigneten Menge frisch zubereiteter EC + bFGF + RA, um eine Suspension von 2 x 106 Zellen/ml für die Aussaat auf Membraneinsätzen zu erhalten. Fügen Sie 500 μl (1 x 106 Zellen) auf einen 12-Well-Einsatz und 1,5 ml EC + bFGF + RA-Medium auf die Unterseite hinzu. Für die Aussaat auf 24- und 48-Well-Platten wird die Zellsuspension 1:2 verdünnt und 500 μl (5 x 10 5 Zellen) bzw. 250 μl (2,5 x 105 Zellen) pro Well hinzugefügt. Die Zellen werden gleichmäßig über die Vertiefung/den Einsatz verteilt (siehe Schritt 2.2.4) und bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubiert.
  8. Wechseln Sie das Medium auf Platten/Transwells auf EC ohne bFGF oder RA (Tag 9).
  9. Führen Sie Infektionsexperimente, TEER-Messungen und Immunfluoreszenzfärbungen durch, wie in den folgenden Abschnitten (Tag 10) beschrieben.
    HINWEIS: Erfolgreich differenzierte und gereinigte BECs erreichen in der Regel am 10. Tag den TEER-Spitzenwert und exprimieren charakteristische Marker von Gehirnendothelzellen wie PECAM-1 (CD31) und VE-Cadherin, dem Glukosetransporter GLUT-1, Efflux-Transportern wie p-Glykoprotein und den Tight-Junction-Komponenten ZO-1, Occludin und Claudin-5 13,14,16,17,19,22 . Siehe Lippmann et al., Stebbins et al. und andere für weitere Details und Bilder der Zelltypen, Morphologien und Expression von zelltypspezifischen Markern während des Differenzierungsprozesses 13,14,15,16,17,19,22. Repräsentative Bilder der IMR90-4-Zellen in verschiedenen Stadien des BEC-Differenzierungsprozesses finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

4. Transendothelialer elektrischer Widerstand (TEER) als Maß für die Barrieredichtheit

HINWEIS: TEER wird in der Regel an den Tagen 9 und 10 der Differenzierung auf Membraneinsätzen abgelesen, um die erfolgreiche Generierung barrierebildender iPSC-BECs zu bestätigen (Abbildung 1A).

  1. Platzieren Sie das Epithel-Volt-Ohm-Messgerät (EVOM) in der sterilen Umgebung einer Biosicherheitshaube und verbinden Sie die Elektrode mit dem EVOM.
  2. Desinfizieren Sie die Elektrode, indem Sie sie mindestens 5 Minuten lang in 70% EtOH eintauchen und vollständig trocknen lassen.
    HINWEIS: Bei Bedarf ist eine längere Inkubation in 70% EtOH oder eine Dekontamination der Elektrode mit 5%iger Hypochloritlösung möglich.
  3. Entnehmen Sie die iPSC-BECs auf Membraneinsätzen aus dem Inkubator und messen Sie den TEER.
    HINWEIS: Es ist wichtig, TEER nach der Entnahme aus dem Inkubator schnell abzulesen, da Temperaturänderungen die TEER-Messung beeinträchtigen können.
  4. Lesen Sie TEER ab, indem Sie die Elektrode in das Medium eintauchen, so dass die kürzere Elektrode auf dem Einsatz platziert wird und die längere Elektrode in das Medium um den Einsatz herum reicht.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Elektroden an den Spitzen der "Essstäbchen" vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sind. Kippen Sie bei Bedarf die Vertiefung, um dies zu erreichen, bevor Sie die Platte zum Messen wieder ablegen.

5. Immunfluoreszenzfärbung (IF) zur Validierung des BEC-Phänotyps

HINWEIS: Um die Qualität der vollständig differenzierten und gereinigten Zellen zu validieren, werden iPSC-BEC-Monoschichten am 10. Tag des Differenzierungsprozesses, wie zuvor beschrieben (Abbildung 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22, auf die charakteristischen Marker der Gehirnendothelzellen gefärbt.

  1. Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie es 1x mit PBS.
  2. Fixieren Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol bei Raumtemperatur (RT) für 15 Minuten.
  3. 3x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen und mit 10% fötalem Kälberserum (FBS) in PBS bei RT für 1 h blockieren.
  4. Absaugen und in Blockierungslösung verdünnte Primärantikörper zugeben. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Informationen zur Herkunft und Verdünnung der Antikörper finden Sie in der Materialtabelle und bei Stebbins et al.22.
  5. Waschen Sie 3x mit PBS, bevor Sie sekundäre Antikörper hinzufügen, die in Blockierungslösung verdünnt sind. 1 Stunde bei RT inkubieren. Schützen Sie die Proben ab diesem Zeitpunkt vor Licht.
  6. 2x mit PBS waschen. Dann DAPI in einer Verdünnung von 1:5.000 in PBS zugeben und 15 Minuten lang bei RT färben.
  7. Waschen Sie den PBS 1x eingeschaltet und nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.

6. Zubereitung von Bakterien und Infektion von iPSC-BECs

  1. Am Tag vor dem Infektionsversuch (Tag 9 der Differenzierung) wird eine Nachtkultur der Bakterien aus gefrorenem Bestand gestartet. Bei einer Infektion mit Nm streuen Sie Bakterien auf Columbia-Agar mit 5% Schafsblut (Blut-Agar). Inkubieren Sie Bakterienkulturen bei 37 °C und 5 % CO2 über Nacht.
  2. Bereiten Sie am nächsten Tag (Tag 10) frisches PPM+ zu, indem Sie Protease-Pepton-Medien (PPM) mit 50 μl 2 M MgCl 2, 50 μl2 M NaHCO3 und 100 μl Kellogg's Supplement pro 10 ml ergänzen. Beimpfen Sie 10 ml PPM+-Medium in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit Nm von der Nachtkulturplatte mit einem sterilen Wattestäbchen. Schütteln bei 200 U/min bei 37 °C für 1,5 h inkubieren (d. h. bis sich die Bakterien in der logarithmischen Wachstumsphase befinden).
  3. Bereiten Sie iPSC-BECs während der bakteriellen Inkubation in einer 24-Well-Platte oder auf Membraneinsätzen auf Infektionen vor, indem Sie das alte Medium durch 400 μl frisches EC-Medium (ohne bFGF oder RA) pro Well/Oberseite des Membraneinsatzes ersetzen.
  4. Die Bakterienkultur wird 10 min bei 4000 x g zentrifugiert und das Medium abgesaugt. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 250 μl PBS.
  5. In 4 ml frischem PBS wird ein Teil der bakteriellen Zellsuspension verwendet und auf einen OD600 von 0,4 (ca. 1 x 108 KBE/ml) eingestellt.
  6. Anschließend werden die Bakterien in Zellkulturmedium (EC-Medium) entsprechend der gewünschten Infektionsvielfalt (MOI) verdünnt.
    HINWEIS: Verdünnen Sie z. B. bei einem MOI von 10 1:10 oder 1:5 bei der Infektion von iPSC-BECs in einer 24-Well-Platte bzw. auf Membraneinsätzen (1 x 105 Zellen pro Monoschicht in einer 24-Well-Platte). Die Zugabe von humanem Serum ist nicht in der Vorbereitung von Nm für die Infektion enthalten, wie es in anderen Manuskripten beschrieben wurde, da beobachtet wurde, dass es einen schädlichen Einfluss auf den iPSC-BEC-Barrierephänotyp hat, gemessen durch TEER (Daten nicht gezeigt)30,31. Die Interaktion von Nm und iPSC-BECs ist jedoch mit oder ohne humanes Serum unbeeinflusst (Daten nicht gezeigt).
  7. Die iPSC-BECs werden in jeder Vertiefung mit 100 μl der vorbereiteten Bakteriensuspension infiziert und für den gewünschten Zeitpunkt der Infektion inkubiert.
    ANMERKUNG: Die Expression einer Reihe von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen ist in iPSC-BECs erhöht, wenn sie mit Nm infiziert sind, am deutlichsten nach 8 Stunden Infektion, wie zuvor von Martins-Gomes et al. beschrieben (Abbildung 2)19.

7. Aktivierung des angeborenen Immunsystems durch quantitative PCR

HINWEIS: Sammeln Sie unter Verwendung einer bevorzugten RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und eines qPCR-Protokolls Proben und führen Sie qPCR mit ausgewählten Zytokinen durch.

  1. 7.1. Entnahme der RNA aus BEC-Proben nach der Infektion am 10. Tag des Differenzierungsprotokolls unter Verwendung von Reagenzien aus einem handelsüblichen RNA-Isolierungskit (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine Nuklease-Kontamination der Proben, indem Sie sorgfältig in einer gereinigten und sterilisierten Umgebung arbeiten.
    1. Bereiten Sie den Lysepuffer vor und geben Sie 350 μl in jede Vertiefung/Monoschicht von iPSC-BECs.
    2. Sammeln Sie die Proben, indem Sie mehrmals (z. B. 20x) auf und ab pipettieren und die Suspension in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
      HINWEIS: Die Proben können bei -80 °C gelagert werden, bis sie für die RNA-Isolierung bereit sind.
    3. Befolgen Sie das Protokoll, das mit dem RNA-Isolierungskit für die RNA-Aufreinigung aus kultivierten Zellen und Geweben geliefert wird.
    4. Bewahren Sie die RNA-Proben nach der Elution in nukleasefreiem Wasser auf Eis auf, um eine mögliche RNase-Aktivität zu minimieren.
    5. Schätzen Sie RNA-Konzentrationen auf einem Spektralphotometer (z. B. Nanodrop).
  2. Generieren Sie eine cDNA-Bibliothek aus der gesammelten RNA mit einem cDNA-Synthesekit (siehe Materialtabelle).
    1. Richten Sie Reaktionen ein, die aus einem cDNA-Synthese-Mastermix, mindestens 200 ng (idealerweise 500 ng) Proben-RNA und nukleasefreiem Wasser in einem definierten Gesamtreaktionsvolumen bestehen, wie im Protokoll des cDNA-Synthesekits beschrieben.
    2. Führen Sie auf einem Standard-Thermocycler ein Programm aus, das für die Reagenzien des verwendeten cDNA-Synthesekits geeignet ist. Zum Beispiel: 25 °C für 2 min, 55 °C für 10 min, 95 °C für 1 min.
    3. Nach der Synthese wird die cDNA in nukleasefreiem Wasser bis zu 1:10 verdünnt und die Proben auf 4 °C für kurze Zeit oder -20 °C für die Langzeitlagerung bewegt.
      HINWEIS: Eine niedrigere Verdünnung kann erforderlich sein, wenn die RNA-Konzentration niedrig war (z. B. unter 50 ng). Die verdünnte cDNA kann bei -20 °C bis zu einem Jahr gelagert werden.
  3. Führen Sie qPCR an den cDNA-Proben durch, die auf Transkripte von Genen der angeborenen Immunantwort wie Zytokine und Chemokine abzielen, mit sorgfältig entwickelten und validierten Primern.
    HINWEIS: Da das Primerdesign für die Qualität der qPCR-Ergebnisse sehr wichtig ist, sollte die Wirksamkeit des Primers durch eine Verdünnungsreihe getestet und die Abwesenheit mehrerer Produkte auf einem DNA-Gel bestätigt werden.
    1. Verwenden Sie pro 25-μl-Reaktion 0,5 μl Vorwärts- und 0,5 μl Reverse-Primer (10 mM in nukleasefreiem Wasser), 1 μl cDNA, 10,5 μl nukleasefreieH2O- und 12,5 μl qPCR-Mastermix.
    2. Die Reaktion wird auf einem qPCR-Gerät unter Verwendung des folgenden Cycler-Protokolls durchgeführt: (a) 4 °C für 2 Minuten; b) 95 °C für 15 Minuten, c) 95 °C für 15 s; d) 60 °C für 1 Minute; 45 Mal durch (c) und (d) blättern; e) fakultative Schmelzekurve: 30 bis 99 °C in Schritten von 1 °C; 25 °C für 5 Min.
    3. Verwenden Sie für die Datenanalyse die ΔΔCT-Berechnung, um die Zytokin- und Chemokinexpressionsniveaus mit einem Referenz-Housekeeping-Gen wie 18S oder GAPDH zu vergleichen.

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Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll wurde von Stebbins et al. adaptiert und beleuchtet den Prozess zur Differenzierung von iPS-Zellen in gehirnähnliche Endothelzellen, die BHS-Eigenschaften besitzen, und wie dieses Modell für Infektionsstudien mit iPSC-BECs mit Nm19,22 verwendet werden kann. Die iPSC-BECs weisen bei richtiger Differenzierung enge Barriereeigenschaften auf, die durch TEER gemessen werden und oft größer als 2000 Ω·cm2 sind, und exprimieren e...

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Diskussion

Die Modellierung von BECs und der BHS war mit Herausforderungen verbunden, da primäre und immortalisierte humane BECs in vitro dazu neigen, robuste Barrierephänotypen zu vermissen. Das Aufkommen menschlicher Stammzelltechnologien hat die Erzeugung von iPSC-abgeleiteten BEC-ähnlichen Zellen ermöglicht, die die erwarteten charakteristischen BHS-Phänotypen wie Endothelmarker, Tight-Junction-Expression, Barriereeigenschaften, Reaktion auf andere ZNS-Zelltypen und funktionelle Efflux-Transporter beibehalten 12,13,14,...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

L.M.E. wird durch das DFG-Graduiertenkolleg GRK2157 "3D-Gewebemodelle zur Untersuchung mikrobieller Infektionen durch menschliche Pathogene" gefördert, das an A. S-U. B.J.K. wird durch ein Postdoktorandenstipendium der Alexander von Humboldt-Stiftung gefördert. Darüber hinaus danken wir Lena Wolter für ihre technische Unterstützung bei der Generierung der iPSC-BECs in Kultur.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Accutase (1x)SigmaA6964Reagenz für enzymatische Zelldissoziation
EssigsäureSigmaA6283
All-trans-Retinsäure (RA)SigmaR2625
Anti-CD31 (PECAM-1)Thermo Scientific (Labvision)RB-10333
Anti-Claudin-5Invitrogen4C3C2
Anti-Glut-1Thermo Scientific (Labvision)SPM498 (MA5-11315)
Anti-OccludinInvitrogen33-1500
Anti-VE-CadherinSanta Cruzsc-52751
Anti-ZO-1Invitrogen33-9100
Bacto Proteose PeptonBD211684
b-MercaptoethanolMerck (Sigma-Aldrich)805740
Zellkulturplatten und -flaschen Sarstedt
Zentrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)Thermo Scientific
Klasse II BiosicherheitswerkbankNuaireNU-437-400E
CO2-Inkubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Inkubator)Nuaire
Collagen IVSigmaC5533
Columbia Ager + 5 % SchafblutBiomerieux43049
Costar Transwell Polyesterfilter (12- oder 24-Well)Corning3460, 3470
D(+)-GlucoseMerck (Sigma-Aldrich)G8270
DAPIInvitrogenD1306
DMEM/F12Gibco31330-038
DMSOROTHA994.1
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Gibco21600-069
Epithel-Volt-Ohm-Messgerät (Millicell ERS-2) mit STX-ElektrodeMerck (Millipore)MERS00002
Fe(NO3)3ROTH5632.1
FibronektinSigmaF1141
Fluoreszenzmikroskop (Eclipse Ti)Nikon
Hämazytometer (Neubauer)A. HartensteinZK06
Humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)PeproTech100-18B
Humanes endotheliales Serum Freies Medium (hESFM)Gibco11111-044
Inverses Mikroskop (Wilovert)Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 Zellen
Kellogg'sNahrungsergänzungsmittel bereiten Sie 100 ml 4 g/ml Glukose, 0,1 g/ml Glutamin und 0,2 mg/ml Thiaminpyrophosphat und 10 ml 5 mg/ml Fe(NO3)3 vor und kombinieren Sie die Lösungen. Filter, sterilisieren und aliquotiert bei -20 °C lagern.
Knockout-Serumersatz (KOSR)Gibco10828-028
L-Glutamin (GlutaMAX)Invitrogen35050-038
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010LcDNA-Synthesekit
Matrigel MatrixCorning354230
MethanolROTH4627,5
MgCl2ROTHKK36.1
Mikropipetten (Research Plus)Eppendorf
NaHCO3ROTH6329
Nichtessentielle Aminosäuren (NEAA)Gibco11140-035
NucleoSpin RNA-IsolationskitMachery-Nagel740955RNA-Isolationskit
Pipettenjunge (Accu-Jet Pro)Marke
Thrombozytenarmes Plasma gewonnenes Serum, Rind (PDS)Fisher50-443-029
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25742qPCR Master Mix
qPCR Film (MicroAmp Optical Adhesive Film)Applied Biosystems4211971
qPCR Platten (MicroAmp Fast 96-Well)Applied Biosystems4346907
ROCK-Inhibitor, Y27632 DihydrochloridTocris1254
RT-PCR Thermocycler (StepOnePlus)Applied Biosystems4376600
Serologische PipettenSarstedt
StemFlex Basalmedium + 50x StemFlex SupplementGibcoA3349401Stammzellerhaltungsmedium
Schwingender Schaufelrotor (Heraeus #2704)Thermo Scientific
ThiaminpyrophosphatSigmaC8754-5G
Trypanblau-Lösung, 0,4Gibco15250061 Versene
Gibco15040-033Nicht-enzymatisches Zelldissoziationsreagenz (EDTA)
ZurHerstellung von 110 ml%

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

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aus iPSC gewonnene HirnendothelzellenBlut-Hirn-Schranken-Modelltransendothelialer elektrischer WiderstandStammzelldifferenzierungEndothelzellmarkerProtokoll zur bakteriellen PräparationErhaltung der ZellkulturAnalyse der BarriereeigenschaftenWirt-Pathogen-Interaktion
Neisseria meningitidis Infektion von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Gehirnendothelzellen
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