Methodenartikel

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

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DOI:

10.3791/61403

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7. Oktober 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier werden vier Methoden zur Erzeugung von Hodenorganoiden aus primären neonatalen murinen Hodenzellzellen beschrieben, d.h. extrazelluläre Matrix (ECM) und ECM-freie 2D- und 3D-Kulturumgebungen. Diese Techniken haben mehrere Forschungsanwendungen und sind besonders nützlich für das Studium der Hodenentwicklung und Physiologie in vitro.

Zusammenfassung

Hodenorganoide bieten ein Werkzeug für die Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Endokrinologie in vitro. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um Hodenorganoide zu erstellen. Viele dieser Methoden verlassen sich auf extrazelluläre Matrix (ECM), um de novo Gewebe-Montage zu fördern, jedoch gibt es Unterschiede zwischen Denkmethoden in Bezug auf biomimetische Morphologie und Funktion des Gewebes. Darüber hinaus gibt es nur wenige direkte Vergleiche veröffentlichter Methoden. Hier wird ein direkter Vergleich durch die Untersuchung von Unterschieden in Organoid-Generierungsprotokollen, mit bereitgestellten Ergebnissen gemacht. Vier archetypische Erzeugungsmethoden: (1) 2D ECM-frei, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-frei und (4) 3D-ECM-Kultur werden beschrieben. Zur Beurteilung der Hodenorganoid-Erzeugung wurden drei primäre Benchmarks verwendet. Dabei handelt es sich um zelluläre Selbstmontage, Die Einbeziehung wichtiger Zelltypen (Sertoli, Leydig, Keime und peritubäre Zellen) und entsprechend abgeschottete Gewebearchitektur. Von den vier getesteten Umgebungen erzeugten 2D ECM- und 3D-ECM-freie Kulturen Organoide mit internen Morphologien, die nativen Hoden am ähnlichsten sind, einschließlich der De-Novo-Abschottung von röhrenförmigen versus interstitiellen Zelltypen, der Entwicklung von Tubule-ähnlichen Strukturen und einer etablierten langfristigen endokrinen Funktion. Alle untersuchten Methoden nutzten unsortierte, primäre murine Hodenzellsuspensionen und nutzten allgemein zugängliche Kulturressourcen. Diese Hodenorganoid-Generierungstechniken bieten ein hochzugängliches und reproduzierbares Toolkit für Forschungsinitiativen zur Hodenorganogenese und Physiologie in vitro.

Einleitung

Hodenorganoide sind eine bahnbrechende Technik zur Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Physiologie in vitro1,2,3,4. Mehrere Methoden wurden für die Organoid-Generierung erforscht; Dazu gehören eine Vielzahl von extrazellulären Matrix- (ECM) und ECM-freien Kultursystemen, sowohl in zweidimensionalen (2D) als auch dreidimensionalen (3D) Ausrichtungen. Unterschiedliche Erzeugungsmethoden können unterschiedliche zelluläre Montagestrategien fördern; Dies führt zu einer hohen morphologischen und funktionellen Variabilität zwischen veröffentlichten Organoidmodellen. Der Zweck dieses Artikels ist es, den aktuellen Zustand von In-vitro-Hodenmodellen zu diskutieren und als Vorlage für zukünftige Forscher bei der Entwicklung von Hodenorganoidexperimenten zu dienen. In der vorliegenden Studie werden vier verschiedene Kultursystemarchetypen definiert und in experimentellen Prozess- und biologischen Ergebnissen charakterisiert. Dazu gehören: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free und 3D ECM Kulturmethoden. Die hier vorgestellten Strategien sollen einfach, zugänglich und zwischen verschiedenen Laboratorien und Forschungsgruppen hochgradig reproduzierbar sein.

Historisch für die Hoden, die Bezeichnung "in vitro", wurde für mehrere verschiedene Kulturmethoden von Hodengeweben und -zellen verwendet. Dazu gehören organotypische Gewebe-/Organkulturmethoden (d.h. Explantkultur)5, isolierte seminiferöse Tubulenkultur6, Hodenzellkultur7und Methoden der de novo Gewebemorphogenese (d.h. biologische Konstrukte und Organoide)1. Die ersten Untersuchungen zur In-vitro-Spermatogenese wurden vor etwa 100 Jahren mit der Kultur der Kaninchen-Hodenexplantationen 19208und später 1937 mit Mausexplantationen9durchgeführt. Innerhalb dieser ersten Experimente wurden Spermatogonien beobachtet, die in der ersten Kulturwoche weitgehend degenerierten, obwohl einige meiotisch differenzierende Zellen identifiziert wurden. Erinnert an diese historischen Berichte, wurde die Testis-Explantationskultur 2011 wiederbelebt und optimiert, um eine praktikable Technik zum Studium der Hoden10zu werden. Seit 2011 hat explant kultur Fruchtbarkeit kompetente Spermien in mehreren Berichten produziert11,12,13. Doch aufgrund der Abhängigkeit der Explant-Kultur von bereits existierenden nativen Hobules werden diese jüngsten Fortschritte genauer als Beispiele für "ex vivo" Hodenfunktion und Spermatogenese beschrieben, Gewebefunktion, die bei der Entfernung aus dem Körper eines Organismus beibehalten oder wieder aufgenommen wurde. Trotz seiner Prävalenz in der Literatur, langfristige Keimzellerhaltung und Differenzierung innerhalb hoden Explants ist eine Herausforderung zu replizieren14,15,16,17,18, vor allem über Zeitrahmen lang genug, um vollständig zu beobachten In-vitro-Spermatogenese (35 Tage bei Mäusen19 und 74 beim Menschen20). Es ist faszinierend zu erkennen, dass viele der gleichen Herausforderungen, die vor 100 Jahren erlebt wurden, noch heute in der ex vivo Spermatogenese erlebt werden.

Im Unterscheidet sich von Ex-vivo-Ansätzen sind Hodenorganoide de novo zusammengesetzte Mikrotissues, die vollständig in vitro aus zellulären Quellen (d. h. primären Hodenzellen) erzeugt werden. Hodenorganoide bieten eine kreative Strategie, um die historische Abhängigkeit des Feldes von bereits vorhandenem nativem Gewebe zu umgehen und die Hodenbiologie vollständig in vitro zu rekapitulieren. Es gibt mehrere Anforderungen, die von den meisten organoiden Gewebemodellen geteilt werden; Dazu gehören (1) in vivo-mimetische Gewebemorphologie oder Architektur, (2) mehrere Hauptzelltypen des dargestellten Gewebes, (3) Selbstmontage oder Selbstorganisation in ihrer Erzeugung und (4) die Fähigkeit, eine gewisse Ebene der Funktion des dargestellten Gewebes und der Physiologie zu simulieren21,22,23,24. Für die Hoden kann dies in vier Hauptmerkmalen erfasst werden: (1) die Einbeziehung von Haupthodenzelltypen, Keim, Sertoli, Leydig, peritubular und andere interstitielle Zellen, (2) zellgesteuerte Gewebeanordnung, (3) entsprechend kompartalisierte Zelltypen in separate röhrenförmige Kompartimente (Keim und Sertoli) und interstitielle Regionen (alle anderen Zelltypen) und (4) ein gewisses Maß an Gewebefunktion (z. B. Reproduktivhormonsekretion oder Gewebereaktionen und Zellabhängigkeit). Unter Berücksichtigung der historischen Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der Keimzelldifferenzierung ex vivo und in vitro sind die Rekapitulation in vivo-mimetischer Hodenarchitekturen (d. h. Strukturen, die seminiferous tubulis ähneln) mit zusätzlichen Markern, die auf die Simulation der Hodenphysiologie (z. B. endokrine Funktion) hindeuten, vorrangige Meilensteine zur Erzeugung von Organoiden, die eines Tages die in vitro erhaltene Spermatogenese aufrechterhalten könnten.

Die meisten veröffentlichten Hodenorganoid-Methoden nutzen kommerziell erhältliche ECM (z.B. Kollagen oder proprietäre ECM-Formulierungen)25,26,27 oder kundenspezifische ECMs (d.h. dezelluläre Hoden ECM-abgeleitete Hydrogele)28,29,30. Exogenes ECM fördert die De-Novo-Gewebebildung durch bereitstellung eines Montage-unterstützenden Gerüstes für die Gewebebildung. ECM-Methoden haben ein beeindruckendes Maß an Gewebebildung ermöglicht, einschließlich einiger Keimzellpräsenz und gewebemimetischer Morphologie25,28. Die von ihnen verwendeten ECMs sind jedoch nicht immer universell verfügbar (d. h. dezellularisierte ECM-abgeleitete Hydrogele), und einige Methoden erfordern ausgeklügelte Gel- und Zellsaatausrichtungen (z. B. 3-Schicht-Gradienten des ECM- und 3D-Drucks)25,31,32. Gerüstfreie Methoden (z.B. hängende Tropfen und nicht haftende Kulturplatten)33,34,35 haben auch robuste und hoch reproduzierbare Organoide ohne ECM-Gele oder Gerüste erzeugt. Jedoch, die Gewebemorphologie dieser Gerüst-freien Organoide ist oft unähnlich zu in vivo Hoden, und die meisten dieser Berichte enthalten eine biochemische ECM-Additiv zur Förderung der Gewebebildung33,34,36, oder alternativ, verlassen sich auf Zentrifugierung für erzwungene Zellaggregation und Verdichtung34, so dass sie weniger ideal für die Untersuchung zellgesteuerte Migration und Selbstorganisation.

Die vier in diesem Manuskript vorgestellten Organoid-Generierungsmethoden umfassen sowohl ECM-abhängige als auch unabhängige Strategien, die jeweils eine einfache Zellaussaat verwenden, die die Beobachtung der zellgesteuerten organoiden Selbstmontage ermöglicht. Alle vier Techniken können aus denselben Zellsuspensionen ausgeführt werden oder benutzerdefinierte und zelltypangereicherte Populationen verwenden. Eine Stärke dieser Methoden ist die Fähigkeit, Organoide in Echtzeit selbst zu beobachten und direkt zu vergleichen, wie hodenförmige Strukturen sich zwischen verschiedenen Kulturmikroumgebungen selbst zusammensetzen. Die phänotischen Unterschiede zwischen diesen vier Kulturmethoden sollten wegen ihrer Auswirkungen auf die Forschungsfrage oder das Thema des Prüfers berücksichtigt werden. Jede Methode produziert biologische Konstrukte oder Organoide innerhalb von 24 h oder weniger. Zusammenfassend lassen sich sagen, dass die hier vorgestellten Methoden ein Toolkit von organoiden Montagetechniken zum Studium der Hodenorganoid-Montage, Gewebeentwicklung und Hodenphysiologie in vitro bieten.

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Protokoll

Alle Mausexperimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Northwestern University genehmigt, und alle Verfahren wurden nach von der IACUC zugelassenen Protokollen durchgeführt.

1. Vorbereitung von enzymatischen Gewebedissoziationslösungen

  1. Verwenden Sie zwei verschiedene enzymatische Lösungen (Lösung 1 und Lösung 2), die beide mit einer Basalkultur-Medium-Lösung (BM) hergestellt werden.
  2. Zur Herstellung von BM serum und penicillin-streptomycin zu den minimalen essentiellen mittleren bis endgültigen Konzentrationen von 10% bzw. 1% hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien für spezifische Reagenzien). Anschließend filtert steril das BM durch einen 0,22-m-Filter. Vor der Anwendung mit Zellen steriles BM auf einen neutralen pH-Wert voraussetzen, indem man in2 eine Kulturschale ausgibt und in einen befeuchteten, 5% CO2-Inkubator bei 37 °C für mindestens 1 h legt.
    HINWEIS: BM kann bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden, danach sollte frisches BM hergestellt werden.
  3. Um Kollagennase zu zubereiten, lösen Sie zunächst 100 mg Kollagenase I in 1 ml sterilen Embryo gradH2O (Endkonzentration 10% m/v), invertieren oder wirbeln, um sich aufzulösen, und lagern Sie 20 l Aliquots bei -20 °C für die spätere Anwendung. Aliquots sollten nur einmal aufgetaut werden.
  4. Zur Herstellung von Desoxyribonuclease I (DNase I) Stocklösungen 20 mg DNase I in 1 ml sterilen Embryo GradH2O (Endkonzentration 2% m/v), invertieren oder wirbeln, um sich aufzulösen (nicht wirbeln), und 20 L Aliquots bei -20 °C für die spätere Anwendung lagern. Aliquots sollten nur einmal aufgetaut werden.
  5. Für Hyaluronidase-Stammlösungen 30 mg in 1 ml steriler Phosphatgepufferte Salzsäure (PBS; Endkonzentration 3% m/v Hyaluronidase in PBS enthaltend Ca++/Mg++), invertieren oder wirbeln, um sich aufzulösen, und 100 L Aliquots bei -20 °C für die spätere Verwendung aufbewahren. Aliquots können mehrmals aufgetaut und wieder eingefroren werden, ohne die enzymatische Aktivität zu verlieren.
  6. Zur Herstellung der Dissoziation Solution 1fügen Sie 10 l Kollagennase I und 10 l DNase I in 1 ml sterilen, vorausgeglichenen BM hinzu (Endkonzentrationen: 1 mg/ml Kollagennase I und 5 g/ml DNase I). Trituieren Sie vorsichtig mit einer Pipette, um die Lösung zu mischen, und vorerwärmen auf 37 °C vor der Verwendung mit dem Gewebe.
    HINWEIS: Lösung 2 wird durch Zugabe von 33 l Hyaluronidase (vorgewärmt auf 37 °C) pro 1 ml Lösung 1 (auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml) hergestellt. Dies geschieht auf halbem Weg durch enzymatische Dissoziation von Hodengewebe bei Schritt 2.5 unten.

2. Testisgewebe-Dissoziation

HINWEIS: Alle Mäuse wurden in Polypropylenkäfigen untergebracht und mit Nahrung und Wasser ad libitum versorgt. Die Tiere wurden mit bestrahltem Chow gefüttert, das keine Phytoöstrogene enthält. Juvenile CD-1-Mäuse, 5 Tage nach dem Partum (dpp), wurden für alle Experimente verwendet und vor der Euthanasie und Gewebesammlung betäuisiert, innerhalb einer Anästhesiekammer, die an einem Isofluran-Verdampfer befestigt ist (2,5 l/min in O2). Mäuse wurden zur Vollanästhesie durch das Fehlen einer Reaktion auf Zehenstich bestätigt, nach dem Mäuse durch Enthauptung eingeschläfert wurden.

  1. Anästhesisieren Sie Mäuse in einer Isoflurankammer, sorgen Sie für Anästhesie über einen Zehenstich und enthaupten Sie die Maus dann mit einer scharfen Schere. Legen Sie die eingeschläferte Maus-Supine auf eine Seziermatte und sterilisieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Die Haut des Unterbauchs mit Zangen aufstellen und den Bauch mit einer Schere öffnen.
  2. Suchen Sie die Hoden in den unteren linken und rechten Leistenregionen des Bauches. Schneiden Sie ihre Verbindungen zu den Vas deferens und jedem verankernden Bindegewebe, dann heben Sie den gesamten Hoden (mit Epididymis noch befestigt) vom Tier. Legen Sie Diehoden in eine Petrischale aus vorausgeglichenen BM.
  3. Unter einem Seziermikroskop und in einem sterilen Feld einen kleinen Schnitt in der Tunika albuginea an einem Ende jedes Hodens entweder mit einer kleinen Mikrodissektionsschere oder durch sanftes Reißen mit zwei feinen Zangen machen.
    1. Dann, während Sie die Hoden vom entgegengesetzten Ende des Einschnitts halten, drücken Sie die Hoden vorsichtig mit feinen Zangen und schieben Sie in einer sanften Kehrbewegung in Richtung des Lochs in der Tunika; Dadurch wird das Hodengewebe als ein kohäsives Stück freigesetzt.
  4. Schneiden Sie die Hoden in kleinere Stücke (≤ 2 mm3) und legen Sie sie in 1 ml vorgewärmt (37 °C) Dissoziation Lösung 1.
    1. Bei 37 °C für 10 min inkubieren.
    2. Bei mehr als 10 Tests erhöhen Sie das Gesamtvolumen der Dissoziationslösung um 1 ml, sodass mindestens 1 ml Dissoziationslösung pro 10 Hoden (z. B. 2 ml für 20 Hoden, 3 ml für 30 Hoden usw.) zur Folge haben.
    3. Die Hodenstücke 50-mal (50x) in Lösung 1 mit einer P1000 Pipette sanft trituieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Tubuli an dieser Stelle voneinander und vom interstitiellen Gewebe trennen. Wenn Klumpen bleiben, für weitere 5 min inkubieren und triturat noch einmal (50x).
  5. Fügen Sie 33 l Hyaluronidase-Stammlösung (vorgewärmt bei 37 °C, ab Schritt 1,5) pro 1 ml Lösung 1 Dissoziationsgemisch (mit dem teilweise dissoziierten Hodengewebe und den Tubuli) hinzu. Nach dem Hinzufügen von Hyaluronidase wird dies Lösung 2 genannt.
    1. Trituat (50x) mit einem P1000 und bei 37 °C für 5 min inkubieren.
    2. Trituat (50x) mit einer P200 Pipette.
    3. Stellen Sie sicher, dass an dieser Stelle keine sichtbaren Tubuli oder Zellklumpen vorhanden sind. Wenn Klumpen bestehen bleiben, inkubieren Sie bis zu 5 weitere min, mit weiterer Triturierung mit einer P200 Pipette (50x).
  6. Quench die Dissoziationsenzyme durch Zugabe von fetalem Rinderserum (FBS) zu 10% des Gesamtvolumens der Lösung 2. Trituieren Sie mehrmals mit einer P200-Pipette, um sicherzustellen, dass keine Klumpen verbleiben, und filtern Sie durch ein 40-m-Zellsieb, um eine einzellige Suspension zu erzeugen.
  7. Zentrifugenzellen bei 100 x g für 7 min, verwerfen sie den Überstand und setzen die Zellen in frischem BM wieder auf.
  8. Zählen Sie die Gesamt- und lebensfähigen Zellkonzentrationen mit Trypanblauausschluss auf einem Hämozytometer. Fügen Sie 10 L von 1:1 verdünnt, Zellsuspension: Trypan-Blau-Lösung, in die Hämozytometer-Zellzählkammer (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Rezentrifugenzellen bei 100 x g für 7 min und in frischem BM wieder aufsetzen.
      HINWEIS: Verwenden Sie nur lebensfähige Zellen zur Berechnung der Zellkonzentration und -zahl. Verwenden Sie nur Zellsuspensionen von ≥ 80% Lebensfähigkeit zur Erzeugung von Organoiden.
    2. Bereiten Sie die einzelzellige Suspension in Zellkonzentrationen vor, wie beschrieben, um 280.000 Zellen zu aliquoten, wenn man die in den protokollspezifischen Schritten unten in Abschnitt 3: 2D ECM-Free – 0,56 x 106 Zellen/ml verwendeten Volumen aliquotiert, 2D ECM – 0,56 x 106 Zellen/ml , 3D ECM-frei – 4,66 x 106 Zellen/ml, 3D ECM – 2,8 x 106 Zellen/ml.
      HINWEIS: Alle hier vorgestellten Kulturexperimente beginnen mit 280.000 Zellen, die pro Kultur gut gesät werden. Diese Zahlen werden den repräsentativen Daten in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4) zugeordnet.

3. Zubereitung von organoiden Kulturgerichten und Aussaat von Zellen

ANMERKUNG: Um ein homogenes ECM zu gewährleisten, werden vor dem Experimentieren über Nacht gefrorene Aliquots von ECM vor dem Tauwetter eingefroren. ECM-Aliquots sollten in einem Eimer Eis in einem 4 °C-Kühlschrank oder Kühlraum untergetaucht werden, um einen langsamen, allmählichen Temperaturanstieg zu gewährleisten. Alle ECM werden bei einer 1:1-Endverdünnung in BM für Kultur verwendet. ECM und 1:1 verdünntes ECM bis unmittelbar vor Gebrauch auf Eis halten, sonst könnte das ECM vorzeitig polymerisieren.

  1. Für die 2D-ECM-freie Kultur ist keine spezielle Präparation erforderlich, Platteneinzelzellsuspensionen (500 l von 0,56 x 106 Zellen/ml in BM) direkt auf 4-Well-Kammer-Dias und in einen 35 °C-Inkubator für Kultur legen.
    HINWEIS: Zellen sollten sich innerhalb der ersten 24 h kultur am Boden des Kulturgerichts halten und können innerhalb derselben Zeit einige kleine 3D-Zellcluster aufweisen.
  2. Für die 2D-ECM-Kultur 100 l kaltes 1:1 verdünntes extrazelluläres Kellermatrixmedium in ein 4-Well-Kammer-Dia geben, um sicherzustellen, dass das Gel den gesamten Tellerboden abdeckt.
    1. Legen Sie das Kammerschieber mindestens 30 min in einen 35 °C-Inkubator, damit das ECM in ein Gel polymerisiert.
    2. Fügen Sie die Zellsuspension (500 x L von 0,56 x 106 Zellen/ml in BM) direkt auf die Oberseite des 2D-Gels, sobald es polymerisiert ist.
      HINWEIS: Zellen sollten sich zu kleinen 3D-Clustern innerhalb der ersten 24 h Kultur zusammenschließen.
  3. Für 3D ECM-freie Kultur, bereiten Agarose 3D Petri Teller Einsätze vor dem Start der Zellkultur.
    1. Zuerst Autoklav 1,5 g AgarosePulver in einem 100 ml Becher, dann 75 ml steril, destilliertes Wasser und Mikrowelle hinzufügen, um geschmolzene 2% Agarose für 3D Petrischalenguss zu produzieren.
    2. In einem sterilen Arbeitsbereich geschmolzene Agarose in die 3D Petrischale geben, bis der Meniskus mit den Seiten der Form eben ist.
    3. Lassen Sie die Agarose abkühlen und erstarren. Wenn fest, drehen Sie die Form auf den Kopf und sanft biegen Sie wiederholt, bis die Agarose 3D Petrischale aus der Form fällt.
      HINWEIS: An dieser Stelle kann man viele Agarose 3D Petrischalen zubereiten und sie in sterilenH2O oder DPBS bei 4 °C für mehr als einen Monat lagern.
    4. Vor der Kultivierung, legen Sie Agarose 3D Petri-Gerichte in ein 24 Brunnen-Kultur-Gericht, und decken Sie sie mit 1 ml VON BM. Lassen Sie die 3D Petrischalen in BM für mindestens 30 min in einem 37 °C Kultur-Inkubator ausgrenzen. Entsorgen Sie den BM, und wiederholen Sie den Ausgleich noch einmal mit 1 ml frischem BM. Nach der Ausgleicherung von 3D Petrischalen in BM erscheinen sie in der gleichen Farbe wie die BM (d.h. rosa).
    5. Um sich auf die Zellaussaat vorzubereiten, entfernen Sie alle BM aus dem Brunnen und geben Sie 200 l frischeS BM herum, aber nicht innerhalb der mittleren Aussparung der 3D Petrischale. Sammeln Sie auch alle verbleibenden BM aus der Mitte Zelle-Saat-Aussparung des Mikrowell-Einsatzes.
    6. Geben Sie die einzellige Suspension (4,66 Zellen/ml in 60 l BM) in die mittlere Aussparung der Agarose 3D Petrischale. Sanft trituieren Sie nach oben und unten, um Zellen zu mischen und eine Einzelzellsuspension zu Beginn der Kultur zu garantieren.
    7. In einen befeuchteten 35 °C-Inkubator für Kultur geben. Entfernen Sie am nächsten Tag die 200 l BM aus der Umgebung des Mikrowell-Einsatzes und ersetzen Sie sie durch 1 ml frisches BM. Dadurch wird der Flüssigkeitsstand über die Ebene des Einsatzes gebracht, wodurch die gesamte Kultur untergetaucht wird.
    8. Entfernen/hinzufügen Sie medien von außerhalb der Agarose 3D Petrischale langsam und vorsichtig. Die Organoide sollten über Nacht verdichtet haben, so dass sie am Boden ruhen können und Medienwechsel organoide ungestört lassen.
  4. Für die 3D-ECM-Kultur eine Einzelzellsuspension vorbereiten, indem Sie zu gleichen Teilen die Zellsuspension in BM mit kaltem, vorgetautem ECM (Endkonzentration = 2,8 x 106 Zellen/ml) kombinieren.
    1. Geben Sie das Zell-ECM-Gemisch sofort in eine 4-Well-Kammer-Rutsche, um sicherzustellen, dass die Mischung den gesamten Boden der Platte bedeckt.
    2. Die Kammergleitet bei 35 °C in einen Inkubator stellen und ihren Inhalt polymerisieren lassen. Dies sollte mindestens 30 min dauern. Fügen Sie nach der Polymerisation 500 l BM auf die Oberseite der Kultur.
      HINWEIS: Zellen sollten sich zu kleinen 3D-Aggregaten innerhalb der ersten 24 h kultur zusammengehäuft haben.

4. Organoide Wartung

  1. Kultur alle organoiden Modelltypen bei 35 °C. Für alle Kulturtypen tauschen Sie alle 2 Tage die Hälfte ihrer Medien mit frischem BM aus. Um sicherzustellen, dass Organoide nicht versehentlich beim Austausch von Medium gesammelt werden, sammeln Sie medienlangsam aus einer Ecke der Kammer-Diaschale, und von einem externen Punkt außerhalb der Agarose 3D Petri Schalen. Alle Medien können bei -20 °C zur Verwendung mit Immunoassays oder anderen Analysen später (d.h. Quantifizierung von abgesonderten Fortpflanzungshormonen oder Zytokinen) gespeichert werden.
  2. Verwenden Sie nach 7 Tagen kulturmittelmit Follikel-stimulierendem Hormon (Endkonzentration 20 mIU/ml) und humanem Choriongonadotropin (Endkonzentration 4,5 I.E./ml). Dies gilt für alle organoiden Kulturtypen.
  3. Bildalle Organoidkulturen (d. h. Zeitraffer-Bildgebung) zur Charakterisierung der Organoidbildung und zur Quantifizierung von Metriken der Selbstmontage, Entwicklung und des Wachstums im Laufe der Zeit.

5. Organoid-Sammlung

HINWEIS: Alle Organoide können mit 4% Paraformaldehyd in PBS für nachgeschaltete Immunkennzeichnung und histologische Analysen fixiert werden. Fix für 2 h bei Raumtemperatur mit Drehung oder über Nacht bei 4 °C.

  1. Für 2D-ECM-freie Kulturen zuerst spülen Sie die Probe mit frischem PBS, und fügen Sie dann Fixativ direkt auf die haftenden Konstrukte.
  2. Für ECM -Kulturmethoden (2D und 3D) einmal mit PBS ausspülen und dann entweder fixativ direkt auf der Oberseite der ECM-Organoidprobe hinzufügen (um das ECM-Gel und die Organoide zusammenzusetzen), oder alternativ die Organoide vorsichtig nach oben und unten pfeifen, um sie vom umgebenden ECM zu befreien, und sie zur Fixierung in ein separates Rohr zu übertragen.
  3. Für 3D ECM-freie Kultur, sanft Pipette die Organoide nach oben und unten in der mittleren Aussparung der Agarose 3D Petri schale; dies wird die Organoide ausspülen, um ihre einfache Sammlung mit einer Pipette zu erleichtern. Dann organoide in ein separates Rohr zur Fixierung übertragen.
  4. Vor der Verarbeitung in Paraffin, betten Sie viele Organoide (≥ 20) in einem kleinen Volumen (ca. 30 l) gewebeverarbeitendes Gel; Dies hilft, Organoide in einem kleinen Bereich innerhalb von Paraffinblöcken zu orientieren und zu konzentrieren, was eine einfachere Beobachtung beim Schnitt und eine einfachere visuelle Identifizierung innerhalb von Paraffinabschnitten erleichtert.
    HINWEIS: Organoide können schwierig sein, nach Paraffineinbettung und Schnitt auf einem Mikrotom zu identifizieren.

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Ergebnisse

Organoide Erzeugung wurde als erfolglos, wenn Hodenzellen nicht selbst-assemble innerhalb 72 h der Kultur, jedoch, alle Methoden hier präsentiert montieren innerhalb von 24 h bei der Verwendung von juvenilen (5 dpp) murinen Zellen. Versagen der biologischen Konstrukterzeugung als Fortsetzung frei schwebender Zellen dargestellt (0 h Spalte in Abbildung 1) auch nach erweiterter Kultur (72 h). In Ermangelung einer Gewebeselbstmontage dispergierten sich alle scheinbaren Zellcluster bei schonende...

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Diskussion

Mit der Fertigstellung dieses Organoid-Generierungsprotokolls stehen dem Benutzer vier verschiedene Kulturtechniken für die Montage von Hodenkonstrukten und Organoiden in ECM- oder ECM-freien Umgebungen zur Verfügung. Wichtig ist, dass alle vier Methoden es dem Forscher ermöglichen, die organoide Selbstmontage im Laufe der Zeit durch Zeitraffer-Bildgebung oder Videoaufzeichnung nicht-invasiv zu beobachten und konditionierte Medien für die Analyse von abgesonderten Hormonen und Zytokinen zu sammeln, ohne das Gewebe währen...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health, dem National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, dem National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 und 4UH3ES029073-03 und der Thomas J. Watkin es Memorial Professorship finanziert.

Die Autoren danken Eric W. Roth für die Unterstützung bei der Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Arbeit wurde von der BioCryo-Anlage des NUANCE Center der Northwestern University genutzt, die von der Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205) unterstützt wurde. das MRSEC-Programm (NSF DMR-1720139) am Materials Research Center; das Internationale Institut für Nanotechnologie (IIN); und dem Staat Illinois durch die IIN. Es nutzt auch die CryoCluster-Ausrüstung, die vom MRT-Programm (NSF DMR-1229693) unterstützt wurde. Grafiken in Abbildung 1 wurden mit BioRender.com entworfen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 μm SterilfilterMillipore Sigmascgpu05reFür sterile Filtermedien
3β HSD-PrimärantikörperCosmo Bio CoK0607Leydig-Zellmarker, 1:500 Verdünnung
AlexaFluor 568 α-MausThermo Fisher ScientificA-21202Fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper
AlexaFluor 568 α-KaninchenThermo Fisher ScientificA10042Fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper
Alpha Minimum Essentielles MediumThermo Fisher Scientific11-095-080Basis des Nährmediums
Kollagenase IWorthington BioLS004197Für die Dissoziationslösung 1
Corning Matrigel Membranmatrix, LDEV-freieCorning354234Extrazelluläre Matrix zum Gießen von 2D- und 3D-ECM-Kulturgelen
Countess Cell CounterThermo Fisher ScientificC10227Autmated Cell Counter (Hämazytometer)
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10228Hämazytometer-Objektträger zur Verwendung mit Countess automatisiertem Zähler
DDX4 PrimärantikörperAbcam138540Spermatogonia-Marker, 1:500 Verdünnung
Desoxyribonuklease I (2.280 u/mgDW)Worthington BioLS002140Für Dissoziationslösung 1
DPBS 1X, + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182Zur Rekonstitution von Hyaluronidase
Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung +Ca/+MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIllipore SigmaW1503Zur Rekonstitution von Kollagenase I und Dnase I
Fötales RinderserumThermo Fisher Scientific16000044Zur Sequenzierung von Enzymdissokationslösungen
Follikel stimulierendes HormonAbcamab51888Für die langfristige Organoidkultur
Humanes ChoriongonadotropinMillipore SigmaC1063Für die langfristige Organoidkultur
Hyaluronidase, aus RinderhodenMillipore SigmaH4272Für Dissoziationslösung 2
Inhibin B Enzymgebundener Immunsorbent AssayAnsh LabsAL-107Inhibin B ELISA Kit
KnockOut SerumersatzThermo Fisher Scientific10828-028Serumquelle für Basalmedien
Mikrogewebe 3D-Petrischale, Mikroschimmelpilz-Sphäroide (24-35, 5x7 Array)Millipore SigmaZ764051Für die 3D-ECM-freie Herstellung von Organoiden
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-Well-ThermoFisher Scientific12-565-7Für 2D-ECM-freie und 2D-3D-ECM-Kultur
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15-140-122Antibiotikum für Medien
Richard-Allan Scientific; Histogel, Gel für die ProbenverarbeitungThermo Fisher ScientificHG-4000-012Zur Unterstützung der Paraffineinbettung
von SOX9-PrimärantikörperMillipore SigmaAB5535Sertoli Marker, Verdünnung 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Züchter)Teklad Global2920Mausfutter ohne Phytoöstrogene
Tedklad Global Mouse Chow (Wartung)Teklad Global2916Mausnahrung ohne Phytoöstrogene
Testosteron Enzyme-linked Immunosorbent AssayCalbiotechTE373STestosteron ELISA Kit
Trypan Blue Lösung, 0,4 %Thermo Fisher Scientific15250061Für die Zellzählung
αSMA-PrimärantikörperMillipore SigmaA2547Peritubulärer Marker, 1:500 Verdünnung
β Catenin-PrimärantikörperBD Biosciences610154Sertoli Cytoplasma-Marker, Verdünnung 1:100

Referenzen

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