Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Summary

Hier werden vier Methoden zur Erzeugung von Hodenorganoiden aus primären neonatalen murinen Hodenzellzellen beschrieben, d.h. extrazelluläre Matrix (ECM) und ECM-freie 2D- und 3D-Kulturumgebungen. Diese Techniken haben mehrere Forschungsanwendungen und sind besonders nützlich für das Studium der Hodenentwicklung und Physiologie in vitro.

Abstract

Hodenorganoide bieten ein Werkzeug für die Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Endokrinologie in vitro. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um Hodenorganoide zu erstellen. Viele dieser Methoden verlassen sich auf extrazelluläre Matrix (ECM), um de novo Gewebe-Montage zu fördern, jedoch gibt es Unterschiede zwischen Denkmethoden in Bezug auf biomimetische Morphologie und Funktion des Gewebes. Darüber hinaus gibt es nur wenige direkte Vergleiche veröffentlichter Methoden. Hier wird ein direkter Vergleich durch die Untersuchung von Unterschieden in Organoid-Generierungsprotokollen, mit bereitgestellten Ergebnissen gemacht. Vier archetypische Erzeugungsmethoden: (1) 2D ECM-frei, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-frei und (4) 3D-ECM-Kultur werden beschrieben. Zur Beurteilung der Hodenorganoid-Erzeugung wurden drei primäre Benchmarks verwendet. Dabei handelt es sich um zelluläre Selbstmontage, Die Einbeziehung wichtiger Zelltypen (Sertoli, Leydig, Keime und peritubäre Zellen) und entsprechend abgeschottete Gewebearchitektur. Von den vier getesteten Umgebungen erzeugten 2D ECM- und 3D-ECM-freie Kulturen Organoide mit internen Morphologien, die nativen Hoden am ähnlichsten sind, einschließlich der De-Novo-Abschottung von röhrenförmigen versus interstitiellen Zelltypen, der Entwicklung von Tubule-ähnlichen Strukturen und einer etablierten langfristigen endokrinen Funktion. Alle untersuchten Methoden nutzten unsortierte, primäre murine Hodenzellsuspensionen und nutzten allgemein zugängliche Kulturressourcen. Diese Hodenorganoid-Generierungstechniken bieten ein hochzugängliches und reproduzierbares Toolkit für Forschungsinitiativen zur Hodenorganogenese und Physiologie in vitro.

Introduction

Hodenorganoide sind eine bahnbrechende Technik zur Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Physiologie in vitro^1,2,3,4. Mehrere Methoden wurden für die Organoid-Generierung erforscht; Dazu gehören eine Vielzahl von extrazellulären Matrix- (ECM) und ECM-freien Kultursystemen, sowohl in zweidimensionalen (2D) als auch dreidimensionalen (3D) Ausrichtungen. Unterschiedliche Erzeugungsmethoden können unterschiedliche zelluläre Montagestrategien fördern; Dies führt zu einer hohen morphologischen und funktionellen Variabilität zwische....

Protocol

Alle Mausexperimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Northwestern University genehmigt, und alle Verfahren wurden nach von der IACUC zugelassenen Protokollen durchgeführt.

1. Vorbereitung von enzymatischen Gewebedissoziationslösungen

1. Verwenden Sie zwei verschiedene enzymatische Lösungen (Lösung 1 und Lösung 2), die beide mit einer Basalkultur-Medium-Lösung (BM) hergestellt werden.
2. Zur Herstellung von BM serum und penicillin-streptomycin zu den minimalen essentiellen mittleren bis endgültigen Konzentrationen von 10% bzw. 1% hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien für s....

Results

Organoide Erzeugung wurde als erfolglos, wenn Hodenzellen nicht selbst-assemble innerhalb 72 h der Kultur, jedoch, alle Methoden hier präsentiert montieren innerhalb von 24 h bei der Verwendung von juvenilen (5 dpp) murinen Zellen. Versagen der biologischen Konstrukterzeugung als Fortsetzung frei schwebender Zellen dargestellt (0 h Spalte in Abbildung 1) auch nach erweiterter Kultur (72 h). In Ermangelung einer Gewebeselbstmontage dispergierten sich alle scheinbaren Zellcluster bei schonende.......

Discussion

Mit der Fertigstellung dieses Organoid-Generierungsprotokolls stehen dem Benutzer vier verschiedene Kulturtechniken für die Montage von Hodenkonstrukten und Organoiden in ECM- oder ECM-freien Umgebungen zur Verfügung. Wichtig ist, dass alle vier Methoden es dem Forscher ermöglichen, die organoide Selbstmontage im Laufe der Zeit durch Zeitraffer-Bildgebung oder Videoaufzeichnung nicht-invasiv zu beobachten und konditionierte Medien für die Analyse von abgesonderten Hormonen und Zytokinen zu sammeln, ohne das Gewebe währen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 μm Sterilfilter	Millipore Sigma	scgpu05re	Für sterile Filtermedien
3β HSD-Primärantikörper	Cosmo Bio Co	K0607	Leydig-Zellmarker, 1:500 Verdünnung
AlexaFluor 568 α-Maus	Thermo Fisher Scientific	A-21202	Fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper
AlexaFluor 568 α-Kaninchen	Thermo Fisher Scientific	A10042	Fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper
Alpha Minimum Essentielles Medium	Thermo Fisher Scientific	11-095-080	Basis des Nährmediums
Kollagenase I	Worthington Bio	LS004197	Für die Dissoziationslösung 1
Corning Matrigel Membranmatrix, LDEV-freie	Corning	354234	Extrazelluläre Matrix zum Gießen von 2D- und 3D-ECM-Kulturgelen
Countess Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	C10227	Autmated Cell Counter (Hämazytometer)
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228	Hämazytometer-Objektträger zur Verwendung mit Countess automatisiertem Zähler
DDX4 Primärantikörper	Abcam	138540	Spermatogonia-Marker, 1:500 Verdünnung
Desoxyribonuklease I (2.280 u/mgDW)	Worthington Bio	LS002140	Für Dissoziationslösung 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl	Thermo Fisher Scientific	14040182	Zur Rekonstitution von Hyaluronidase
Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung +Ca/+Mg	Thermo Fisher Scientific	14040117	PBS
Embryo Grade H2O	MIllipore Sigma	W1503	Zur Rekonstitution von Kollagenase I und Dnase I
Fötales Rinderserum	Thermo Fisher Scientific	16000044	Zur Sequenzierung von Enzymdissokationslösungen
Follikel stimulierendes Hormon	Abcam	ab51888	Für die langfristige Organoidkultur
Humanes Choriongonadotropin	Millipore Sigma	C1063	Für die langfristige Organoidkultur
Hyaluronidase, aus Rinderhoden	Millipore Sigma	H4272	Für Dissoziationslösung 2
Inhibin B Enzymgebundener Immunsorbent Assay	Ansh Labs	AL-107	Inhibin B ELISA Kit
KnockOut Serumersatz	Thermo Fisher Scientific	10828-028	Serumquelle für Basalmedien
Mikrogewebe 3D-Petrischale, Mikroschimmelpilz-Sphäroide (24-35, 5x7 Array)	Millipore Sigma	Z764051	Für die 3D-ECM-freie Herstellung von Organoiden
Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-Well-Thermo	Fisher Scientific	12-565-7	Für 2D-ECM-freie und 2D-3D-ECM-Kultur
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15-140-122	Antibiotikum für Medien
Richard-Allan Scientific; Histogel, Gel für die Probenverarbeitung	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	Zur Unterstützung der Paraffineinbettung
von SOX9-Primärantikörper	Millipore Sigma	AB5535	Sertoli Marker, Verdünnung 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Züchter)	Teklad Global	2920	Mausfutter ohne Phytoöstrogene
Tedklad Global Mouse Chow (Wartung)	Teklad Global	2916	Mausnahrung ohne Phytoöstrogene
Testosteron Enzyme-linked Immunosorbent Assay	Calbiotech	TE373S	Testosteron ELISA Kit
Trypan Blue Lösung, 0,4 %	Thermo Fisher Scientific	15250061	Für die Zellzählung
αSMA-Primärantikörper	Millipore Sigma	A2547	Peritubulärer Marker, 1:500 Verdünnung
β Catenin-Primärantikörper	BD Biosciences	610154	Sertoli Cytoplasma-Marker, Verdünnung 1:100