Modifizierte Methoden zum Laden von DNA-Extraktionsplatten mit hohem Durchsatz reduzieren das Kontaminationspotenzial

Zusammenfassung

Aktuelle Methoden zum Beladen von 96-Well-Platten für DNA-Extraktionen können anfällig für Verunreinigungen sein. Wir beschreiben eine neue Methode zum Beladen von 96-Well-Platten, die das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Brunnen reduziert. Unsere Methode wird anderen Forschern helfen, von der Effizienz von DNA-Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz zu profitieren und das Risiko einer Kontamination zu minimieren.

Zusammenfassung

DNA-Sequenzierungstechniken mit hohem Durchsatz haben wesentlich zu Fortschritten in unserem Verständnis von Beziehungen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften, Host-Eigenschaften und breiteren Ökosystemfunktionen beigetragen. Mit dieser raschen Zunahme der Breite und Tiefe der Sequenzierung sequencing Fähigkeiten haben Methoden zu extrahieren, zu verstärken, analysieren, und interpretieren Umwelt-DNA erfolgreich mit maximaler Effizienz. Leider kann die schnelle Durchführung von DNA-Extraktionen auf Kosten der Erhöhung des Kontaminationsrisikos unter den Proben gehen. Insbesondere Hochdurchsatzextraktionen, die auf Proben basieren, die in einer 96-Well-Platte enthalten sind, bieten im Vergleich zu Einrohrextraktionen eine relativ schnelle Methode, erhöhen aber auch die Möglichkeiten für eine gut zu-gut-kreuz-Kontamination. Um das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Proben zu minimieren und gleichzeitig die Vorteile von Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz beizubehalten, haben wir eine neue Methode entwickelt, um Umweltproben in 96-Well-Platten zu laden. Wir verwendeten durchbohrbare PCR-Dichtungsfolien, um jede Platte während des Ladens von Proben abzudecken, und fügten Proben zuerst zu PCR-Röhren hinzu, bevor wir sie in Brunnen bewegten; Zusammen reduzieren diese Praktiken das Risiko von Probendrift und unbeabsichtigter Doppelbelastung von Brunnen. Die in diesem Papier beschriebene Methode bietet Forschern einen Ansatz zur Maximierung der verfügbaren Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz bei gleichzeitiger Verringerung des Risikos einer Kreuzkontamination, die 96-Well-Platten innewohnt. Wir bieten einen detaillierten Schritt für Schritt, wie man von der Probenentnahme zur DNA-Extraktion übergeht und gleichzeitig das Risiko einer unerwünschten Kreuzkontamination minimiert.

Einleitung

Die jüngsten Fortschritte bei der Hochdurchsatzsequenzierung mikrobieller Gemeinschaften bieten eine unvergleichliche Sequenzierungstiefe und damit einen beispiellosen Einblick in das Funktionieren und die Vielfalt des Erdmikrobioms¹. Da die Fähigkeit, immer mehr Proben auf eine einzige Sequenzierungsspur zu multiplen, zunimmt, hat die DNA-Extraktion von Einzelrohren das Potenzial, ein ratenbegrenzender Schritt bei der Generierung ökologischer Daten zu werden. Neue Methoden in DNA-Extraktionen mit hohem Durchsatz versprechen jedoch die Verarbeitung großer Mengen von Umweltproben mit größerer Effizienz als bisher möglich². Bei diesen Methoden werden häufig 96-Well-Platten anstelle von Einrohren verwendet, wodurch die mögliche Anzahl von Extraktionen erhöht wird, die gleichzeitig auftreten können. Als solche sind die Praktikabilität und Effizienz von Hochdurchsatzextraktionsmethoden offensichtlich und wurden für die Verarbeitung von Umweltproben von Boden^3,4 und Pflanzengewebe^3,5 bis zu menschlichen Fäkalien²umgesetzt.

Während diese Methoden die Probenverarbeitung und DNA-Extraktion dramatisch beschleunigen können, ist der erste Schritt der Beladung von Boden und anderen ökologischen Proben in 96-Well-Platten anfällig für kreuzprobenübergreifende Kontamination. Diese Art der Brunnenkontamination kann während der DNA-Extraktionen^6,7,8und Brunnen in diesem ersten Schritt besonders anfällig sein, bevor Proben in einer Pufferlösung suspendiert werden. McPherson et al.⁹ demonstrieren eine Methode, um Rhizosphärenböden mit Trichtern und 8-Well-PCR-Streifenabdeckungen in 96-Well-Platten zu laden, aber obwohl ihre Methode ein kontrollierterer Ansatz zum Beladen von Platten ist, bietet sie dennoch reichlich Gelegenheit zur Kontamination benachbarter Brunnen beim Laden jeder Probe. Darüber hinaus ermöglichen die offenen Brunnen einem abgelenkten Forscher die Möglichkeit, eine Probe in den falschen Brunnen zu legen oder eine Probe in einen Brunnen zu geben, der bereits geladen wurde. Darüber hinaus erweisen sich eine Vielzahl von Probentypen als ungeeignet für die Beladung mit diesem Verfahren; Nassproben kleben oft an den Trichtern und trockenen Proben "springen" zwischen Brunnen aufgrund statischer Elektrizität.

Um die Kontaminationsmöglichkeiten zwischen Brunnen im ersten Schritt der DNA-Extraktion mit hohem Durchsatz zu verringern, haben wir einen neuen Ansatz entwickelt, um Bodenproben in 96-Well-Platten zu verladen. Unsere Methoden schützen Brunnen vor Umweltbelastungen und verhindern, dass wir versehentlich mehrere Proben in einen Brunnen laden (Doppelbelastung). Wir glauben, dass die unten beschriebene Methode verspricht, das Kontaminationspotenzial zu verringern und als solches eine kontrolliertere Möglichkeit bietet, 96-Well-Platten für die nachfolgende DNA-Extraktion zu laden.

Protokoll

1. Laborbank und Werkzeugvorbereitung zum Beladen einer 96-Well-Platte

1. Klare Bankspitze durch Vernebelung mit 70% Ethanol. Wischen und lassen Sie die Luft trocknen, bevor Sie die Bank mit 10% Bleichmittel besprühen. Wischen Sie die Bank oben trocken.
2. Sterilisieren Sie Mikro-Scoopula, Spachtel und chirurgische Schere (gekrümmt) durch Eintauchen in 95% Ethanol und setzen Sie dann einer Flamme aus. Tauchen Sie jeweils in 10% Bleichmittel und lassen Sie die Luft vor der Verwendung trocknen.
   HINWEIS: Werkzeuge sollten zwischen jeder Probe sterilisiert werden.

2. Unterprobe und Probenvorbereitung

1. Sterilisieren Sie Handschuhe mit Ethanol vor der Subprobenahme.
2. Homogenisieren Sie Bodenproben vor der Unterprobe gründlich.
3. Mit sterilisierten Werkzeugen ein beschriftetes 2 ml Zentrifugenrohr mit der Probe beladen, bis es etwa halb voll ist.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.2, bis alle 95 Proben in beschrifteten 2 ml Zentrifugenröhrchen subprobt wurden. Der^96. Brunnen sollte als Extraktionsrohling verwendet werden.
   HINWEIS: Die Schritte 2.3 und 2.4 werden durchgeführt, um den erforderlichen Speicherplatz zu minimieren und eine Über- oder Doppelte-Probenahme zu verhindern.
5. 2 ml Unterprobenrohre bis zum Beladen der Platte auf Eis lagern.
6. Etikett 96 sterile 200 l flach gekapselte PCR-Rohre A1-u2012A12, B1-u2012B12, .... H1-u2012H12. Stellen Sie diese Rohre in Ordnung in ein 96-Well-Rack.
7. Weisen Sie eine Beispiel-ID mit einer Bohrstelle (A1-u2012H12) zu und zeichnen Sie sie auf.

3. Plattenvorbereitung

1. Entfernen Sie die Gummiabdeckung von der 96-Well-Platte (Abbildung 1A-1C) und legen Sie sie in eine sterile Plastiktüte (siehe Tabelle der Materialien). Versiegeln Sie den Plastikbeutel, um eine Kontamination zu verhindern.
2. Bedecken Sie die 96-Well-Platte mit Dichtungsfolie(Abbildung 1D–1E); Verwenden Sie z. B. eine vorgeschnittene, durchlässige Dichtfolie (siehe Materialtabelle). Sicherstellen Der Dichtung durch Walzen mit einer Gummiwalze.
   HINWEIS: Pierceable Silikonmatten könnten möglicherweise eine wiederverwendbare Option bieten, vorausgesetzt, eine angemessene Reinigung zwischen den Anwendungen, aber die Silikonmatten, die wir getestet haben, spalten sich leicht entlang der Pierces und würden keinen gleichen Schutz für nachfolgende Platten bieten.
3. Teller in den Kühlschrank (4 °C) stellen, um kühl zu bleiben.

4. Übertragung von Unterproben

HINWEIS: Siehe Schritt 4.13 für Änderungen, wenn die Bodenprobe sehr klein ist.

1. 24 der 2 ml-Unterproben in einen Eisblock für die Kühllagerung geben.
2. Wählen Sie unter Verwendung des Beispielnamens und des Gut-Lage-Blatts das richtige 200-L-Flachkappen-PCR-Rohr aus.
3. Nehmen Sie ein 2 ml Unterprobenrohr und Wirbel für 5 s, um die Homogenisierung zu gewährleisten.
4. Mit Flammen- und Bleichsterilwerkzeugen die erste Probe mit 200 l in das richtige flachgekapselte PCR-Rohr(Abbildung 1F)einzuladen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2-u20124.4, bis alle 24 Samples geladen wurden. Wechseln Sie dann zu Schritt 4.6.
6. Reinigen Sie die Außenseite des 200-L-Flachkappen-PCR-Rohrs mit einem Bleichpapiertuch.
7. Invertieren Sie das Rohr und tippen Sie auf die Bank, um die Probe nach oben zu bewegen. Mit gebleichten und flammensterilisierten Scheren, klemmen Sie die Unterseite des PCR-Rohrs, um eine Öffnung für die Probe zu erstellen, um in die 96-Well-Platte zu fallen (Abbildung 1G).
8. Suchen Sie den richtigen Brunnen auf einer 96-Well-Platte und passieren Sie das Rohr über die Platte mit Schnittende nach oben, bis sie diesen Brunnen erreichen. Neigen Sie die Platte leicht, um das Punktieren von vorgeschnittenen pierceablen Dichtungsfilm zu erleichtern, und nur, wenn Rohr direkt über dem richtigen gut sorgfältig invertieren, so dass geschnittene Spitze passt in den Brunnen. Tippen Sie mit sterilisierten Werkzeugen auf die Oberseite des PCR-Rohrs, bis der gesamte Boden aus dem Rohr in den Brunnen gefallen ist. Lassen Sie das Rohr im Brunnen mit geschlossenem Deckel(Abbildung 1H–1J).
9. Entfernen Sie jeweils ein flaches 200-L-PCR-Rohr, und fügen Sie dem Brunnen 750 l Perlenlösung hinzu(Abbildung 1K). Schieben Sie das 200-L-Flachkappen-PCR-Rohr ganz nach unten in den Brunnen und markieren Sie die Oberseite mit Sharpie, um anzuzeigen, dass dieser Brunnen geladen wurde. Wiederholen Sie dies für jedes Beispiel.
10. Nachdem alle 24 Proben geladen und eine Perlenlösung hinzugefügt wurden, entfernen Sie die 2 ml-Unterprobenröhrchen und ersetzen Sie sie durch 24 nicht gesampelte Rohre.
11. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-u20124.10, bis alle 95 Bohrungen mit Einerprobe oder leer ergehen und eine Perlenlösung installiert wurden. Entfernen Sie Rohre, ohne sie über offene Brunnen zu übergeben (Abbildung 1L).
12. Entfernen Sie vorsichtig pierceable Folie und ersetzen Sie die Gummiabdeckung, um die Platte bis zum Beginn der Extraktion zu schützen (Abbildung 1M–1O).
13. Für sehr kleine Mengen von Böden, die ebenfalls feinkörnig sind, fügen Sie dem Probenröhrchen 750 l Perlenlösung hinzu und verwenden Sie eine breitgebohrte Pipettenspitze, um alle Inhalte in den entsprechenden Brunnen zu übertragen. Legen Sie pcR-Rohr in die Öffnung, um eine Doppelbelastung zu verhindern.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig bei der Umsetzung dieser Modifikation als Partikel organische Substanz oder kleine Gesteinsfragmente größer als die Bohrung der Pipettenspitze kann die Pipette verstopfen und machen die Übertragung der Probe Gülle erschweren.
14. Bei Bedarf bei -20 °C einfrieren und Platten mit Probe- und Perlenlösung beladen bis zur geplanten Extraktion lagern.

5. Vergleich der Plattenlademethoden

HINWEIS: Um unsere neuartige Methode zur Beladung von 96-Well-DNA-Extraktionsplatten zu überprüfen, haben wir eine einzelne 96-Well-Platte in drei Abschnitte unterteilt. Wir verwendeten drei verschiedene Methoden der Plattenbeladung, um das Potenzial für unbeabsichtigte Verschmutzung von Boden und Kreuzkontamination zu vergleichen. Die drei Methoden, die wir verwendeten, waren die Methoden, die in McPherson et al.⁹beschrieben wurden, Qiagens Standardladeprotokoll¹⁰, und das Protokoll, das wir in dieser Publikation skizzieren.

1. Beladung von Erde in die Platte
   1. Sektion eine 96-Well-Platte in drei vierspaltige Blöcke. Laden Sie jeden Block mit einer der drei oben genannten Methoden.
   2. Boden in jeden anderen Brunnen eintragen, so dass Proben- und Rohbrunnen versetzt werden. Diese Anordnung ermöglicht maximale Möglichkeiten für unbeabsichtigte Probenbelastung und Kreuzkontamination.
   3. Einfrieren der 96-Well-Platte bei -20 °C bis zur DNA-Extraktion.
2. DNA-Extraktion
   1. Extrahieren Sie DNA gemäß dem 96-Well-Plattenextraktionsprotokoll des Herstellers¹⁰.
   2. Bewahren Sie die DNA-Extrakte bis zur weiteren Analyse bei -20 °C auf.
3. Quantifizierung der DNA in Rohbrunnen
   1. Dna-Extrakte bei Raumtemperatur auftauen, Wirbel und Spin down mit einem Plattenspinner.
   2. Messen und aufzeichnen Sie DNA-Konzentrationen von Rohbrunnen mit einem Spektralphotometer.
   3. Verwenden Sie den Post-hoc-Test von ANVOA und Tukey, um Unterschiede in der mittleren DNA-Konzentration in Rohbrunnen zu analysieren.
      ANMERKUNG: Es wurden erhebliche Unterschiede bei 0,05 gemeldet.

Ergebnisse

Diese neuartige Methode wurde erfolgreich verwendet, um 96-Well-DNA-Extraktionsplatten zu laden. Der Vergleich der Plattenlademethoden zeigte, dass unsere Methode die niedrigste DNA-Konzentration in den Rohbrunnen aufweist. Die DNA-Konzentration in den Rohbrunnen war signifikant niedriger als die vorgeschlagene Methode mein McPherson et al.⁹ (p < 0,05), obwohl sich die DNA-Konzentrationen in unserer Methode statistisch nicht von der Qiagen-Standardmethode unterschieden (Abb...

Diskussion

Diese Methode reduziert die Möglichkeiten für eine gut zu-gut-kreuz-Kontamination beim Laden von Probenextraktionsplatten mit hohem Durchsatz und bietet eine kontrolliertere Möglichkeit, 96-Well-Platten über bestehende Plattenbelastungsstrategien^9,10hinaus zu laden. Die Kontamination unter Brunnen kann bei 96-Well-Plattenextraktionen stärker ausgeprägt sein als bei Einrohrextraktionen, insbesondere bei automatisierten^6,,

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL Zentrifugenröhrchen	Fisherbrand	05-408-129
200 µ L Mikro-PCR-Röhrchen	Thermo Scientific	AB 2000
96-Well-PowerSoil DNA-Extraktionskit	Qiagen	12955-4	Wir haben ein Bodenextraktionskit verwendet, aber jedes Kit im 96-Well-Format würde funktionieren.
Eisblock für 2 mL Zentrifugenröhrchen	Beliebig	Jeder	Eisblock für 2 mL Röhrchen funktioniert
Eisblock für 200 & Mikro; L Mikro-PCR-Röhrchen	Beliebig	Beliebig Beliebig	Eisblock hergestellt für 200 & Mikro; L-Röhrchen funktionieren
Mikro-Scoopula	Beliebig	Alle Vorgeschnittenen
Durchstechbaren Versiegelungsfolien	Excel Scientific	XPS25
Spatel	Beliebig	Alle
Chirurgischen Scheren	Beliebig	Beliebig