Modifizierte Methoden zum Laden von DNA-Extraktionsplatten mit hohem Durchsatz reduzieren das Kontaminationspotenzial

Summary

Aktuelle Methoden zum Beladen von 96-Well-Platten für DNA-Extraktionen können anfällig für Verunreinigungen sein. Wir beschreiben eine neue Methode zum Beladen von 96-Well-Platten, die das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Brunnen reduziert. Unsere Methode wird anderen Forschern helfen, von der Effizienz von DNA-Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz zu profitieren und das Risiko einer Kontamination zu minimieren.

Abstract

DNA-Sequenzierungstechniken mit hohem Durchsatz haben wesentlich zu Fortschritten in unserem Verständnis von Beziehungen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften, Host-Eigenschaften und breiteren Ökosystemfunktionen beigetragen. Mit dieser raschen Zunahme der Breite und Tiefe der Sequenzierung sequencing Fähigkeiten haben Methoden zu extrahieren, zu verstärken, analysieren, und interpretieren Umwelt-DNA erfolgreich mit maximaler Effizienz. Leider kann die schnelle Durchführung von DNA-Extraktionen auf Kosten der Erhöhung des Kontaminationsrisikos unter den Proben gehen. Insbesondere Hochdurchsatzextraktionen, die auf Proben basieren, die in einer 96-Well-Platte enthalten sind, bieten im Vergleich zu Einrohrextraktionen eine relativ schnelle Methode, erhöhen aber auch die Möglichkeiten für eine gut zu-gut-kreuz-Kontamination. Um das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Proben zu minimieren und gleichzeitig die Vorteile von Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz beizubehalten, haben wir eine neue Methode entwickelt, um Umweltproben in 96-Well-Platten zu laden. Wir verwendeten durchbohrbare PCR-Dichtungsfolien, um jede Platte während des Ladens von Proben abzudecken, und fügten Proben zuerst zu PCR-Röhren hinzu, bevor wir sie in Brunnen bewegten; Zusammen reduzieren diese Praktiken das Risiko von Probendrift und unbeabsichtigter Doppelbelastung von Brunnen. Die in diesem Papier beschriebene Methode bietet Forschern einen Ansatz zur Maximierung der verfügbaren Extraktionstechniken mit hohem Durchsatz bei gleichzeitiger Verringerung des Risikos einer Kreuzkontamination, die 96-Well-Platten innewohnt. Wir bieten einen detaillierten Schritt für Schritt, wie man von der Probenentnahme zur DNA-Extraktion übergeht und gleichzeitig das Risiko einer unerwünschten Kreuzkontamination minimiert.

Introduction

Die jüngsten Fortschritte bei der Hochdurchsatzsequenzierung mikrobieller Gemeinschaften bieten eine unvergleichliche Sequenzierungstiefe und damit einen beispiellosen Einblick in das Funktionieren und die Vielfalt des Erdmikrobioms¹. Da die Fähigkeit, immer mehr Proben auf eine einzige Sequenzierungsspur zu multiplen, zunimmt, hat die DNA-Extraktion von Einzelrohren das Potenzial, ein ratenbegrenzender Schritt bei der Generierung ökologischer Daten zu werden. Neue Methoden in DNA-Extraktionen mit hohem Durchsatz versprechen jedoch die Verarbeitung großer Mengen von Umweltproben mit größerer Effizienz als bisher möglich²....

Protocol

1. Laborbank und Werkzeugvorbereitung zum Beladen einer 96-Well-Platte

1. Klare Bankspitze durch Vernebelung mit 70% Ethanol. Wischen und lassen Sie die Luft trocknen, bevor Sie die Bank mit 10% Bleichmittel besprühen. Wischen Sie die Bank oben trocken.
2. Sterilisieren Sie Mikro-Scoopula, Spachtel und chirurgische Schere (gekrümmt) durch Eintauchen in 95% Ethanol und setzen Sie dann einer Flamme aus. Tauchen Sie jeweils in 10% Bleichmittel und lassen Sie die Luft vor der Verwendung trocknen.
   HINWEIS: Werkzeuge sollten zwischen jeder Probe sterilisiert werden.

2. Unterprobe und Probenvorbereitung

1. Sterilisier....

Results

Diese neuartige Methode wurde erfolgreich verwendet, um 96-Well-DNA-Extraktionsplatten zu laden. Der Vergleich der Plattenlademethoden zeigte, dass unsere Methode die niedrigste DNA-Konzentration in den Rohbrunnen aufweist. Die DNA-Konzentration in den Rohbrunnen war signifikant niedriger als die vorgeschlagene Methode mein McPherson et al.⁹ (p < 0,05), obwohl sich die DNA-Konzentrationen in unserer Methode statistisch nicht von der Qiagen-Standardmethode unterschieden (Abb.......

Discussion

Diese Methode reduziert die Möglichkeiten für eine gut zu-gut-kreuz-Kontamination beim Laden von Probenextraktionsplatten mit hohem Durchsatz und bietet eine kontrolliertere Möglichkeit, 96-Well-Platten über bestehende Plattenbelastungsstrategien^9,10hinaus zu laden. Die Kontamination unter Brunnen kann bei 96-Well-Plattenextraktionen stärker ausgeprägt sein als bei Einrohrextraktionen, insbesondere bei automatisierten^6,,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 oz WhirlPak	Nasco	B01065
2 mL Zentrifugenröhrchen	Fisherbrand	05-408-129
200 µ L Mikro-PCR-Röhrchen	Thermo Scientific	AB 2000
96-Well-PowerSoil DNA-Extraktionskit	Qiagen	12955-4	Wir haben ein Bodenextraktionskit verwendet, aber jedes Kit im 96-Well-Format würde funktionieren.
Eisblock für 2 mL Zentrifugenröhrchen	Beliebig	Jeder	Eisblock für 2 mL Röhrchen funktioniert
Eisblock für 200 & Mikro; L Mikro-PCR-Röhrchen	Beliebig	Beliebig Beliebig	Eisblock hergestellt für 200 & Mikro; L-Röhrchen funktionieren
Mikro-Scoopula	Beliebig	Alle Vorgeschnittenen
Durchstechbaren Versiegelungsfolien	Excel Scientific	XPS25
Spatel	Beliebig	Alle
Chirurgischen Scheren	Beliebig	Beliebig