Method Article

Super-Resolution Imaging zur Untersuchung der Kolokalisierung von Proteinen und synaptischen Markern in primärer Neuronen

DOI:

10.3791/61434

⸱

October 31st, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll zeigt, wie man eine hochauflösende Mikroskopie einsetzt, um die Proteinkolokalisierung in primären neuronalen Kulturen zu untersuchen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synapsen sind die funktionellen Elemente von Neuronen und ihre Defekte oder Verluste sind die Grundlage für mehrere neurodegenerative und neurologische Erkrankungen. Bildgebende Studien werden häufig verwendet, um ihre Funktion und Plastizität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Aufgrund ihrer Größe und Struktur erfordern Lokalisierungsstudien von Proteinen hochauflösende bildgebende Verfahren. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung der Kolokalisierung von Zielproteinen mit synaptischen Markern in Primärneuronen auf einer Superauflösungsebene mittels strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM). SIM ist eine gemusterte Lichtbeleuchtungstechnik, die die räumliche Auflösung der Weitfeldmikroskopie verdoppelt und ein Detail von etwa 100 nm erreicht. Das Protokoll gibt die erforderlichen Kontrollen und Einstellungen für robuste Co-Lokalisierungsstudien und einen Überblick über die statistischen Methoden zur korrekten Analyse der Bilddaten an.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Verständnis und die Sicht der Synapse hat sich seit ihrer ersten Beschreibung durch Foster und Sherrington im Jahre 1897 enorm verändert1. Seitdem ist unser Wissen über neuronale Kommunikation und die dahinter stehenden molekularen Prozesse exponentiell gewachsen2. Es ist klar geworden, dass Synapsen als ein Zwei-Kompartime-System gedacht werden können: ein präsynaptisches Fach mit Vesikeln für die Freisetzung von Neurotransmittern und ein postsynaptisches Fach mit Rezeptoren3. Diese vereinfachende Sichtweise hat sich in den letzten zwanzig Jahren zu einem komplexen Netzwerk von Proteinen entwickelt, die erforderlich sind, um die Senderbindung in die Signalisierung4zu transduzieren.

Die Gewinne im Verständnis sind teilweise auf Super-Resolution-Techniken zurückzuführen, die die Beugungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie überschritten haben, um der Dimension der Synapsen besser5,6,7,8,9,10anzupassen. Aufgrund der Beugungsgrenze kann ein optisches Mikroskop seitlich keine Auflösung über 200 nmerreichen 11,12. Um diese Grenze zu umgehen, wurden Super-Resolution-Techniken entwickelt, die verschiedene Ansätze und verschiedene Sub-Diffraktions-Limit-Auflösungen erreichten: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) und STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM verdoppelt die räumliche Auflösung laserbasierter Weitfeldmikroskopiesysteme, indem ein Beugungsgitter in den Anregungsstrahlpfad15eingebracht wird. Das bewegliche Gitter diffriert die Laserstrahlen, um ein bekanntes Beleuchtungsmuster zu erzeugen, in der Regel Streifen. Dieses zweckdienlich strukturierte Lichtmuster wird der unbekannten räumlichen Verteilung des Fluoreszenzfarbstoffs (der Probe) überlagert. Die Interferenzfranen, die durch die beiden Muster gebildet werden, kodieren für sonst ununterscheidbare Feine Details mit normaler Weitfeldmikroskopie. Das endgültige superaufgelöste Bild wird durch Die Kombination und Dekodierung mit mathematischen Methoden mehrere Rohbilder derselben Probe erhalten durch die Übersetzungen und Drehungen des Beugungsgitters erhalten. Die Auflösung der superaufgelösten Bilder erreicht 100 nm in der Seitlichen und 500 nm in axialen Richtungen für 2D-SIM15 oder 100 nm in der Seitlichen und 250 nm in axialen Richtungen für 3D-SIM16.

Das neue Verständnis der Synapse ist noch wichtiger angesichts der vielen neurologischen Störungen, bei denen synaptische Dysfunktion spielt eine wichtige Rolle bei Beginn und Progression17,18. Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Parkinson-Krankheit, Prion-Erkrankungen, Epilepsie, Autismus-Spektrum-Störungen und fragile x-Syndrom unter anderem wurden mit Anomalien in der synaptischen Zusammensetzung, Morphologie und Funktion19,,20,21,22verbunden.

Kürzlich haben wir mit einer Reihe von SUMO-spezifischen Antikörpern SIM verwendet, um die Kolokalisierung in primären Hippocampus-Neuronen der SUMO-Proteine mit den prä- und postsynaptischen Markern Synaptophysin und PSD95 auf Superauflösungsebene23zu zeigen. Dies ermöglichte es uns, biochemische und konfokale Mikroskopie-Beweise für die SUMO-Lokalisierung in Neuronen zu bestätigen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der Lokalisierung von Proteinen in Maus-Hippocampus-Primärneuronen. Gleichzeitig kann dieses Protokoll an verschiedene Arten von primären neuronalen Kulturen angepasst werden.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Primärkulturen

  1. Kultur Maus Hippocampus primäre Neuronen in kammerförmigen Abdeckungen (wie Ibidi μ-Slide 8 Well oder Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass), die die objektive Anforderung für #1,5 (0,17 mm) Abdeckung dicke entsprechen.
  2. Mantelkammer-Abdeckungen mit 100 l Poly-L-Lysin (100 g/ml).
  3. Am nächsten Tag die kammerförmigen Deckel zweimal mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) waschen.
  4. Um Maus primär neuronen zu erhalten, isolieren Hippocampi von P1-P4 Welpen23.
  5. Legen Sie sezierte hippocampi in 10 ml Dissektionsmedien (Tabelle 1) und lassen Sie sie an der Unterseite der Röhre ablagern.
  6. Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette vorsichtig die Dissektionsmedien, sodass das Hippocampi am Boden des Rohres ungestört bleibt.
  7. 10 ml Medien 1 (Tabelle 1) in das Hippocampi geben und 30 Minuten bei 37 °C brüten.
  8. Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette sorgfältig Media 1, so dass das Hippocampi an der Unterseite des Rohres ungestört bleibt.
  9. 10 ml Medien 2 (Tabelle 1) hinzufügen und das (gekapselte) Zentrifugenrohr horizontal für 45 Minuten unter der Haube lassen.
  10. Lassen Sie das Zentrifugenrohr vertikal stehen, damit sich das Gewebe an der Unterseite des Rohres absetzen kann.
  11. Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette sorgfältig Media 2, so dass das Hippocampi am Boden des Zentrifugenrohrs ungestört bleibt.
  12. Fügen Sie 2 ml Medien 3 hinzu (Tabelle 1).
  13. Mit einer p1000 Pipette mit gefilterter Spitze, trennen Sie zellen mechanisch vom Gewebe.
  14. Übertragen Sie den Überstand, in dem sich die isolierten Neuronen befinden, auf ein 15 ml Zentrifugenrohr.
  15. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 2 min bei 300 x g bei Raumtemperatur (RT).
  16. Nach der Zentrifugation befinden sich die Zellen am Boden des Zentrifugenrohrs. Mit einer sterilen Pipette entsorgen Sie den Überstand.
  17. ResuspendZellen in 1 ml Von Medien 4.
  18. Verwenden Sie einen 70-mm-Filter, um nicht soziierte Zellen zu eliminieren.
  19. Zählen Sie lebensfähige Zellen in einer Bürker-Kammer, indem Sie 1 l von 0,4 % Trypan-Blaulösung zu 19 l der Zellsuspension hinzufügen.
  20. Plattenzellen bei 70.000 Zellen/Well in einem Volumen von 200 l pro Brunnen.
  21. Lassen Sie die Zellen für 2 h in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2anbringen.
  22. Nehmen Sie die kammerförmigen Abdeckungen aus dem Inkubator und ersetzen Sie das Medium sorgfältig durch 200 L Kulturmedien.
  23. Lassen Sie die kammerförmigen Abdeckungen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.
  24. Ersetzen Sie alle 5-7 Tage ein Drittel des Mediums durch frische Kulturmedien.
  25. Warten Sie, bis die primären Neuronen des Hippocampus vollständig ausgereift sind (12-14 Tage nach der Beschichtung), um Co-Lokalisierungsstudien durchzuführen.

2. Immunfluoreszenzfärbung

  1. Nehmen Sie die kammerförmigen Abdeckungen aus dem Inkubator.
  2. Entfernen Sie das Medium.
  3. Waschen Sie die Brunnen schnell mit 200 l PBS.
  4. Fügen Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS (200 L/Well) zu Neuronen hinzu, um sie schnell zu beheben.
  5. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei RT.
  6. Entfernen Sie die PFA-Lösung.
  7. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie PBS mit 0,2% Triton X-100 (200 l/well) hinzufügen.
  8. 1 min bei RT inkubieren.
  9. Entfernen Sie die Lösung und inkubieren Sie die Proben mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (200 l/well) für 1 h bei RT, um alle freien Bindungsflächen der Platte passiv mit einem irrelevanten Protein für die Analyse abzudecken. Ein BSA-basierter Blockierpuffer ohne Triton X-100 reduziert den Antikörperhintergrund effizienter als der gleiche Puffer mit 0,2% Triton X-100.
  10. Entfernen Sie die Lösung.
  11. Fügen Sie den primären Antikörper der Wahl in einer PBS-Lösung mit 1% BSA und 0,2% Triton X-100 (120-200 l/well, abhängig von der Antikörperverdünnung und Verfügbarkeit) hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 2 h.
    1. Als Negativkontrolle, fügen Sie keinen primären Antikörper zu einem der Brunnen. Mehrere Antikörper verschiedener Arten gegen unterschiedliche Ziele können gleichzeitig verwendet werden. Verwenden Sie einen Antikörper gegen MAP2 (einen neuronalen Marker), der in Hühnern aufgezogen wird, einen Antikörper gegen PSD95 oder Synaptophysin, der in der Maus aufgezogen wird, und einen Antikörper gegen ein Zielprotein, das bei Kaninchen aufgezogen wird. Dies ermöglicht dreifarbige SIM-Analysen.
  12. Waschen Sie die Brunnen schnell dreimal mit PBS (200 l/well).
  13. Fügen Sie sekundäre Antikörper hinzu (dyLight und Alexa sekundäre Antikörper können beide verwendet werden), die in einer PBS-Lösung mit 1% BSA und 0,2% Triton X-100 (200 l/well) verdünnt werden. Inkubieren Sie die Proben für 1 h bei RT.
  14. Waschen Sie die Brunnen schnell dreimal mit PBS (200 l/well).
  15. Fügen Sie Hoechst-Farbstoff in einer Konzentration von 1 g/ml in PBS (200 l/well) verdünnt, um Kerne zu färben. Inkubieren Sie die Proben für 10 Minuten bei RT.
  16. Waschen Sie die Brunnen schnell zweimal mit PBS.
  17. Mounten Sie Zellen mit einem SIM-kompatiblen Mountant. Verwenden Sie 10 L/Well von ProLong Glass Antifade Mountant.
  18. Bedecken und schützen Sie die Zellen mit einem Deckglas (z.B. einem runden Deckglas mit einem Durchmesser von 8 mm). Quadratische können auch verwendet werden.
  19. Bewahren Sie die kammerförmigen Abdeckungen bei RT auf und warten Sie mindestens 48 h, bevor Sie Bilder erfassen. Diamond Glass benötigt mindestens zwei Tage aushärten, bevor Super-Resolution-Akquisitionen getätigt werden.

3. Antikörper-Spezifitätskontrolle

HINWEIS: Verwenden Sie zwei Strategien, um die Spezifischenität des Antikörpers zu gewährleisten. Die erste Strategie besteht darin, mindestens zwei verschiedene Antikörper zu verwenden, die auf dasselbe Substrat abzielen. Die zweite Strategie ist die Antikörperneutralisation durch Inkubation mit dem gereinigten Proteinziel oder dem Epitop, das zur Erhöhung des Antikörpers verwendet wird.

  1. Inkubieren Sie den Antikörper der Wahl mit einem fünfmal mehr als dem rekombinanten Ziel oder Epitop für 1 h bei RT in 1% BSA in PBS.
  2. Verwenden Sie nach der Inkubation den neutralisierten Antikörper in der üblichen Färbungskonzentration, wie oben beschrieben ab 2.11.

4. Mikroskopkalibrierung

HINWEIS: Wir verwenden routinemäßig ein N-SIM Super-Resolution Microscope System von Nikon für die Super-Resolution-Studien. Einige andere Unternehmen bieten in ihren Katalogen aber auch Hochauflösende Mikroskope an. Obwohl spezifische Indikationen für Nikons N-SIM-System beschrieben werden, können die folgenden Anweisungen auf andere Systeme verallgemeinert werden. Vor der Erfassung von SIM-Bildern erfordert das System eine ordnungsgemäße Kalibrierung mit bestimmten Fluoreszenzperlen in Subauflösungsgröße. Ein Beispiel sind die TetraSpeck-Mikrosphären. Diese Perlen sind mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt, um die Kalibrierung verschiedener Laser mit einer Probe zu ermöglichen.

  1. In einem Wasserbad beschallen sie 1,8 x 108 fluoreszierende Mikrosphären für 10 Minuten. Nikons N-SIM-System benötigt für die Kalibrierung eine dünn besiedelte mehrfarbige Perlenprobe. Dies kann sich bei anderen Systemen unterscheiden, die eine dichte Einzelschicht mit fluoreszierenden Perlen in Subauflösungsgröße benötigen. Passen Sie die Anzahl der fluoreszierenden Partikel entsprechend an.
  2. Verdünnen Sie die fluoreszierenden Mikrosphären 1:500 in doppelt destilliertem Wasser.
  3. Ein zweites Mal für weitere 10 Minuten beschallen.
  4. Pipetten Sie 15 l der verdünnten Perlen in einen Brunnen eines kammerkammerigen Deckellips.
  5. Lassen Sie die Lösung für 5 Minuten bei RT trocknen.
  6. Fügen Sie 10 l der Montagelösung hinzu und legen Sie einen 8 mm Abdeckzettel darüber.
  7. Warten Sie mindestens 48 Stunden, um eine ordnungsgemäße Aushärtung zu ermöglichen.
  8. Schalten Sie das Mikroskop und die Laser ein.
  9. Lassen Sie das System aufwärmen, um das thermische Gleichgewicht aller Mikroskopkomponenten zu erreichen. Das N-SIM Super-Resolution Microscope System benötigt mindestens 3 Stunden.
  10. Wählen Sie das 100x-Ziel aus.
  11. Starten Sie die Kalibrierung, indem Sie die Laser auf die Mitte des Beugungsgitterblocks ausrichten. Im N-SIM-System ermöglichen ein Mikrometerknopf und eine spezielle Kamera die Zentrierung der Lichtstrahlen zum Ziel.
  12. Legen Sie den kammerierten Deckelschlupf in das Mikroskop ein, um ihn zu betrachten. Stellen Sie das System auf die kammerierte Deckslipdicke ein, indem Sie den Objektivkorrekturkragen anpassen. Die NIS-Software, die proprietäre Software, die mit N-SIM Super-Resolution Microscope Systemen geliefert wird, verfügt über eine automatische Funktion zur Regulierung von Korrekturhalsbändern.
  13. Passen Sie den Gitterblockfokus für jeden Kanal an, um eine fokussierte strukturierte Musterbeleuchtung auf der Probe zu gewährleisten. Die NIS-Software bietet eine automatische Funktion für diese Aufgabe.
  14. Als nächstes erwerben Sie rohe 3D-SIM-Bilder der mehrfarbigen Mikrosphären. Rekonstruieren Sie die Rohbilder, um ein super aufgelöstes Bild mit der Mikroskop-Software oder der Open-Source-Software-Plattform für die Analyse biologischer Bilder ImageJ24 und das Plugin fairSIM25zu erhalten.
  15. Berechnen Sie für jede getrennte Wellenlänge die Fourier-Transformation des superaufgelösten Bildes, das in 4.14 erhalten wurde. Wenn das transformierte Bild kein korrektes blütenähnliches Muster erhält, starten Sie die Kalibrierung ab 4.11 neu, da keine Superauflösung erreicht wurde.
  16. Wählen Sie im super aufgelösten Bild eine einzelne Mikrosphäre aus, und berechnen Sie ihr Intensitätsprofil für jeden Kanal, um die erreichte Auflösung zu messen. Es sollte jetzt in der Nähe von 100 nm seitlich sein.
  17. Führen Sie als Nächstes die Kanalregistrierung durch, indem Sie eine Mehrkanalerfassung der Mikrosphären überlagern. Ziel ist es, alle Kanalsignale seitlich und axial zu kollidieren. Dadurch werden chromatische Aberrationen aufgrund der Fehlausrichtung der verschiedenen Kanäle beseitigt und die Analyse der Kolokalisierung hilfreich.
  18. Bestätigen Sie die Qualität der Kalibrierung mit den Funktionen "Illumination Phase Steps" und "Illumination Pattern Focus" von SIMcheck26, einer Suite von Plugins für die Open-Source-Anwendung ImageJ. Zu diesem Zweck bereiten Sie einen kammerförmigen Abdeckschein vor, um eine dichte Einzelschicht von TetraSpeck-Mikrosphären zu erhalten, und erfassen Sie ein 3D-SIM-Bild der Probe. Analysieren Sie das Bild in ImageJ, und starten Sie die Mikroskopkalibrierung ab Schritt 4.11 neu, wenn Aberrationen erkannt werden.

5. Erwerb

  1. Beginnen Sie mit der Analyse der Probe mit einem 40-fachen Objektiv im konfokalen oder Weitfeldmodus. Dies ermöglicht die Navigation zum Beispiel, wobei gute Details und ein großes Sichtfeld beibehalten werden.
  2. Verwenden Sie das MAP2-Antikörpersignal, um einen Bereich zu identifizieren, der neuronale Prozesse darstellt.
  3. Erfassen Sie Bilder der Probe im konfokalen Modus, um die Qualität der Färbung zu bestimmen. Schlechte konfokale Qualität spiegelt sich in schlechter SIM-Qualität wider, so dass die Proben entsorgt werden müssen.
  4. Wenn der Bereich und die Qualität der Bilder zufriedenstellend sind, schalten Sie das Ziel auf 100x.
  5. Öl auf das 100x-Objektiv auftragen.
  6. Erwerben Sie ein Weitfeld- oder Konfokalbild, das später verwendet wird, um die Qualität des super aufgelösten Bildes zu bewerten (Abbildung 1A,B).
  7. Wechseln Sie in den 3D-SIM-Modus.
  8. Wählen Sie mithilfe von Dialogfenstern, um Parameter für die Erfassung festzulegen, die höchste verfügbare Bittiefe aus, um Farbinformationen zu maximieren. In der Regel ist 16-Bit die Standardwahl. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wählen Sie außerdem einen niedrigen Frequenzwert für die Erfassung, z. B. 1 MHz.
  9. Mit Histogrammfenstern können Sie die Leistung von Lasern einstellen, um eine lineare Signalantwort zu erhalten. Um Informationsverlust zu vermeiden, begrenzen Sie gesättigte Pixel in den Bildern. Das N-SIM-System verwendet eine Andor iXon3 Kamera. Wählen Sie bei 16-Bit eine Zielintensität von 16.000 aus, um das lineare Ansprechen der Kamera sicherzustellen. Alternativ können Sie einen Bereich zwischen 30.000 und 45.000 auswählen, um den Dynamikbereich der Erfassung zu maximieren.
  10. Stellen Sie die Laserleistung zwischen 0,1 % und 50 % bei der Abbildung der Proben und belichtungszeiten zwischen 50 ms und 2 s ein. Laserleistungen über 50% können zu einer schnellen Photobleichung der im Einsatz sindden Fluorophore führen.
  11. Beginnen Sie mit dem Erfassen der Bilder im 3D-SIM-Modus.
  12. Verwenden Sie SIMcheck, eine Suite von kostenlosen Plugins für ImageJ, um die Qualität der Erfassung der Rohbilder zu bewerten.
  13. Wenn SIMCheck keine Artefakte oder Qualitätsprobleme erkennt, erfassen Sie mindestens 10 Bilder aus 4 technischen Replikationen, um statistische Analysen zu ermöglichen.

6. Postproduktion: Bildrekonstruktion

HINWEIS: 3D-SIM-Bilder sind Rohbilder, die verarbeitet werden müssen, um rekonstruierte, super aufgelöste Bilder zu erhalten. Eine falsche Rekonstruktion von Rohbildern kann zu Artefakten führen, die sich auf die Analyse der Proben auswirken würden. Daher sollte der richtigen Auswahl der Rekonstruktionsparameter große Aufmerksamkeit geschenkt werden.

  1. Verarbeiten Sie die Rohbilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionsanalyse-Software, um ein super aufgelöstes Bild zu erhalten (Abbildung 1C). Alternativ können Sie das frei verfügbare ImageJ-Plugin fairSIM verwenden, um Rohbilder zu rekonstruieren.
  2. Berechnen Sie die Fourier-Transformation der superaufgelösten Bilder mit der Mikroskop-Rekonstruktionssoftware oder dem ImageJ-Plugin SIMCheck. Ein gutes rekonstruiertes Bild sollte für jeden Kanal ein blumenartiges Bild zurückgeben. Wenn die rekonstruierten Bilder keine blumenähnliche Form wieder herstellen, starten Sie die Rohbilder neu und rekonstruieren Sie sie, indem Sie die Rekonstruktionsparameter wie Wiener Filterung, Apodisierung und Null-Ordnungsunterdrückung27ändern. In der NIS-Software, mit der Vorschau zu überwachen, wie das Ändern der Parameter auswirkungen sich auf das endgültige aufgelöste Bild, ändern Sie die Parameter i) Beleuchtung Modulation Kontrast, ii) High Resolution Noise Suppression und iii) Out of Focus Suppression.
  3. Als Nächstes analysieren Sie das rekonstruierte Bild, um Artefakte unvoreingenommen zu erkennen, indem Sie NanoJ-SQUIRREL28verwenden, ein ImageJ-basiertes Plugin, um die Qualität von super aufgelösten Bildern zu bewerten.
  4. Wenn NanoJ-SQUIRREL Artefakte erkennt, starten Sie die Rohbilder neu und rekonstruieren Sie sie, indem Sie die Rekonstruktionsparameter wie Wiener Filterung, Apodisierung und Unterdrückung ohne Ordnung ändern. Ändern Sie in der NIS-Software mithilfe der Vorschau, um zu überwachen, wie sich das Ändern der Parameter auf das endgültige aufgelöste Bild auswirkt, die Parameter Beleuchtungsmodulationskontrast, Rauschunterdrückung mit hoher Auflösung und Unterdrückung averfokussiert.
  5. Verwenden Sie die super aufgelösten Bilder, um das Kolokalisierungsprofil und/oder die Koeffizienten von Pearson und Mander zu berechnen.

7. Co-Lokalisierung mit Profilanalyse

HINWEIS: Als ersten Schritt zur Untersuchung der Kolokalisierung zwischen synaptischen Markern und einem Protein von Interesse, nehmen Sie ein super aufgelöstes Bild und analysieren Sie einen einzelnen Ort, um Signalüberlappung zu bestimmen.

  1. Identifizieren Sie einen einzelnen Standort auf dem super aufgelösten Bild.
  2. Erhalten Sie die Intensitätsprofile der fluoreszierenden Signale des Ortes von Interesse.
  3. Exportieren Sie die Daten.
  4. Verwenden Sie GraphPad Prism oder eine ähnliche Analysesoftware, um alle Signalspitzen zu normalisieren und vergleichbare Signalintensitäten für jeden Kanal zu erhalten, mit dem Endziel, die locus-spezifische Co-Lokalisierung zu bestimmen.

8. Quantifizierung der Koeffizienten von Pearson und Mander

ANMERKUNG: Wenn die Profilanalyse eine Single-Locus-Kolokalisierung vorgeschlagen hat, kann eine allgemeinere Analyse des gesamten Bildes durch Berechnung der Koeffizienten von Pearson und Mander29,30durchgeführt werden.

  1. Verwenden Sie JACoP31, ein ImageJ-Plug-In, um die beiden Parameter der Co-Lokalisierung zu bestimmen: Pearson es und Mander's.

9. Statistische Analyse

  1. Verwenden Sie GraphPad Prism oder eine ähnliche Analyse- und Grafiksoftware, um mit JACoP gesammelte Daten zu verarbeiten.
  2. Verwenden Sie mindestens 40 SIM-Bilder für jede analysierte Bedingung, um Diagramme zu erhalten und um statistische Relevanz zu erhalten.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren hier den Standard-Workflow zur Kolokalisierung neuronaler Proteine. Wir haben zuerst das Mikroskop kalibriert und als nächstes die SIM-Analyse der Proben durchgeführt. Zur Kalibrierung des Systems verwendeten wir fluoreszierende Mikrosphären mit einem Durchmesser von 0,1 m. Nach dem Erhalt von super aufgelösten 3D-SIM-Bildern der Perlen werden die zugrunde liegenden Bilddaten Fourier-transformiert, um sie in eine räumliche Frequenzdarstellung umzuwandeln. In Abbildung 2Awird...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Aufklärung der Struktur und Zusammensetzung der Synapse ist entscheidend für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse, die Gedächtnis und Kognition regulieren. Während im normalen Zustand, Synapsen sind die Bausteine des Gedächtnisses, Sie auch zugrunde liegen komplexe neurologische Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit32. Das hier beschriebene Protokoll dient dazu, die Kolokalisierung neuronaler Proteine mit einer superhochauflösenden Mikroskopietechnik namens SIM zu unt...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Edoardo Micotti für die konstruktive Kritik an dem Manuskript. Diese Studie wurde unterstützt von BrightFocus A2019296F, von Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), von Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) und vom Marie Skéodowska-Curie Innovative Training Network (JK).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,4 % Trypanblau-Lösung Thermo Fisher Scientific15250061Chemical
70 & Mikro; m Filter Corning352350Equiment
AlexaThermo Fisher Scientific-Antikörper
Antikörper SENP1Santa Cruzsc-271360Antikörper
B27 ErgänzungLife Technologies17504044Chemisches
Rinderserumalbumin Merck5470Chemisches
CaCl2Merck Life Science21115Chemisches
Ibidi80826Equiment
DyLightThermo Fisher Scientific-Antikörper
FBS (Hyclone)GIBCOSH3007002 (CHA1111L)Serum
FluoSpheres carboxylatmodifizierte Mikrosphären, 0,1 μ m, gelb– grün fluoreszierendThermo Fisher ScientificF8803Equiment
GlucoseMerck Life ScienceG8769Chemikalie
GlutamaxGIBCO35050061Chemikalie
HEPESMerck Life ScienceH3537Chemikalie
L-CysteinMerck Life Science C6852-25gChemikalie
MAP2MerckAB15452Antikörper
MEM Life Technologies21575022Medium
MgClMerck Life ScienceM8266Chemie
NaOHVWR International1,091,371,000Chemisch
Neurobasal ALife Technologies10888022Medium
N-SIM Super Resolution MikroskopNikon-Instrument
PapainMerck Life Science& nbsp;P-3125Chemisches
ParaformaldehydThermo Fisher Scientific28908Chemischer
Stift/Strep 10xLife Technologies15140122Chemisch
phosphatgepufferte Kochsalzlösung Gibco10010023Chemical
Poly-L LysinSigmaP2636Chemical
ProLong Diamond Glass Antifading EindeckmittelThermo Fisher ScientificP36970Chemical
PSD95 NeuroMabK28/43Antikörper
Rundes DeckglasThermo12052712Equiment
SUMO1Abcamab32058Antikörper
Synaptophysin MerckS5768 Antikörper
Triton X-100 MerckT8787Chemischer
Trypsin-InhibitorMerck Life Science T9003-500MGChemikalie
Deckglas

References

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