Bewertung des Ausdrucks der Haupthistokompatibilität scomplex Klasse I auf primären murine nurinischen Hippocampus-Neuronen durch Flow Cytometry

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung primärer Hippocampus-Neuronen aus dem embryonalen Maushirn. Der Ausdruck der großen Histokompatibilitätskomplexklasse I auf der extrazellulären Oberfläche kultivierter Neuronen wird dann durch zytometrische Flussanalyse bewertet.

Abstract

Zunehmende Beweise stützen die Hypothese, dass neuroimmune Wechselwirkungen die Funktion des Nervensystems sowohl bei homöostatischen als auch bei pathologischen Bedingungen beeinflussen. Eine gut untersuchte Funktion der großen Histokompatibilitätskomplexklasse I (MHCI) ist die Darstellung von zellabgeleiteten Peptiden für das adaptive Immunsystem, insbesondere als Reaktion auf Infektionen. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass die Expression von MHCI-Molekülen auf Neuronen aktivitätsabhängige Veränderungen der synaptischen Konnektivität während der normalen Entwicklung und neurologischen Störungen modulieren kann. Die Bedeutung dieser Funktionen für die Gesundheit des Gehirns unterstützt die Notwendigkeit eines empfindlichen Assays, der die MHCI-Expression auf Neuronen leicht erkennt. Hier beschreiben wir eine Methode zur primärer Kultur der murinen Hippocampus-Neuronen und anschließend die Bewertung der MHCI-Expression durch zytometrische Flussanalyse. Der murinische Hippocampus wird am embryonalen Tag 18 von pränatalen Mauswelpen mikroseziert. Gewebe wird mit enzymatischen und mechanischen Techniken in eine einzelzellige Suspension zerlegt und dann in einem serumfreien Medium kultiviert, das das Wachstum nicht-neuronaler Zellen begrenzt. Nach 7 Tagen in vitro wird die MHCI-Expression durch pharmakologisch eiternde Behandlung kultivierter Zellen mit Beta-Interferon stimuliert. MHCI-Moleküle werden in situ mit einem fluoreszierend markierten Antikörper gekennzeichnet, dann werden Zellen nicht enzymatisch in eine einzellige Suspension dissoziiert. Um die neuronale Identität zu bestätigen, werden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert, permeabilisiert und mit einem fluoreszierend markierten Antikörper gekennzeichnet, der das neuronale Kernantigen NeuN erkennt. Die MHCI-Expression wird dann durch zytometrische Flussanalyse auf Neuronen quantifiziert. Neuronale Kulturen können leicht durch genetische Modifikationen oder pharmakologische Interventionen manipuliert werden, um spezifische Hypothesen zu testen. Mit leichten Modifikationen können diese Methoden verwendet werden, um andere neuronale Populationen zu kultitogen oder die Expression anderer Proteine von Interesse zu bewerten.

Introduction

Das zentrale Nervensystem (ZNS) galt einst als frei von Immunüberwachung, genannt als "immunprivilegiert¹". Es ist jetzt klar, dass dieses Privileg nicht gleichbedeutend mit dem absoluten Fehlen von Immunkomponenten ist, sondern mit einer speziellen Regelung, die funktioniert, um den Schaden im Zusammenhang mit der Immunpathologie zu begrenzen¹. In der Tat, Kommunikation zwischen dem ZNS und dem Immunsystem ist ein laufendes Gespräch, das für eine gesunde Gehirnentwicklung und Reaktion auf Infektionen notwendig ist^2,3.

Wichtige Histokompatibilitätskomplex-Moleküle der Klasse I (MHCI) sind polygene und polymorphe Transmembranproteine, die am besten für ihre Funktion bei der Darstellung antigener Peptide gegenüber CD8⁺ T-Zellen während der Infektion⁴bekannt sind. Klassische MHCI-Komplexe bestehen aus einer Transmembran-α-Kette und einer extrazellulären Lichterkette, der sogenannten 2-Mikroglobulin. Die α-Kette enthält eine polymorphe Nut, die ein antigenes Peptid für Diepräsentation⁵bindet. Die richtige Expression von MHCI auf der extrazellulären Membran erfordert eine koordinierte Wirkung molekularer Chaperonen am endoplasmatischen Retikulum, um eine ordnungsgemäße Faltung des α-Kette und des 2-Mikroglobulins zusammen mit der Belastung eines Hochaffinitätspeptidligands zu gewährleisten⁵. Erst wenn MHCI-Komplexe zusammengesetzt sind, werden sie aus dem endoplasmatischen Retikulum in die Plasmamembran⁶exportiert. Nach Der Einbindung des kogatierten T-Zellrezeptors mit dem Peptid-belasteten MHCI-Komplex vermitteln CD8⁺ T-Zellen die Zelltötung durch Freisetzung von lytischem Granulat, das Perforin und Granzyme enthält, oder durch Induktion von Apoptose durch Bindung des Fas-Rezeptors auf die Zielzellmembran⁷. Zusätzlich produzieren CD8⁺ T-Zellen Zytokine, wie Gamma-Interferon (IFN) und Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF), die antivirale Mechanismen in infizierten Zellen ohne zytopathische Wirkungen aktivieren können^8,9. Für viele neurotrope Viren sind CD8⁺ T-Zellen notwendig, um die Infektion von der ZNS^10,11,12zu befreien.

Es wurde früher angenommen, dass Neuronen MHCI nur unter Bedingungen von Schäden, Virusinfektionen oder mit In-vitro-Zytokinstimulation ausdrücken. Kürzlich hat die Forschung eine Rolle für die neuronale Expression von MHCI bei synaptischen Remodeling und Plastizität^{identifiziert 13,14}. Obwohl die genauen Mechanismen, die der Synapsenregulation zugrunde liegen, nicht gut verstanden werden, deuten die Daten darauf hin, dass der MHCI-Expressionsgrad durch die synaptische Aktivität^15,16reguliert wird. Eine Hypothese geht davon aus, dass Neuronen gepaarte Immunglobulin-ähnliche RezeptorEn B (PirB) präsynaptisch ausdrücken, die MHCI transynaptisch^13,17bindet. Diese Wechselwirkung initiiert eine Signalkaskade von PirB, die sich gegen Wege wendet, die an der synaptischen Umgestaltung beteiligt sind, wodurch die synaptische Verbindung^17,18,19verstärkt und stabilisiert wird. In Ermangelung einer neuronalen Aktivität wird die MHCI-Expression um¹⁴verringert, und der Verlust von MHCI führt zu einer fehlerhaften Synapsenelimination und falsch organisierten synaptischen Schaltkreisen^20,21.

Der hier beschriebene Assay, der von Chevalier et al.⁹adaptiert wurde, verwendet eine zytometrische Flussanalyse, um die extrazelluläre Proteinexpression von MHCI auf Primärkulturen muriner Hippocampus-Neuronen quantitativ zu bewerten. Dieses Protokoll veranschaulicht die ersten Techniken zur Mikrosezieren von Hippocampusgewebe aus embryonalen Mauswelpen. Es beschreibt dann Prozesse für die enzymatische und mechanische Dissoziation von Gewebe in eine einzelzellige Suspension und Methoden zur Aufrechterhaltung der Kulturen in vitro. Weil sie sich nicht teilen, müssen Neuronen, sobald sie in der Kultur sind, in einer Schale und einer Dichte plattiert werden, die für ihren experimentellen Endpunkt geeignet ist. Als nächstes werden Schritte zur Induktion der MHCI-Expression mit Beta-Interferon (IFN), zur Immunkennzeichnung für MHCI und neuronalen Kernmarker NeuN und zur Analyse von Zellen durch Durchflusszytometrie beschrieben. Schließlich werden Verfahren zur Bewertung der Durchflusszytometriedaten zur Identifizierung von MHCI-positiven Neuronen und zur Quantifizierung des Niveaus der MHCI-Expression beschrieben. In diesem Protokoll sind auch kleine Anpassungen aufgeführt, die vorgenommen werden können, um kortikale Neuronen zusätzlich zu oder anstelle von Hippocampus-Neuronen zu kulturieren. Dieses Protokoll kann leicht geändert werden, um spezifische Hypothesen mit genetischen Variationen oder pharmakologischen Behandlungen zu testen.

Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health und nach den internationalen Leitprinzipien für biomedizinische Forschung mit Tieren durchgeführt. Das Protokoll wurde von der University of North Carolina im Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll #19-020) genehmigt.

1. Vorbereitung auf die Kultur

HINWEIS: Diese Verfahren sollten unter sterilen Bedingungen in einem von Gewebekulturen bezeichneten Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Siehe Tabelle 1 für Medien und Lösungen.

1. Sterilisieren Sie alle Sezierwerkzeuge durch Autoklavieren in selbstdichtenden Sterilisationsbeuteln.
2. Bereiten Sie Arbeitsbestände an Poly-D-Lysin für die Behandlung von 12-Well-Kultur-Gerichte.
   1. Setzen Sie Poly-D-Lysin in 1x Boratpuffer auf und bis zu einer Konzentration von 100 g/ml (10x konzentriert). Ca. 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern, bis es benötigt wird.
   2. 10x konzentriertes Poly-D-Lysin in dPBS auf 10 g/ml (1x) verdünnen und filtersterilisieren.
   3. 12-Well-Kulturplatten mit 0,5 ml pro Brunnen von 1x Poly-D-Lysin bei Raumtemperatur mindestens 1 h oder über Nacht für die Verwendung am nächsten Tag behandeln. Stellen Sie sicher, dass das Volumen von Poly-D-Lysin ausreicht, um den unteren Rand des Kulturbereichs vollständig abzudecken.
   4. Kurz vor der Verwendung Entfernen Sie Poly-D-Lysin von der Kulturplatte, spülen Sie 3x in sterilem Wasser und halten Sie in sterilem Wasser, bis sie bereit sind, Zellen zu verplatten. Entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch eine gründliche Aspiration vor der Beschichtung von Zellen.
3. Bereiten Sie Neuron Growth Media und FACS-Puffer vor. Filter sterilisieren und bei 4 °C bis zum Gebrauch lagern. Neuron Growth Media kann für ca. 2 wks aufbewahrt werden; DER FACS-Puffer kann für ca. 4 wks aufbewahrt werden.

2. Sezieren des embryonalen Hippocampus

HINWEIS: Dieses Verfahren kann auf der Tischplatte durchgeführt werden, da es die Verwendung eines Stereomikroskops zur Entfernung von Meningen und Mikrodissektion des Hippocampus erfordert. Halten Sie sich an die strenge aseptische Technik, um potenzielle Verunreinigungen zu minimieren.

1. Euthanisieren Sie eine zeitschwangere C57BL/6J weibliche Maus am embryonalen Tag 18 in einer_CO2-Kammer.
2. Die Bauchhaut und das Fell mit 70% EtOH besprühen, dann die Haut mit Gewebezangen kneifen und mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt machen. Das Peritoneum dazu neigen, die Eingeweide und die Gebärmutter freizulegen.
3. Greifen Sie die Gebärmutter mit Standard-Musterzange, heben Sie aus der Höhle, und schneiden Sie die Verbindung zum Mesometrium mit feiner Schere. Gebärmutter mit Embryonen auf 100 mm sterile Kunststoffkulturschale auf Eis geben.
4. Mit feiner Schere und feinen Zangen, schneiden Sie vorsichtig die Gebärmutter und entfernen Sie die embryonalen Säcke, um Embryonen freizusetzen. Übertragen Sie Embryonen auf eine neue 100 mm sterile Kunststoffkulturschale mit dPBS, die auf Eis gelegt wird.
5. Enthaupten Sie embryonale Welpen mit einer feinen Schere und übertragen Sie Köpfe auf eine neue 100 mm sterile Kunststoffkulturschale, die Hibernate-E-Medium enthält, das auf Eis gelegt wird.
6. Um das Gehirn zu entfernen, halten Sie den Kopf mit einem Paar feiner Zange in einer Hand. Mit gekrümmten Dumont #7 Zangen in der anderen Hand, legen Sie die Spitze der Zange an der Basis des Schädels und kneifen sie den Knochen und die überlagernde Haut, die sich an der Mittellinie bewegt, ohne das Gehirn zu durchdringen.
7. Mit gekrümmten Zangen ziehen Sie die Haut und den Schädel auseinander, um das Gehirn zu belichten. Sweep die gekrümmten Zangen unter dem Gehirn von der exponierten Olfaktor-Lampe zum Kleinhirn, um das Gehirn aus dem Schädel zu heben. Übertragen Sie das Gehirn auf eine neue 100 mm sterile Kunststoffkulturschale mit Hibernate-E-Medium auf Eis gelegt. Wiederholen Sie dies für jedes Gehirn.
   HINWEIS: Alle Gehirne können in einem einzigen Kulturgericht gesammelt werden, es sei denn, es muss für experimentspezifische Zwecke getrennt werden.
8. Unter einem Stereo-Sektionsmikroskop, das mit einem Gehirn nach dem anderen und zwei Paaren steriler Dumont-#5 Zangen arbeitet, olfaktorische Glühbirnen abkniffen und Hirngebungen wegziehen. Eine gründliche Entfernung der Meningen ist notwendig, um eine Kulturelle Kontamination durch andere Zellen zu vermeiden und eine weitere Zerlegung zu ermöglichen.
9. Sobald Meningen richtig entfernt sind, öffnet sich die überlegene Seite des Kortex seitlich, wodurch der Hippocampus freilegt wird. Mit Dumont #5 Zangen, kneifen Sie den Hippocampus vom angeschlossenen Kortex weg und übertragen Sie isolierten Hippocampus vorsichtig auf ein steriles 15 ml konisches Rohr, das 5 ml Hibernate-E-Medium auf Eis enthält.
10. Wiederholen Sie die Sezieren für beide Gehirnhälften für jeden embryonalen Mauswelpen und kombinieren Sie alle Hippocampi zu einem einzigen 15 ml konischen Röhrchen, es sei denn, dies wird separat für experimentespezifische Zwecke benötigt.
    1. Um kortikale Neuronen zu kultur, kann der Kortex vom Subcortex getrennt und identisch mit Hippocampus-Neuronen verarbeitet werden.
       HINWEIS: An diesem Punkt kann das Protokoll angehalten werden. Speichern Sie Gehirne oder sezierte Hippocampi in Hibernate-E Medium ergänzt mit B27 (2%) bei 4 °C für bis zu 1 Monat, obwohl eine längere Verzögerung die Anzahl der lebensfähigen Zellen gefährden kann.

3. Dissoziierende und kultivierende Hippocampus-Neuronen

HINWEIS: Alle Verfahren sollten unter sterilen Bedingungen in einem als Biosicherheitsschrank bezeichneten Gewebekultur-Schrank durchgeführt werden.

1. Bereiten Sie 0,5 ml Papain-Dissoziationslösung pro Embryo für hippocampale Dissoziation vor. Das benötigte Volumen der Dissoziationslösung hängt von der Anzahl der embryonalen Gehirne ab, die seziert werden.
   HINWEIS: Für die kortikale Neuronenkultur 1,0 ml Papainlösung pro Embryo vorbereiten.
   1. Lösen Sie 20 l Papainsuspension pro 1 ml des Hibernate E Mediums durch Wirbeln für ca. 3 min auf.
   2. Nachdem Papain aufgelöst wurde, fügen Sie 1 l DNase I pro 1 ml der Lösung hinzu. Wirbeln Sie die Lösung nicht, nachdem DNase I hinzugefügt wurde, da dies das Enzym deaktivieren kann.
2. Zentrifuge 15 ml konische Röhre mit Hippocampusgewebe (Schritt 2.10) bei 1.000 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie Papain-Lösung hinzu. Setzen Sie das Gewebe wieder aus, indem Sie es mehrmals umkehren. Bei 37 °C für 30 min inkubieren, um das Gewebe alle 10 min wieder aufzuhängen.
   1. Wenn Sie kortikale Neuronen kultivieren, übertragen Sie alle Kortiken auf eine neue 100 mm sterile Kulturschale, saugen Sie sorgfältig Medien von der Platte und Hackfleischgewebe mit feiner Schere oder Rasierklinge. Papain-Lösung in die Kulturschale geben und kortikales Gewebe mit Papainlösung mit einer sterilen Transferpipette in 15 ml konische Röhre übertragen. Gewebe- und Enzymlösung bei 37 °C für 30 min inkubieren und alle 10 min aufregen.
3. Während 30 min Inkubation, bereiten Sie 3 feuerpolierte Glas Pasteur Pipetten: 1 vollständig offen, 1 hälfte offen und 1 Viertel offen.
4. Zentrifugieren Sie nach der 30 min Inkubation die 15 ml konische Röhre mit verdautem Hirngewebe bei 125 x g für 10 min. Entfernen Sie die Enzymlösung und ersetzen Sie sie durch ein gleiches Volumen an frischem Hibernate E Medium.
5. Mit vollständig geöffneter Pasteurpipette das Gewebe 10x trituieren. Lassen Sie das Gewebe für 2 min absetzen und übertragen Sie dann die überstande Zellsuspension in ein steriles 50 ml konisches Rohr. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Hibernate E Medium zurück zum Gewebe.
6. Mit halb offener Pasteur Pipette, triturat Gewebe 10x. Lassen Sie das Gewebe für 2 min absetzen und übertragen Sie dann die überstande Zellsuspension auf das gleiche 50 ml konische Rohr wie im vorherigen Schritt. Fügen Sie ein gleiches Volumen von Hibernate E Medium zurück zum Gewebe.
7. Mit Viertel offen Pasteur Pipette, triturate Gewebe 10x. Lassen Sie das Gewebe für 2 min absetzen, dann übertragen Sie die überstande Zellsuspension wieder auf die gleiche 50 ml konisch wie in den vorherigen Schritten. Entsorgen Sie das verbleibende Gewebe, das sich nicht dissoziiert hat.
8. Zentrifugieren Sie das 50 ml konische Rohr, das den Überstand aus der Zellsuspension bei 125 x g für 5 min enthält. Wenn nicht bereits getan, waschen Sie poly-D-Lysin-beschichtete Platten mit sterilem Wasser und entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch gründliche Aspiration während der Zentrifugation.
9. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Zellpellet in 5 ml Neuron Growth Media wieder aussetzen. Zählen Sie lebende Zellen mit Trypanblau und Hämozytometer.
   1. Wenn sie kortikale Neuronen kultivieren, fügen Sie mindestens 10 ml Neuron Growth Media für weniger dichte Zellen und genauere Zählung hinzu.
10. Verdünnung von Zellen mit Neuron Growth Media für eine endgültige Beschichtungsdichte von 5 x 10⁵ lebensfähigen Zellen pro ml und fügen Sie 1 ml verdünnte Zellsuspension zu jedem Brunnen einer 12-Well-Platte hinzu. Neuronen bei 37 °C mit 5%_CO2erhalten.
    HINWEIS: Typischerweise ergeben die Hippocampi von 1 embryonalen Maushirn, d.h. 2 Hippocampi, etwa 1 x 10⁶ lebensfähige Zellen. Diese Nummer wird nur für Experimentplanungszwecke bereitgestellt und sollte nicht als Ersatz für das Zählen von Zellen für jede Kultur betrachtet werden.
11. Ändern Sie die Wachstumsmedien am Tag nach der Kultur, indem Sie die Hälfte des Medienvolumens aus jedem Brunnen entfernen, d. h. 0,5 ml, und fügen Sie eine gleiche Menge an frischen Medien zur Seite des Brunnens hinzu, um zu vermeiden, dass die kultivierten Zellen gestört werden. Komplette Halbmedienwechsel zweimal wöchentlich für die Lebensdauer der Kultur.

4. Beurteilung der MHCI-Expression durch Durchflusszytometrie

1. Bereiten Sie die Behandlung durch Verdünnung von Interferon beta (IFN) oder einem gleichen Volumen von Verdünnungsmittel in Neuron Growth Media vor. Da der Medienwechsel ein halbbänderischer Wechsel sein wird, bereiten Sie Behandlungsmedien mit 2x konzentriertem IFN- d.h. zur Behandlung von 3 Brunnen einer 12-Well-Platte mit 100 U/ml IFN, 1,5 ml mit 200 U/ml IFN oder gleicher Menge ifN-Verdünnungsmittel für medienbehandelte Kontrollen vorbereiten.
2. Entfernen Sie 0,5 ml aus jedem Brunnen der Neuronen und fügen Sie 0,5 ml Neuron Growth Media mit oder ohne IFN zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren unter normalen Wachstumsbedingungen (37 °C, 5% CO₂) für 6-72 h, abhängig von experimentellen Bedingungen und Signaloptimierung.
3. Nach der Behandlungszeit, entfernen Sie alle Kulturmedien und waschen Sie vorsichtig einmal in kalten neurobasalen Medien ohne Ergänzungen (B27, L-Glutamin, Pen-Strep).
4. Fügen Sie 0,5 ml nicht-supplementiertes kaltes neurobasales Medium hinzu, das 1 g/ml Fc-Block und 1 g/ml fluoreszierenden konjugierten Anti-MHCI-Antikörper enthält. Bei 4 °C 45 min vor Licht schützen.
5. Entlegen Sie die antikörperhaltigen Medien und waschen Sie sie vorsichtig einmal in kaltem dPBS. Fügen Sie jedem Brunnen 0,5 ml enzymfreie Zelldissoziationspuffer mit Raumtemperatur hinzu und agitieren Sie, um Zellen zu vertreiben. Achten Sie auf die Dissoziation mit dem invertierten Gewebekulturmikroskop.
6. Sobald zellen von der Kulturschale gelöst sind, fügen Sie 0,5 ml FACS-Puffer zu jedem Brunnen hinzu, trituieren Zellen, um Klumpen zu dispergieren, und übertragen Sie das Gesamtvolumen jedes Brunnens auf einzelne 1,7 ml Mikrozentrifugenrohre.
7. Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand, setzen Sie das Zellpellet in 100 l FACS-Puffer wieder auf und übertragen Sie das Gesamtvolumen jedes Rohres auf einzelne Brunnen einer 96-Well-U-Bodenplatte.
8. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l fixatives Reagenz hinzu. Trituieren Sie mehrmals, um zu vermeiden, dass Zellen verklumpen und 15 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubieren.
9. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 200 l FACS-Puffer wieder auf.
10. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das permeabilisierungsreagenz in 100 l an jedem Brunnen in 100 l an. Gut mischen, dann bei Raumtemperatur vor Licht geschützt mit Schaukeln für 20 min inkubieren.
11. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 100 L FACS-Puffer wieder auf. 2x wiederholen.
12. Nach der Endwäsche die Zellen in 100 l mit 2% Paraformaldehyd, verdünnt im FACS-Puffer, wieder aussetzen. Mischen Sie gut, um zu verhindern, dass Zellen verklumpen. Bei 4 °C vor Licht geschützt bis zur Ablesung auf einem Durchflusszytometer lagern. Lesen Sie die Proben so schnell wie möglich, innerhalb von 1 Woche.

5. Quantifizierung und Auswertung von Daten

1. Messen Sie die Kompensationskontrollen für jeden Fluoreszenzfarbstoff und korrigieren Sie alle Spektralüberlappungen. Ideale Kompensationskontrollen umfassen kultivierte Neuronen, die nicht gefärbt, nur mit Anti-MHCI gefärbt und nur mit Anti-NeuN gefärbt sind.
2. Zeichnen Sie nach Möglichkeit 100.000 Ereignisse für jedes Beispiel auf (mindestens 10.000) und speichern Sie sie als FCS-Dateien.
3. Um Daten mithilfe geeigneter Analysesoftware zu analysieren, richten Sie sequenzielle Gates ein, wie in Abbildung 1A-C dargestellt, um sie für NeuN-positive Neuronen auszuwählen.
   1. Plot SSC-A (log) vs FSC-A (linear). Zeichnen Sie ein Tor auf die Zellpopulation (P1), um zelluläre Ablagerungen aus der Analyse zu entfernen.
   2. Innerhalb der Zellpopulation P1, Diagramm FSC-H (linear) vs FSC-A (linear). Zeichnen Sie ein Tor auf der Einzelzellenpopulation.
   3. Innerhalb der Einzelzellpopulation, Plot SSC-A (log) vs NeuN (log). Zeichnen Sie ein Tor auf NeuN-positive Population mit ungefärbten oder MHCI-nur gefärbten Zellen als Leitfaden.
   4. Zeichnen Sie ein Histogramm der MHCI-Fluoreszenz mit zellulären Ereignissen, die auf der y-Achse normalisiert wurden. Zeichnen Sie ein horizontales Tor, um die prozentualen Neuronen positiv für MHCI zu quantifizieren.
   5. Exportieren Sie die Prozentzellen positiv für MHCI sowie die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) für MHCI auf die NeuN-positive Population zur statistischen Auswertung und grafischen Zeichnung.

Results

Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurde Hippocampusgewebe am embryonalen Tag 18 von pränatalen Mauswelpen seziert. Das Gewebe wurde mit enzymatischen und mechanischen Methoden in eine einzellige Suspension zerlegt und dann in 12 Brunnenplatten kultiviert, die mit Poly-D-Lysin vorbehandelt wurden. Nach 7 Tagen in vitro wurden die Zellen mit 100 U/ml IFN oder Medien nur für 72 h behandelt, was die Expression von MHCI stimulierte. Neuronen wurden in situ für MHCI gefärbt, bevor sie nicht-enzymatisch in eine einzellige Suspension dissoziiert wurden. Neuronen wurden fixiert und permeabilisiert, dann intrazellulär für neuronale Kerne Marker NeuN gefärbt. Die Proben wurden mittels Durchflusszytometrie bewertet und die Daten wurden mit zugehöriger Software analysiert. Neuronen wurden durch sequenzielle Gating der Gesamtereignisse identifiziert, um zelluläre Ablagerungen und Doublets auszuschließen (Abbildung 1A,B). Neuronen wurden definitiv durch NeuN-Positivität identifiziert (Abbildung 1C). NeuN⁺ Zellen wurden weiter auf MHCI-Positivität analysiert, indem Zellen auf einem Histogramm mit der Anzahl der Zellen, die in den Modus auf der y-Achse normalisiert wurden, und MHCI-Fluoreszenz auf der x-Achse dargestellt wurden. Ein MHCI⁺ Gate wurde an dem Punkt gezeichnet, an dem positive und negative Spitzen auseinandergingen (Abbildung 1D). Daraus werden die prozentualen Neuronen positiv für die MHCI-Färbung (Abbildung 1E) und die mediane Fluoreszenzintensität (MFI; Abbildung 1F) berechnet wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die IFN-Behandlung den Anteil der Neuronen positiv für die extrazelluläre Färbung von MHCI sowie den Grad der Expression, wie durch MFI angegeben, signifikant erhöht hat. Statistische Auswertungen und grafische Darstellungen wurden mit kommerziell verfügbarer statistischer Software durchgeführt.

Abbildung 1: Repräsentative Gating-Strategie und MHCI-Quantifizierung.
Primäre Hippocampus-Neuronen wurden nur mit 100 U/ml IFN oder Medien behandelt. Nach 72 h wurden Neuronen extrazellulär mit pacific Blue-conjuged MHCI (1 g/mL H2-K^b)gefärbt, dann intrazellulär mit PE-konjugiertem NeuN (1:100 Verdünnung) gekennzeichnet. Die zelluläre Fluoreszenz wurde durch Durchflusszytometrie und Daten analysiert. (A) Gesamtereignisse wurden als SSC-A (log) vs FSC-A (linear) und Zellen (P1) geziert, um Trümmer auszuschließen. (B) Innerhalb der P1-Population wurden Zellen als FSC-H (linear) vs FSC-A (linear) dargestellt, um die Einzelzellpopulation zu bevölkern. (C) Innerhalb der Einzelzellpopulation wurden Zellen SSC-A (log) vs NeuN-PE (log) geplottet. NeuN⁺ Zellen wurden abgezäut, um Neuronen zu identifizieren. (D) Innerhalb der Neuronenpopulation wurden Zellen auf einem Histogramm mit MHCI-PacBlu auf der x-Achse und Zellzahlen dargestellt, die auf der y-Achse normalisiert wurden. Ein horizontales Tor wurde gezogen, um den Prozentsatz der Neuronen positiv für MHCI Färbung zu quantifizieren. (E) Quantifizierung von Prozent MHCI⁺ von NeuN⁺ Zellen nur in Medien und IFN-behandelten Neuronen. (F) Quantifizierung der medianen Fluoreszenzintensität (MFI) von MHCI auf NeuN⁺ Zellen in Medien (schwarz) und IFN-behandelten (roten) Neuronen. Die statistische Signifikanz wurde durch einen ungepaarten t-Test berechnet. **, P < 0.01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Neuron Growth Media (50 ml)
Reagenz	Endgültige Konzentration	Lagerkonzentration	Für 50 ml
B27 Ergänzung	2%	100%	1,0 ml
L-Glutamin	2 mM	200 mM	0,5 ml
Penicillin-Streptomycin	100 U/ml	10.000 U/ml	0,5 ml
Neurobasale Medien			48,0 ml
FACS Puffer (500 ml)
Reagenz	Endgültige Konzentration	Lagerkonzentration	Für 500 ml
Fetales Rinderserum	2%	100%	10 ml
Edta	1 mM	500 mM	1 ml
dPBS			489 ml
Papain Dissoziationslösung
Reagenz	Endgültige Konzentration	Lagerkonzentration	Für 1 ml
Papain Suspension	20 U/ml	1000 U/ml	0,020 ml
DNase I	2,5 U/ml	2500 U/ml	0,001 ml
Überwinterung-E			1,0 ml
Hinweis: Das benötigte Volumen der Papain Dissociation Solution hängt von der Anzahl der embryonalen Gehirne ab, die seziert werden. Bereiten Sie 0,5 ml pro Gehirn für Hippocampus-Neuronen oder 1,0 ml pro Gehirn für kortikale Neuronen vor.
Hinweis: Bereiten Sie die Dissoziationslösung vor, indem Sie die Papainsuspension im Hibernate-E ca. 3 min auswirbeln. Nachdem Papain gründlich aufgelöst ist, fügen Sie DNase I hinzu. Wirbel DNase I nicht.

Tabelle 1: Medien und Lösungen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Zerlegung und Kultur der primären Hippocampus-Neuronen von pränatalen Mauswelpen am embryonalen Tag 18. Die Verwendung von primären Neuronen, die von Nagetieren kultiviert werden, ist eine der grundlegendsten Methoden, die in der modernen Neurobiologie entwickelt wurden²². Obwohl verewigte Zelllinien bestimmte Aspekte von Neuronen modellieren können, lässt ihre Natur als tumorabgeleitete Zellen, das Versagen, definierte Axone zu entwickeln, und die fortgesetzte Zellteilung Zweifel aufkommen, ob sie die Eigenschaften post-mitotischer Neuronen in vivo²³originalgetreu rekapitulieren. Eine weitere Alternative zu primären Neuronen ist die Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs). Die Technologie für den Einsatz von HiPSCs, insbesondere solche, die von Patienten abgeleitet sind, hat sich in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt²⁴. Allerdings gibt es immer noch Einschränkungen bei der Arbeit mit HiPSCs, einschließlich Variabilität zwischen Zelllinien, mangelnde funktionelle Reife und Unterschiede in epigenetischen Profilen²⁵. Obwohl es auch Einschränkungen bei der Arbeit mit dem reduktionistischen Modell der primären Nagetier-Neuronen gibt, behalten kultivierte Neuronen die post-mitotische Natur von Neuronen in vivo. Außerdem bevorzugen die umfangreichen molekularbiologischen Werkzeuge und genetischen Modifikationen, die für Mäuse verfügbar sind, die Verwendung von primären Neuronen gegenüber HiPSCs für viele Anwendungen, und Mausstudien können leicht in den komplexeren In-vivo-Organismus übersetzt werden, ohne das experimentelle genetische System zu verlieren. Aus diesen Gründen, viele Forscher verwenden primäre Nagetier Neuronen, um Schlüsselaspekte zu überprüfen, wenn nicht die Masse, ihrer Forschung.

Für bestimmte Assays können Neuronen direkt nach der Isolierung aus dem Gehirn ex vivo analysiertwerden. Dies ist besonders wünschenswert für Experimente mit erwachsenen Mäusen, die bestimmten Versuchsbedingungen ausgesetzt sein können oder die von Wechselwirkungen mehrerer Zelltypen abhängen können; Es gibt jedoch mehrere Probleme, die die Art der Analysen einschränken, die durchgeführt werden können. Es ist technisch schwierig, eine einzelzellige Suspension von Neuronen aus dem Gehirn von erwachsenen Mäusen vorzubereiten, weil Neuronen einzigartig miteinander verbunden sind und durch Myelin²⁶verzahnt sind. Nicht-enzymatische Methoden der Gewebetrituration sind ineffizient bei der Dissoziierung des Gewebes und verursachen zelltodig, während enzymatische Präparate oft Zelloberflächenantigene^{spalten 27}. Darüber hinaus, während Myelin ist weitgehend fehlt bei embryonalen Mäusen, Es umfasst etwa 20% des erwachsenen Gehirns, und kann lebensfähige Zellisolation beeinträchtigen und behindern Flusszytometrie-Analyse²⁸. Viele der Techniken, die entwickelt wurden, entfernen schließlich Neuronen ihres Zytosols und hinterlassen kleine, abgerundete Zellkörper, die hauptsächlich aus Kernen^{bestehen 29}. Obwohl dies für einige Analysen akzeptabel ist, ist dies nicht geeignet, um die zytoplasmatische oder extrazelluläre Proteinexpression zu quantifizieren. Darüber hinaus ermöglicht das reduktionistische Zellkultursystem das Testen spezifischer mechanistischer Fragen auf einer kürzeren Zeitskala, als dies häufig mit einem In-vivo-System möglich ist.

Ebenfalls in diesem Protokoll beschrieben sind Methoden zur pharmakologischen Stimulierung der MHCI-Expression mit IFN- und die Quantifizierung der extrazellulären MHCI-Expression durch Durchflusszytometrie. Die Stimulation durch IFN ist eine nützliche positive Kontrolle zum Testen anderer experimenteller Bedingungen, aber es kann angemerkt werden, dass IFN und Kainsäure auch die MHCI-Expression in den Neuronen^9,30stimulieren können, während Tetrodotoxin die MHCI-Expression¹⁴verringert. Frühere Methoden zum Nachweis der MHCI-Expression stützten sich auf In-situ-Hybridisierung und immunhistochemische Analyse^14,15,20,31. Während mRNA-basierte Assays, wie In-situ-Hybridisierung und qRT-PCR, die raumzeitliche Lokalisation, die Zelltypspezifität und den Grad der Gentranskription bestimmen können, können diese Assays die Proteintranslation oder den Transport zur Plasmamembran nicht bewerten. Immunhistochemische und westliche Blot-Analysen können Unterschiede in der Proteinexpression und potenziell zellulären Lokalisation bestimmen, können aber schwierig zu quantifizieren sein. Darüber hinaus erkennen viele MHCI-Antikörper die tertiäre Struktur des Komplexes und sind hochempfindlich gegenüber konformen Veränderungen. Dadurch führen Permeabilisierungs- oder Denaturierungsbedingungen zum Verlust der MHCI-Immunreaktivität³². Die hier vorgestellte Methode verwendet In-situ-Immunostainierung für MHCI, die die Erkennung des Proteins durch den Antikörper in seiner nativen Konformation ermöglicht, gefolgt von Fixierungs- und Permeabilisierungsmethoden.

Mit leichten Modifikationen können die hier beschriebenen Methoden verwendet werden, um andere neuronale Populationen zu kultitogen oder die Expression anderer extrazellulärer Proteine von Interesse zu bewerten. In diesem Protokoll sind einfache Modifikationen, die vorgenommen werden können, um kortikale Neuronen zu kulturieren, aber die hier beschriebenen Methoden können auch verwendet werden, um andere neuronale Populationen zu kulturieren, wie striatale Neuronen³³. Obwohl dieses Protokoll die Immunfärbung von MHCI und NeuN festlegt, können andere zelluläre Marker in ähnlicher Weise identifiziert werden. Im Allgemeinen können extrazelluläre Marker wie MHCI und intrazelluläre Marker wie NeuN behandelt werden. Es sollte jedoch beachtet werden, dass während des zellulären Dissoziationsschritts axonale Projektionen vom Soma abgetrennt werden. Da die hier definierte Gating-Strategie zelluläre Trümmer abschirmt und sich auf den neuronalen Kernmarker NeuN konzentriert, können Proteine, die ausschließlich in axonalen Projektionen exprimiert werden, nicht nachgewiesen werden.

Bis vor kurzem, Neuronen wurden gedacht, um MHCI nur als Reaktion auf Schäden auszudrücken, Infektion, oder In-vitro-Zytokin-Stimulation, um zytotoxische CD8⁺ T-Zellen⁹zu engagieren. Neue Forschung hat eine weitere Funktion von MHCI bei der Regulierung synaptischer Verbindungen während der Entwicklung¹³aufgeklärt. Das hier beschriebene Protokoll verwendet IFN, um die MHCI-Expression in Wildtyp-kultivierten Neuronen zu stimulieren, aber ähnliche Methoden können mit einer Vielzahl von zellulären Reizen oder genetischen Modifikationen verwendet werden, um spezifische Hypothesen zu testen. Diese Methode wird es den Forschern ermöglichen, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die MHCI-Expression regulieren, was das Verständnis der dichotomen Rolle von MHCI auf diesen beiden unterschiedlichen zellulären Funktionen verbessern wird.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher	05-408-129	Laborbedarf
100 mm sterile Kulturschale	Fisher	FB012924	Gewebekulturbedarf
15 ml Zentrifugenröhrchen	Genesee	21-103	Laborbedarf
50 ml Zentrifugenröhrchen	Genesee	21-108	Laborbedarf
500 mM EDTA	Invitrogen	AM9260G	FACS-Pufferreagenz
70 % Ethanol	Fisher	BP82031Gal	Gewebekulturzubehör
96-Well-U-Bodenplatte	Genesee	25-221	Durchflusszytometrie Zubehör
B27	Gibco	17504044	Neuronenkultur-Reagenz
Boratpuffer	Thermo Scientific	28341	Gewebekulturzubehör
Borosilikatglas Pasteur Pipette	Fisher	13 678 20C	Laborbedarf
Zelldissoziationspuffer	Gibco	13 151 014	Durchflusszytometrie Zubehör
DNase I	Thermo	90083	Dissoziationslösung Reagenz
dPBS	Gibco	14190-235	Gewebekulturzubehör
Dumont #5 Pinzette	Fine Science Tools	91150-20	Sezierwerkzeug
Dumont # 7 Pinzette	Fine Science Tools	91197-00	Sezierwerkzeug
Fötales Rinderserum	Gibco	26140079	Gewebekulturzubehör
Feine Pinzette	Fine Science Tools	91113-10	Dissektionswerkzeug
Feine Schere	Fine Science Tools	91460-11	Dissektionswerkzeug
Fix und Perm Cell Permeabilization Kit	Invitrogen	GAS003	Verbrauchsmaterialien für die Durchflusszytometrie
Glutamax	Gibco	35050061	Neuronenkulturreagenz
Hibernate-E Medium	Gibco	A1247601	Neuronenkulturreagenz
Sofortversiegelnde Sterilisationsbeutel Fisher		181254	Gewebekulturzubehör
Interferon Beta	PBL Assay Science	12405-1	Durchflusszytometrie
Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antikörper, Klon A60	MilliporeSigma	FCMAB317PE	Durchflusszytometrie Antikörper
Neurobasal Medien	Gibco	21103049	Neuron Culture Reagenz
Pacific Blue Anti-Maus H-2Kb Antikörper	BioLegend	116513	Durchflusszytometrie Antikörper
Papain Lösung	Worthington	LS003126	Dissoziationslösung Reagenz
Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie Sciences	15714	Fixiermittel
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Neuronenkulturreagenz
Poly-D-Lysin	Sigma	P7280	Neuronenkulturreagenz
Standardmusterzange	Fine Science Tools	91100-12	Dissektionswerkzeug
Stereodissektionsmikroskop	Swift	M29TZ-SM99CL-BTW1	Präparierwerkzeug
Chirurgische Schere	Feine Wissenschaft Werkzeuge	91401-10	Präparierwerkzeug
Transfer Pipets	Corning	357575	Laborbedarf
TruStain FcX (Anti-Maus CD16/32) Antikörper	BioLegend	101319	Durchflusszytometrie Antikörper
Trypan Blue	Sigma	T8154-100ML	Gewebekulturzubehör