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Methodenartikel

Injektion von Hydrogel-Biomaterialgerüsten in das Gehirn nach einem Schlaganfall

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DOI:

10.3791/61450

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1. Oktober 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Neurology, University of California Los Angeles, 3Department of Neurology, Duke University, 4Department of Dermatology, Duke University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Schlaganfall ist ein globales Problem mit minimalen Behandlungsmöglichkeiten und keiner aktuellen klinischen Therapie zur Regeneration des verlorenen Hirngewebes. Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung eines präzisen photothrombotischen Schlaganfalls im motorischen Kortex von Nagetieren und der anschließenden Injektion von Hydrogel-Biomaterialien, um ihre Auswirkungen auf die Geweberegeneration nach einem Schlaganfall zu untersuchen.

Zusammenfassung

Schlaganfall ist die Hauptursache für Behinderung und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Etwa 87% aller Schlaganfälle sind ischämische Schlaganfälle und werden als plötzliche Blockade eines Gefäßes definiert, das das Gehirn mit Blut versorgt. Innerhalb weniger Minuten nach der Blockade beginnen die Zellen zu sterben und führen zu irreparablen Gewebeschäden. Aktuelle therapeutische Behandlungen konzentrieren sich auf die Entfernung oder Lyse von Gerinnseln, um die Reperfusion zu ermöglichen und schwerere Hirnschäden zu verhindern. Obwohl die vorübergehende Plastizität des Gehirns im Laufe der Zeit einen Teil des beschädigten Gewebes retten kann, bleiben signifikante Teile der Patienten mit neurologischen Defiziten zurück, die sich nie auflösen werden. Es fehlt an therapeutischen Optionen zur Behandlung neurologischer Defizite, die durch Einen Schlaganfall verursacht werden, was die Notwendigkeit unterstreicht, neue Strategien zur Behandlung dieser wachsenden Patientenpopulation zu entwickeln. Injizierbare Biomaterialien werden derzeit entwickelt, um die Plastizität des Gehirns zu verbessern und die endogene Reparatur durch die Abgabe von Wirkstoffen oder Stammzellen zu verbessern. Eine Methode, um diese Ansätze zu testen, besteht darin, ein Nagetierschlagmodell zu verwenden, das Biomaterial in den Schlaganfallkern zu injizieren und die Reparatur zu bewerten. Die genaue Lage des Schlaganfallkerns zu kennen, ist für die genaue Behandlung nach dem Schlaganfall unerlässlich, daher ist ein Schlaganfallmodell, das zu einem vorhersagbaren Schlaganfallort führt, vorzuziehen, um die Notwendigkeit einer Bildgebung vor der Injektion zu vermeiden. Das folgende Protokoll behandelt, wie man einen photothrombotischen Schlaganfall induziert, wie man ein Hydrogel kontrolliert und präzise injiziert und wie man das Gehirn extrahiert und kryosektioniert, während das Biomaterial intakt bleibt. Darüber hinaus werden wir aufzeigen, wie dieselben Hydrogelmaterialien für die Co-Delivery von Stammzellen verwendet werden können. Dieses Protokoll kann auf die Verwendung anderer injizierbarer Biomaterialien in den Schlaganfallkern verallgemeinert werden.

Einleitung

Schlaganfall ist die Hauptursache für Behinderung und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten1. Ungefähr 87% aller Schlaganfälle sind ischämisch, während eine Mehrheit der restlichen 13% hämorrhagischist 2. Ein ischämischer Schlaganfall ist definiert als die Blockade des Blutflusses in einer Arterie zum umgebenden Gewebe. Dieser Verschluss führt zu Sauerstoffmangel und anschließender Nekrose, die bei überlebenden Patienten oft zu dauerhaften Behinderungen führt. Während die Sterblichkeitsrate von Schlaganfall3zurückgegangen ist, wird erwartet, dass seine Prävalenz bis 2030 auf 3,4 Millionen Menschen ansteigen wird4. Diese Zunahme behinderter Überlebender und die daraus resultierende wirtschaftliche Belastung haben zu einem Vorstoß für die Schlaganfallforschung geführt, die sich auf Mechanismen der neuronalen Reparatur konzentriert. Nach dem Schlaganfall kommt es zu einer entzündlichen Periode, die zur Bildung einer Narbe führt, die verhindert, dass sich die nekrotische Region ausdehnt. Die Region, die den nekrotischen Kern umgibt, wird als "Periinfarkt" bezeichnet, und es gibt starke Hinweise darauf, dass die Plastizität in dieser Region, die eine erhöhte Angiogenese, Neurogenese und axonale Keimung umfasst, direkt mit der beobachteten Erholung bei Tiermodellen und Menschen zusammenhängt5. Da es keine In-vitro-Modelle gibt, die die komplexen Wechselwirkungen nach einem Schlaganfall richtig replizieren können, sind Tiermodelle für die Schlaganfallforschung unerlässlich.

Es gibt mehrere In-vivo-Modelle, die verwendet werden können, um einen ischämischen Schlaganfall zu erzeugen. Eines der häufigsten Modelle, die bei Mäusen verwendet werden, ist der Verschluss der mittleren Hirnarterie oder MCAo durch distalen oder proximalen (über intraarteriale Filamente) Verschluss. Das proximale Modell, auch bekannt als Filament MCAo (fMCAo), führt typischerweise zu großen ischämischen Schlaganfällen, die zwischen 5% und 50% der gehirnförmigen Hemisphäre umfassen, abhängig von der Anzahl der Faktoren6. In diesen Modellen wird eine Naht oder ein Filament von der Arteria carotis interna in die Basis der mittleren Hirnarterie (MCA) vorgeschoben und für einen bestimmten Zeitraum an Ort und Stelle gehalten. Diese Methode zur Okklusion, die vorübergehend oder dauerhaft gemacht werden kann, erzeugt einen Infarkt, der im Striatum zentriert ist und einen darüber liegenden Kortex beinhalten kann oder auch nicht6. Die resultierende Schlaggröße ist sehr variabel, und bildgebende Verfahren wie Laserdoppler sind erforderlich, um die Wirksamkeit des Verfahrens in jeder Maus zu bestätigen. Intraarterieller oder intralumnaler Filamentverschluss, der länger als 30 Minuten dauert, erzeugt Schläge am größeren Ende des Größenbereichs. Einige Forscher haben sich auf kürzere Filamentverschlusszeiten konzentriert, die einen erheblichen experimentellen Fokus und eine Laborvalidierung erfordern7. Filament-MCAo-Modelle bei Mäusen folgen ähnlichen Stadien des Zelltods, der ischämischen Progression und der Bildung einer Periinfarktregion, wie sie bei menschlichen Schlaganfallfällen beobachtet werden; Die größeren Schlaganfälle ähneln jedoch eher dem Krankheitszustand von bösartigen Hirninfarkten, die seltenere, weniger behandelbare menschliche Schlaganfälle sind6. In der Zwischenzeit erfordert der distale MCA-Verschluss eine aufwendigere Operation und Kraniektomie. In diesem Modell wird der distale Teil des MCA, der entlang der Oberfläche des Gehirns verläuft, direkt mit einer Nahtbindung oder Kauterisation verschlossen. In einigen Variationen der Technik sind die Halsschlagadern einseitig oder vorübergehend-bilateral verschlossen. Ein Vorteil des distalen MCAo besteht darin, dass er einen kortikalen Schlag erzeugt, dessen Größe weniger variabel ist als das Filamentmodell. Das distale Modell erzeugt jedoch aufgrund der Transektion der äußeren Halsschlagader (ECA) eine schlechtere Verhaltensleistung, was auch bei fMCAo 6 ein Problemdarstellt.

Ein alternatives Schlaganfallmodell, das dafür bekannt ist, weniger invasiv zu sein, ist das photothrombotische (PT) Modell. Das PT-Modell führt zu einem klar definierten Ort der Ischämie und ist mit einer hohen Überlebensrate assoziiert8. Die Technik beruht auf einem lichtempfindlichen Farbstoff, der intraperitoneal injiziert wird und die intravaskuläre Photooxidation einfach durch Bestrahlung des gewünschten Gewebes mit einem Licht oder Laserermöglicht 9. Bei Anregung bilden sich Sauerstoffradikale, die Endothelschäden verursachen, die die Thrombozytenaggregation und Gerinnselbildung im bestrahlten Bereich aktivieren8,9. Die strenge Kontrolle über Hubgröße und -position sowie die hohe Reproduzierbarkeit des PT-Modells machen es ideal für die Untersuchung von Biomaterialien. Während Präzision durch einen Laser und stereotaktische Koordinaten ermöglicht wird, gibt es einige Nachteile, die dieses Modell für wenige Studien weniger ideal machen können. Im Gegensatz zum fMCAo-Modell kann das PT-Hubmodell nicht reperfundiert werden. Daher wären Materialien zur Untersuchung neuroprotektiver Wirkstoffe, die spezifisch für Schäden nach Reperfusion oder die Mechanismen nach reperfusion sind, hier nicht sinnvoll8. Darüber hinaus wird aufgrund der mikrovaskulären Beleidigung des PT-Modells eine relativ kleine ischämische Penumbra gesehen. Stattdessen tritt ein lokales vasogenes Ödem auf, das für den menschlichen Schlaganfall untypisch ist, was dieses Modell für präklinische Arzneimittelstudien, die sich auf den Periinfarktbereichkonzentrieren,unerwünscht macht6,8.

Das übergeordnete Ziel von Biomaterialstrategien bei Schlaganfällen ist es, entweder bioaktive Wirkstoffe zu liefern oder als surrogatartige extrazelluläre Matrix für das Wachstum von Hirngewebe zu fungieren. Eine Strategie, die wir mit unseren Methoden untersuchen werden, besteht darin, Hydrogel direkt in den Schlaganfallkern zu liefern, im Gegensatz zum periinfarkten Gewebe, in dem viele aktuelle Zelltherapien verabreicht werden10. Die Begründung für diesen Ansatz ist, dass die Abgabe in das nekrotische Gewebe im Kern die Störung des umgebenden gesunden oder sich erholenden Gewebes vermeidet. Wir gehen davon aus, dass die Diffusion aller im Biomaterial enthaltenen Wirkstoffe in der Lage sein wird, den Periinfarkt vom Kern aus zu erreichen, zumal wir feststellen, dass die Abgabe von Hydrogel-Biomaterialien die Dicke der Glianarbe reduziert11. Dies ist wichtig, da gezeigt wurde, dass die Periinfarktregion nach einem Schlaganfall Neuroplastizität aufweist, was sie zu einem attraktiven Ziel macht. Darüber hinaus kann die Abgabe einer Surrogatmatrix an den Schlaganfallkern mit angiogenen12 oder neurogenen13 Faktoren beladen werden, um die Bildung von neuem Gewebe zu steuern, sowie Zellen für die Abgabe14. Die Zellabgabe wird durch die Verwendung einer Matrix erheblich verbessert, da sie die Zellen vor den harten Injektionskräften und der lokalen Umgebung schützt, die während der Entbindung vorhanden sind, sowie die Differenzierung und Transplantation fördert15.

Diese injizierbaren therapeutischen Biomaterialien haben klinische Relevanz bei Schlaganfallanwendungen, da es derzeit keine medizinischen Therapien gibt, die die neuronale Erholung nach einem Schlaganfall stimulieren. Die zugrunde liegenden neuronalen Schaltkreise, die an der Genesung beteiligt sind, liegen im Hirngewebe, das an den Schlaganfallkern16angrenzt, während der Schlaganfallkern selbst frei von lebensfähigem Nervengewebe ist. Wir gehen davon aus, dass die Abgabe eines Biomaterials in den nekrotischen Schlaganfallkern das Potenzial hat, das angrenzende Gewebe durch eine Reihe von zuvor erwähnten Mechanismen zu regenerativen Prozessen zu stimulieren, darunter die Depotfreisetzung von Wachstumsfaktoren13,die Stimulation des Gewebewachstums und die Förderung der Wiederherstellung der Entwicklung von Hirngewebe11,12, Veränderung der Immunantwort17und die Abgabe von aus Stammzellen abgeleitetenTherapeutika 14. 18. Um jedoch die Möglichkeit dieser Anwendungen effektiv zu untersuchen, ist eine konsistente und reproduzierbare Methode zur Induktion von Schlaganfällen und zur Injektion von Biomaterialien erforderlich. Das PT-Hubmodell verwendet Techniken, die eine präzise Kontrolle über die Ausrichtung und Position des Hubs bieten. Ein am stereotaktischen Gerät befestigter Laser führt die Ausrichtung, und an den stereotaktischen Geräten angebrachte Pumpen steuern die Injektionsrate des Materials, ohne dass zusätzliche Formen der Bildgebung erforderlich sind. Daher haben wir uns entschieden, die Methoden zur Durchführung eines PT-Schlaganfalls in den motorischen Kortexen von Mäusen und zur Injektion von Biomaterialien in den Schlaganfallkern zu beschreiben. Hier verwenden wir mikroporöse geglühte Partikel (MAP) Hydrogele als Biomaterial für die Injektion ohne Zusatz von Zellen oder Wachstumsfaktoren. Darüber hinaus erklären wir, wie man das Gehirn mit intaktem Biomaterial erfolgreich abrufen kann, und wir diskutieren immunchemische Assays, die zur Analyse des Schlaganfallergebnisses mit und ohne Injektion von Biomaterialien verwendet werden.

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Protokoll

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit IUCAC an der Duke University und der University of California Los Angeles durchgeführt. 8 bis 12 Wochen alte männliche C57Bl/6J-Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Die Tiere wurden unter kontrollierter Temperatur (22 ± 2 °C) mit einer 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklusperiode und Zugang zu pelletiertem Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Analgesie- und Sedierungsprotokolle werden als von der IUCAC genehmigt beschrieben, können sich jedoch von den in anderen Labors verwendeten Protokollen unterscheiden.

Tiere können vorzeitig eingeschläfert werden, wenn sie übermäßige Unruhe, Vokalisation (was auf unkontrollierbare Schmerzen hinweist), Selbsttrauma, verminderte oder beeinträchtigte Mobilität, körperliche Anzeichen einer Hautinfektion, Appetitlosigkeit und / oder Gewichtsverlust von mehr als 10% -15% als Ergebnis der Überlebensoperation erfahren. Es gibt keine erwarteten nachteiligen Auswirkungen durch die Injektion des Gels, da es aus einem natürlich vorkommenden Polymer im Gehirn besteht. Die Tiere sollten täglich, auch an Wochenenden und Feiertagen, überwacht und jeden zweiten Tag neu gewichtet werden. Studien aus unserem Labor und anderen haben bei Mäusen nach diesen kleinen kortikalen oder subkortikalen Schlaganfällen keine Defizite in der Körperpflege, beim Verlust des Körpergewichts oder an Anzeichen/Symptomen eines Entzugs oder chronischen Stresses gefunden. Wenn Tiere Anzeichen einer lokalen Kopfwundeninfektion aufweisen, sollten sie eingeschläfert werden. Tiere sollten auch auf schlechte Pflege, Wundzustand und Anzeichen von Kämpfen zwischen Tieren (Rückenwunden) überwacht werden. Wenn es Anzeichen von Kampf oder Wunddehiszenz gibt, sollten die Tiere zuerst nach Kontaktaufnahme mit den Tierärzten behandelt werden. Dies beinhaltet oft Antibiotika im Wasser und / oder lokale topische Antibiotika-Anwendung. Wenn diese Maßnahmen keine Heilung bewirken, sollten Tiere eingeschläfert werden.

1. Vorbereitung von Materialien und Instrumenten

  1. Bereiten Sie vor der Operation einen photothrombotischen Farbstoff vor. 15 mg Rose Bengal in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen einwiegen.
    VORSICHT: Rose Bengal kann schwere Augenschäden / Reizungen verursachen.
    1. Lösen Sie die Rose Bengal in 1,5 ml steriler, filtrierter 1x PBS auf, um eine Arbeitskonzentration von 10 mg / ml zu erhalten.
    2. Wirbeln Sie das Röhrchen, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind, was darauf hinweist, dass sich der Farbstoff vollständig aufgelöst hat, und bedecken Sie es dann bis zur weiteren Verwendung mit Folie.
      HINWEIS: Die Menge des erforderlichen Farbstoffs hängt von der Anzahl der Mäuse ab. Farbstoff wird intraperitoneal IP in einer Konzentration von 10 μL/g injiziert, z. B. 200 μL für eine 20 g Maus.
  2. Schalten Sie das Heizkissen ein, um die Körpertemperatur der Maus während der Narkose (37 °C) aufrechtzuerhalten.
  3. Bereiten Sie autoklavierte Scheren, Pinzetten, Baumwolle, Augensalben, chirurgischen Klebstoff oder Nahtmaterial, einen blauen oder schwarzen chirurgischen Marker sowie sterile Alkohol- und Beta-Jodtücher vor. Knochenbohrer mit sterilisierten Bohrerköpfen vorbereiten.
  4. Schalten Sie die Perlensterilisation auf 160 ° C ein, um die Sterilisation von Instrumenten zwischen mäusechirurgischen Eingriffen zu ermöglichen. Legen Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen mit steriler Kochsalzlösung oder 1x PBS-Lösung für die spätere Verwendung bei der Aufrechterhaltung eines hydratisierten Operationsbereichs beiseite.
  5. Befestigen Sie den Laser am stereotaktischen Gerät. Messen Sie mit einer Laserschutzbrille die Leistung des Lasers (mW).
    ACHTUNG: Verwenden Sie eine Laserschutzbrille, wenn der Laser während des Eingriffs eingeschaltet wird.
    1. Passen Sie den Strom auf der Laserkonsole gemäß den Anweisungen zur Laserherstellung an, bis die Laserleistung 10 mW anzeigt, und stellen Sie den Strom als voreingestellt auf der Startbildschirmkonsole ein. Passen Sie dann den Strom erneut an, um eine weitere Voreinstellung zu erstellen, bei der die Laserausgangsleistung 40 mW beträgt. Schalten Sie nun den Laser bis zur weiteren Verwendung aus.
      HINWEIS: Die 10 mW werden verwendet, um den Laser vor dem Gebrauch auszurichten.
  6. Bereiten Sie nach der Operation einen sauberen Käfig für Mäuse vor. Legen Sie dann die Maus mit einer Isoflurankonzentration von 4% in die Induktionskammer, um sie zu betäuben, bis die spontane Bewegung aufhört und ihre Atmung zu einer langsamen, gleichmäßigen Rate kommt.
  7. Sobald Sie eingeschlafen sind, wiegen Sie die Maus, um zu bestimmen, wie viel Rose Bengal Farbstoff injiziert werden soll. Übertragen und sichern Sie dann die Maus auf das stereotaktische Gerät mit einer Isoflurankonzentration von 1,5%.
    HINWEIS: Eine Erhöhung der Isoflurankonzentrationen kann die Gefäße erweitern und eine ausreichende Okklusion oder gleichmäßig große Schlaganfälle zwischen Mäusen verhindern.
  8. Tragen Sie veterinärztliche Augensalbe auf beide Augen auf.
    HINWEIS: Beobachten Sie die Atmung und Temperatur während des gesamten Eingriffs und drücken Sie gelegentlich die Zehen ein, um sicherzustellen, dass die Maus nichts fühlen kann.

2. Photothrombotischer Schlaganfall Modell9

  1. Rasieren Sie das Fell vom Kopf der Maus und bereiten Sie den Bereich aseptisch vor, indem Sie ein Alkoholtuch verwenden, gefolgt von einem Beta-Jod-Tuch. Dreimal wiederholen.
    HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf ein zusätzliches Alkoholtuch am Ende, um das gesamte Beta-Jod zu reinigen, da es Hautreizungen verursacht, die dazu führen, dass die Mäuse nach der Operation ihren Schädel jucken.
  2. Machen Sie mit einer kleinen Operationsschere einen seitlichen Schnitt zwischen den Ohren zu den Augen, etwa 1-2 cm. Tun Sie dies, indem Sie die Haut mit einer Pinzette nach oben ziehen, um ein Zelt zu schaffen, einmal nach unten schneiden, dann die Schere in die Öffnung einführen und einen durchgehenden Mittellinienschnitt erzeugen.
  3. Trennen Sie die Haut und drücken Sie leicht mit der Pinzette auf die Parietalknochen, um das Bregma zu lokalisieren. Markieren Sie das Bregma mit einem Punkt mit dem chirurgischen Marker.
    HINWEIS: Die Bewegung des Knochenfragments hebt den frontalen Rand der Parietalknochen hervor. Das Bregma ist der Mittelpunkt, an dem sich die frontalen und parietalen Knochenfragmente treffen (Abbildung 1A).
  4. Bewegen Sie den Laser mit einer Laserschutzbrille über den Schädel der Maus und fixieren Sie das stereotaktische Gerät in einem Winkel von 90 °. Wählen Sie die 10 mW voreingestellten und schalten Sie den Laser ein.
    1. Stellen Sie die x- und y-Achse des Lasers so lange ein, bis er sich direkt über dem Bregma befindet. Setzen Sie das x und y auf der digitalen Anzeigekonsole zurück und bewegen Sie dann den Laser 1,8 mm links vom Bregma. Bringen Sie nun den Laser so nah wie möglich an den Schädel heran, ohne dass er den Schädel berührt.
    2. Bewegen Sie den Laser auf 2,2 mm links vom Bregma, um sicherzustellen, dass er sich ohne Hindernisse bewegen kann. Schalten Sie den Laser aus.
  5. Injizieren Sie die entsprechende Menge Rose Bengal Farbstoff intraperitoneal (IP) mit einer Einwegnadel von 29 G. Starten Sie sofort einen Timer für 7 minuten, damit der Farbstoff systemisch zirkulieren kann. Wählen Sie die Voreinstellung für 40 mW, ohne den Laser einzuschalten.
    HINWEIS: Sobald Sie mit dem Verfahren vertraut sind, kann der Farbstoff vor der aseptischen Vorbereitung der Maus injiziert und vor Ablauf der 7 Minuten beendet werden, um Zeit zu sparen.
  6. Schalten Sie den Laser (40 mW) ein, wenn der 7-Minuten-Timer losgeht, während Sie eine Laserschutzbrille tragen, und stellen Sie einen 10-Minuten-Timer ein.
    1. Bewegen Sie den Laser nach 10 Minuten auf 2,2 mm links vom Bregma, ohne ihn auszuschalten, und stellen Sie einen weiteren 10-Minuten-Timer ein.
    2. Sobald der zweite 10-Minuten-Timer losgegangen ist, schalten Sie den Laser wieder auf 10 mW und bewegen Sie den Laser auf 2,0 mm links vom Bregma. Markieren Sie diese Stelle mit dem chirurgischen Marker. Schalten Sie dann den Laser aus.
    3. Heben Sie den Laser an und entriegeln Sie ihn aus dem 90°-Winkel, damit er von der Maus wegbewegt werden kann. Tragen Sie an dieser Stelle die sterile Kochsalzlösung oder PBS mit Baumwolle auf, wenn der Operationsbereich trocken ist.
  7. Bohren Sie in kleinen Ausbrüchen an der 2,0-mm-Markierung senkrecht zur Schädeloberfläche.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, langsam zu bohren, um zu vermeiden, zu tief zu bohren und das Gehirn zu treffen. Es wird einen leichten Abfall / eine Änderung des Widerstands geben, sobald der Bohrer durch den Schädel gegangen ist, und das Bohren kann Blutungen verursachen.
    1. Verwenden Sie Baumwolle, um überschüssiges Blut zu absorbieren. Es ist typisch, nach dem Bohren etwas Blut aus eingekerbten Arterien im Schädel zu sehen - übermäßiges Blut bedeutet, dass der Bohrer das Gehirn getroffen hat. Notieren Sie sich in diesem Fall die Mauskennung und fahren Sie fort.
  8. Legen Sie einen kleinen Wisch neben die Maus. Ziehen Sie die Haut mit der Pinzette eng zusammen, um sich auf das Kleben vorzubereiten.
    HINWEIS: Das Nähen kann stattdessen hier erfolgen. Das Nähen erfordert in der Regel nur 3 Nähte.
    1. Greifen Sie mit der Pinzette die beiden Seiten der Haut und ziehen Sie sie zusammen und nach oben. Tupfen Sie alle großen Tropfen chirurgischen Klebstoffs am Ende der Spitze auf dem Tuch ab, bevor Sie sie auf die Maus auftragen.
    2. Tragen Sie den OP-Kleber sparsam auf und halten Sie die Haut mit einer Pinzette 10 s lang zusammen. Fahren Sie fort, bis keine Öffnungen mehr sichtbar sind.
      HINWEIS: Der Kleber kommt schnell heraus – drücken Sie die Flasche nicht zusammen. Vermeiden Sie es, die Haut an den Schädel zu kleben oder Klebstoff in das Auge zu bekommen.
  9. Legen Sie die Maus nach dem Kleben oder Nähen in den neuen Käfig, um sich von der Anästhesie zu erholen. Es dauert 5-10 Minuten, bis sich das Tier erholt hat, und es hilft, die Hälfte des Käfigs auf einem Heizkissen zu ruhen.

3. Scheinhub-Operation

  1. Führen Sie alle Verfahren identisch mit der oben in Abschnitt 2 beschriebenen Operation durch, mit Ausnahme der Injektion von 1x PBS oder Kochsalzlösung anstelle von Rose Bengal Farbstoff.

4. Injektion von Hydrogel oder anderen Biomaterialien

  1. Führen Sie die Injektion von Biomaterialien zu einem benutzerdefinierten Zeitpunkt durch. In diesem Experiment wurden Injektionen zwischen 5 und 7 Tagen nach dem Schlaganfall durchgeführt. 2 - 6 μL Hydrogel werden injiziert (benutzerdefiniert).
    1. Schalten Sie das Heizkissen ein, um die Körpertemperatur der Maus während der Narkose (37 °C) aufrechtzuerhalten.
    2. Bereiten Sie autoklavierte Scheren, Pinzetten, Baumwolle, Augensalben, chirurgischen Klebstoff oder Nahtmaterial sowie sterile Alkohol- und Beta-Jodtücher vor. Bereiten Sie den Knochenbohrer mit sterilen Bohrerköpfen und die 25 μL Hamilton Glasspritzen mit Metall 30 G Nadeln vor.
    3. Schalten Sie die Perlensterilisation auf 160 °C ein, um die Sterilisation von Instrumenten zwischen Mäusen zu ermöglichen.
    4. Befestigen Sie die Einspritzpumpen am stereotaktischen Gerät. Stellen Sie die Durchflussrate auf 1 μL/min und das Volumen auf 4 μL ein.
    5. Bereiten Sie nach der Operation einen sauberen Käfig für die Mäuse vor.
  2. Legen Sie die Maus mit einer Isoflurankonzentration von 4% in die Induktionskammer, um sie zu betäuben, bis die spontane Bewegung aufhört und ihre Atmung zu einer langsamen, stetigen Rate kommt.
    1. Übertragen und befestigen Sie die Maus im Schlaf mit einer Isoflurankonzentration von 1,5% auf das stereotaktische Gerät.
    2. Tragen Sie die Augensalbe des Tierarztes auf beide Augen auf.
    3. Rasieren Sie alle Felle, die möglicherweise vom Kopf der Maus nachgewachsen sind, und bereiten Sie den Bereich aseptisch vor, indem Sie ein Alkoholtuch verwenden, gefolgt von einem Beta-Jod-Tuch. Dreimal wiederholen.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf ein zusätzliches Alkoholtuch am Ende, um das gesamte Beta-Jod zu reinigen, da es Hautreizungen verursacht und die Mäuse nach der Operation zum Jucken des Schädels bringt.
  3. Öffnen Sie mit der kleinen Schere und / oder Pinzette die Haut über dem Gehirn wieder. Verwenden Sie Baumwolle mit steriler Kochsalzlösung oder PBS, um Ablagerungen vom Schädel zu entfernen. Ein weiß-gelber Kreis (der Strich, Abbildung 1B) und das Gratloch aus dem Bohrer sind sichtbar. Wenn das abgestorbene Gewebe nicht sichtbar ist, ist wahrscheinlich kein Schlaganfall aufgetreten. Wenn das Gratloch nicht über dem Hub zentriert ist, bohren Sie es erneut, um es zu zentrieren.
  4. Die Einspritzpumpe über der Maus ausrichten und bei 90° verriegeln. Reinigen Sie die Spritze mit steriler Kochsalzlösung oder PBS-Lösung, bevor Sie das Material zurückladen.
    1. Nach der Reinigung zerlegen Sie die Glasspritze, so dass keine Nadel vorhanden ist. Laden Sie die Spritze mit einer 25 μL-Verdrängerpipette mit den 10 μL Hydrogel (oder einem anderen Biomaterial hier mit oder ohne Zellen) zurück.
    2. Drücken Sie das Gel mit dem Spritzenkolben bis zur Vorderseite der Spritze. Setzen Sie dann die Spritze wieder zusammen und drücken Sie weiter, bis das Gel sichtbar aus der Nadel austritt.
  5. Legen Sie die Spritze auf die Pumpe. Die Rückseite der Pumpe muss möglicherweise so eingestellt werden, dass die Spritze passt. Stellen Sie dazu die Durchflussrate auf 30 μL/min ein, wählen Sie Entnahme oder Injektion je nach Bewegungsrichtung und drücken Sie dann Start. Drücken Sie Stop, wenn sich die Rückseite der Pumpe an der richtigen Stelle befindet.
    1. Schrauben Sie die Rückseite der Pumpe, damit die Spritze sicher ist. Wenn zuvor Anpassungen vorgenommen wurden, stellen Sie sicher, dass die Durchflussrate auf 1 μL/min zurückgesetzt und auf Injektion eingestellt ist.
  6. Bewegen Sie die Pumpe in x- und y-Richtung, um sie über das Loch zu richten. Bewegen Sie die Pumpe in z-Richtung nach unten, bis die Nadel der Spritze die Oberseite des Lochs berührt.
  7. Setzen Sie das z auf der Digitalanzeigekonsole zurück. Bewegen Sie dann die Spritze in z-Richtung 0,750 mm nach unten. Wenn sich die Spritze biegt oder Widerstand besteht, ist der Schädel entweder geheilt oder wurde nicht vollständig durchbohrt und muss erneut gebohrt werden.
  8. Drücken Sie Start auf der Pumpenkonsole, um 4 - 6 μL des Hydrogels mit einer Geschwindigkeit von 1 μL/min zu injizieren.
  9. Stellen Sie einen 5-Minuten-Timer ein, wenn die Pumpe die Injektion stoppt, damit das Gel mit der Vernetzung beginnen kann.
  10. Nach 5 Minuten ziehen Sie die Spritze langsam hoch, indem Sie das z nob drehen. Beobachten Sie, ob Material versehentlich aus dem Loch gezogen wird oder austritt. Entriegeln Sie die Pumpe und bewegen Sie sie von der Maus weg, wenn die Nadel weit genug vom Schädel entfernt ist.
  11. Schließen Sie mit einer Pinzette, chirurgischem Klebstoff oder Nähten die Haut über dem Kopf. Legen Sie die Maus in den sauberen Käfig und beobachten Sie ihre Genesung. Es sollte etwa 5 – 10 Minuten dauern, bis sich die Maus von der Narkose erholt hat.

5. Perfusion und Probenentnahme

  1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran.
  2. Fixieren Sie das Tier in Rückenlage und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem medianen Schnitt. Optional klemmen Sie die absteigende Bauchaorta ein, um weniger Fixiermittel und PBS zu verwenden.
  3. Schneiden Sie das Zwerchfell auf und bewegen Sie die Seiten des Brustkorbs nach oben, um die Brusthöhle zu öffnen. Führen Sie eine Perfusionskanüle in die linke Herzkammer ein und schneiden Sie eine Öffnung in den rechten Vorhof. Beginnen Sie langsam mit 10-20 ml PBS zu perfundieren oder bis die Flüssigkeit halbklar läuft.
  4. Sobald sie klar sind, wechseln Sie zu 4% PFA für weitere 10 - 20 ml. Das Lösen der Arme ermöglicht es ihnen, sich zusammenzuziehen, wenn die PFA eindringt. Sobald sie aufhören, sich zu bewegen, warten Sie auf weitere 30 s.
  5. Enthaupten Sie das Tier und ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen. Entfernen Sie mit einer stumpfen, dünnen Pinzette vorsichtig die Schädelstücke, um das Gehirn freizulegen. Besondere Vorsicht ist geboten, wenn der Schädel oberhalb der Schlaganfallstelle entfernt wird. Kleine chirurgische Scheren können hier verwendet werden, um den Schädel wegzuschneiden. Die größte Herausforderung besteht darin, dass Gel am Schädel klebt und aus dem Gehirn austritt, wenn der Schädel entfernt wird.
  6. Sobald das Gehirn abgelöst ist, legen Sie 10 – 15 ml 4% PFA über Nacht (nicht länger als 24 h) ein.
  7. Bewegen Sie das Gehirn am nächsten Tag von PFA auf 30% Saccharose. Das Gehirn ist bereit für die Kryosektion, sobald es auf den Boden sinkt (ca. 2 – 3 Tage). Es kann an dieser Stelle auch zur Lagerung belassen werden.

6. Kryosektion und Färbung

  1. Nehmen Sie das Gehirn aus Saccharose und legen Sie es auf ein Glasobjektträger. Schneiden Sie einen kleinen Teil der Rückseite des Gehirns mit einer Rasierklinge ab, um einen flachen Teil zu erzeugen, der auf einem Chuck montiert werden kann.
    1. Legen Sie einen Klecks Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) auf das Spannfutter und legen Sie dann das Gehirn mit der flachen Seite nach unten auf das Spannfutter im OCT. Legen Sie diese Probe auf Trockeneis, bis sie eingefroren ist, oder in den Kryostaten auf dem Gefrierblock.
      HINWEIS: OCT kann hinzugefügt werden, um das Gehirn vollständig zu umfassen, um zu verhindern, dass sich das Material während des Schneidens vom Gehirn trennt.
  2. Schneiden Sie die Gehirne seriell auf einem Kryostaten bei -20 °C bei 30 μm dicken Abschnitten über 10 mit Gelatine beschichtete Objektträger. Achten Sie beim Schneiden darauf, dass das Hydrogel nicht verloren geht. Wenn dieser Teil schwierig ist, legen Sie etwas OCT auf die Oberseite des Gehirns über das Gel (Abbildung 3). Bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
  3. Die Objektträger aus den -80 °C nehmen und auf eine Färbeschale legen, damit sie trocknen können. Dias, die nicht eingefroren, sondern nur geschnitten wurden, können ebenfalls sofort gebeizt werden.
  4. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kreis um die Gehirnschnitte auf dem Objektträger. Nach dem Trocknen rehydrieren Sie die Gehirnscheiben mit 1x gefiltertem PBS und legen Sie sie für 15 Minuten auf einen Shaker bei Raumtemperatur. Dies erfordert etwa 1 ml Puffer pro Objektträger mit 9 – 12 Hirnschnitten.
  5. Waschen Sie die Objektträger mit 1x gefiltertem PBS für 5 min bei Raumtemperatur, dreimal wiederholen.
  6. Blockrutschen für 30 min bis zu einer Stunde mit 10% Eselserum in 0,01% PBS-Triton X bei Raumtemperatur auf der Bauchtänzerin. Dies dauert etwa 200 μL pro Objektträger.
  7. Inkubieren Sie den primären Antikörper in 10% Eselserum mit 0,01% PBS-Triton X über Nacht bei 4°C auf einem Shaker. Testen Sie zuerst primäre Antikörper, um die richtigen Konzentrationen zu bestimmen. Hier wurden GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (Abbildung 4) verwendet.
  8. Rutschen mit 1x gefiltertem PBS am Folgetag für 5 min bei Raumtemperatur waschen, dreimal wiederholen.
  9. Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern in 10% Eselserum in 0,01% PBS-Triton X und DAPI für 2 h auf dem Laborschüttler bei Raumtemperatur. 1:1.000 wurde für alle Secondaries und DAPI verwendet.
  10. Waschen Sie die Objektträger für 5 min mit 1x gefiltertem PBS.
  11. Lassen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen. Dies kann 20 Minuten bis 4 Stunden dauern; Das Platzieren der Dias in einem Exsikkator kann den Prozess beschleunigen.
  12. Dehydrate gleitet in aufsteigenden Alkoholkonzentrationen (1 min pro Lösung) von 50%, 70%, 95%, 100% und 100%.
  13. Entfetten Sie im ersten Bad Xylol für 1 min, dann zweites Bad Xylol für 5 min.
  14. Nehmen Sie die Dias schnell nacheinander heraus und fügen Sie ein Montagemedium hinzu, während die Gehirnabschnitte mit Xylol benetzt sind. Fügen Sie schnell einen Glasdeckglas hinzu. Verwenden Sie einen Abdeckzettel, der die richtige Länge und Dicke aufweist, die für den Objektträger bzw. das Mikroskop benötigt werden.
  15. Befreien Sie sich von Blasen unter dem Deckglas, indem Sie vorsichtig mit einer Pipettenspitze in einer nach außen gerichteten Bewegung von der Mitte des Objektträgers aus drücken. Lassen Sie DPX 4 h bis über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen.
  16. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um getrocknetes Montagemedium abzukratzen, das auf die Objektträger gelangt ist. Wischen Sie Die Dias mit dem Objektivreiniger ab. Objektträger können nun mit Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden.
    HINWEIS: Es ist am besten, den Dia im Dunkeln oder bei 4 ° C zu lagern, bis die Bildgebung abgeschlossen ist.

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Ergebnisse

Ziel dieser Methode war es, zu demonstrieren, wie man nach einem Schlaganfall Biomaterialien in das Gehirn injizieren kann. Ein photothrombotisches Modell mit Rosenbengalen und einem 520-nm-Laser wurde zur kontrollierten Ausrichtung der Schlaganfallläsion in Größe und Ort verwendet. Fünf Tage nach dem Schlaganfall konnte der Infarkt während der Operation sichtbar gemacht werden (Abbildung 1B) und durch TTC und Bildgebung von IHC-gefärbten Objektträgern (Abbildung 2

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Diskussion

Hier zeigen wir ein leicht reproduzierbares, minimalinvasives, permanentes Schlaganfallmodell und beschreiben, wie fünf Tage nach dem Schlaganfall ein Biomaterial in den Infarkt injiziert werden kann. Die Verwendung des photothrombotischen Farbstoffs Rose Bengal und eines 520 nm kollimierten Lasers, der mit dem stereotaktischen Gerät verbunden ist, gibt uns die Möglichkeit, den Schlag mit erhöhter Präzision am motorischen Kortex der Maus zu positionieren. Fünf Tage nach dem Schlaganfall ist die Lage des Infarkts durch da...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass TS ein Gründer von Tempo Therapeutics ist, das MAP-Hydrogele kommerzialisieren will.

Danksagungen

Wir danken den National Institutes of Health und dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke für die Finanzierung (R01NS079691).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10% Normales ZiegenserumVWR100504-028Zum Blockieren von Puffern
2-lagiger Alkohol Pre Pad, Steril, MediumMedlineMDS090735
25uL Hamilton Spritze 702RN, ohne NadelFishcer Scientific14824663Spritzen zur Injektion von Biomaterialien
25uL DirektverdrängerpipetteGilsonM-25
2x Beam Expander, 400-650nmThorlabsGBE02-ALaserstrahlaufweiter
Verstellbare TischplattformKopf Instruments901
Anti-Glukosetransporter GLUT1 Antikörper, KaninchenAbcamab113435
Anti-Iba1 Antikörper, ZiegeAbcamab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blutentnahmesets. 25G, 12"Medsupply367294Für Perfusionen
BKF12- Mattschwarze AluminiumfolieThorlabsBKF12Zum Abdecken von allem, was bei der Verwendung von Lasern reflektierend ist.
Bone Iris Mini Schere - 3-1/2"Sklar chirurgische Instrumente64-2035
C57BL/6 MäuseJackson Laboratory0006648-12 Wochen Alter
Cage Assembly RobThorlabsER3-P43" lang, Durchmesser 6mm, 4er Pack - zum Anbringen von Laser an Sterotax
Kohlenstoffstahl Grate -0,5mm DurchmesserFine Science Tools19007-05Zum Erstellen von Bohrlöchern
Chrom(III)-Kaliumsulfat-DodecahydratVWREM1.01036.0250
Compact Controller für Pigtail-LaserThorlabsCLD1010LP
WattestäbchenVWR89031-288
CP 25 PipettenspitzenGilsonF148012
Donkey Anti-Ziegen IgG H& L (488)abcamab150129
Esel Anti-Kaninchen IgG H& L (647)abcamab150075
Esel Anti-Ratte IgG H& L (555)abcamab150154
EMS DPX EindeckmittelElecron MicroscopySciences 13512Eindecklösung für Objektträger
EMS Gelatinepulver Typ A 300 BloomElectron MicroscopySciences 16564Für Gelatinebeschichtung Objektträger
EMS Paraformaldehyd, GranulatVWR100504-162Zur Herstellung von 45 PFA
ESD Worstation KitElmstatWSKK5324SBNotwendigkeit für die Einrichtung des Lasers
Fiber Bench Wall Plate, ohne GewindeThorlabsHCA3Notwendigkeit des Anschlusses des Lasers an den Kopfschacht
FiberPortThorlabsPAF-X-5-AFC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, Durchmesser 0.75mm
Feine Schere - gerade/scharf-stumpf/10cmFine Science Tools14028-10
GFAP Antikörper, RatteThermo Fisher Scientific13-0300
HeizplatteKopf InstrumentsHP-4M
ImmEdge Hydrophober BarrierestiftVector LaboratoriesH-4000Zum Färben von Objektträgern
IMPAC 6-Integriertes Multi-Patienten-AnästhesiezentrumVetEquip901808
JodvorbereitungspadsMedx SuppleMED MDS093917H
Schmuckzange #5GFS-Chemikalien46085
LaserschutzbrilleThorlabsLG10BBernsteinfarbene Gläser, 35% sichtbares Licht (Brillenversionen sind ebenfalls erhältlich)
M27-1084 Leistungsstarkes LED-Dual-Schwanenhals-United-ZielfernrohrLED-11C
Medical USP Grade SauerstoffAirgasOX USP250
Miltex Adson Verbandszange, DissektionsqualitätIntefra MiltexV96-118
Mini Cord/Cordless KleintiertrimmerHarvard aparatus72-6110
Minipumpe mit variablem DurchflussThomas Scientific70730-064Pumpe für Perfusionen
Maus Gehirn Matrizen, koronale Scheiben, 1mmKent ScientificRBMA-200cFür TTC-Scheiben
Maus Gas Anästhesie KopfhalterKopf Instruments923-B
Nanojet SteuerboxChemyx10050
Nanojet PumpenkopfChemxy10051An stereotaktische Vorrichtung zum Einspritzen von Biomaterial anbringen
Nadel RN 30G PT STY 3, 0,5 ZollFishcer Scientific
Nicht reißende Ohrbügel 60ºKopf Instruments922
PBS Puffer pH 7,4VWR97062 338
Pigtaled Laser 520 nm, 100mW, 5G PinThorlabsLP520-MF100
Objektträger mit positiver LadungHaretaAHS90-WH
LeistungsmessgerätThorlabsPM100DWird verwendet, um Ihre mW-Laserleistung
zu messen Puralube Vet SalbeDr. Foster Smith9N-76855
Rektale SondeMauskopf InstrumenteRet-3-ISO
Rose Bengal Farbstoff 95%Sigma-Aldrich330000-5G
Welle Modifizierte 8-32 Gewindebohrung 1/2" TiefeKopf Instruments1770-02Zum Verbinden von Laser mit sterotaktischem
Gerät Schlanker Fotodioden-LeistungssensorThorlabsS130VCVerwendet mit Strom Energie Messgerät
SM1-Threaed 30 mm Käfigplatte 0,35" dick 2 RetentionThorlabsCP02Zum Anschluss von Laserexpander
Sol-M U-100 Insulinspritze mit 1/2 Einheit Markierungen 0,5 mLVWR10002-726Zur Injektion von Rose Bengal
StainTray Slide FärbesystemSimport ScientificM920-2Zum Färben von Objektträgern
Sterotaktisches GerätKopf Instruments940Stereotaktisches Instrument
für Kleintiere Student Adson-Pinzette -1x2Zähne Fine Science Tools91127-12
Student Feinpinzette - gerade/breit SchäfteFine Science Tools91113-10
TemperaturreglerKopf InstrumentsTCAT-2LV
Tissue-Tek OCT CompoundVWR25608-930
Triton X-100VWR97063-864
Obere Halterung KlemmeKopf Instruments1770-cZum Verbinden des Lasers mit dem stereotaktischen
Gerät Vetbond Tissue Adhessive 3mLSanta Cruz Biotechnologiesc-361931
Vogue Professional My ManiküreBargin Source6400Für Grate
VWR Bead SterilizerVWR75999-328
Tissue Tek OCT CompoundSakura4583Zur Einbettung von Gewebe
NC9459562

Referenzen

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