Hier stellen wir ein Protokoll für die halbautomatische DNA-Extraktion aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Läsionen menschlicher Halsschlagadern vor. Die Gewebelyse wird ohne toxisches Xylol durchgeführt, gefolgt von einem automatisierten DNA-Extraktionsprotokoll, das einen zweiten Lyseschritt, die Bindung der DNA an paramagnetische Partikel für die Bindung auf Zellulosebasis, Waschschritte und die DNA-Elution umfasst.
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Methodenartikel
Optimierte hochwertige DNA-Extraktion aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten humanen atherosklerotischen Läsionen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) Gewebe stellen eine wertvolle Quelle für molekulare Analysen und klinische genomische Studien dar. Diese Gewebe sind oft arm an Zellen oder schwer zu verarbeiten. Daher müssen Nukleinsäuren sorgfältig isoliert werden. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur DNA-Isolierung für Gewebe aus vielen Krankheiten, vor allem Krebs, etabliert. Leider wird genomische DNA, die aus FFPE-Geweben extrahiert wird, aufgrund der Vernetzung zwischen Nukleinsäuresträngen und Proteinen sowie durch zufällige Brüche in der Sequenz stark abgebaut. Daher ist die DNA-Qualität dieser Proben deutlich reduziert, was sie zu einer Herausforderung für weitere molekulare Downstream-Analysen macht. Weitere Probleme bei schwierigen Geweben sind z.B. der Mangel an Zellen in verkalkten atherosklerotischen Läsionen und Fettgewebe des Menschen, kleine Hautbiopsien und folglich eine geringe Verfügbarkeit der gewünschten Nukleinsäuren, wie es auch in altem oder fixiertem Gewebe der Fall ist.
In unseren Laboren haben wir eine Methode zur DNA-Extraktion aus formalinfixierten atherosklerotischen Läsionen unter Verwendung eines halbautomatischen Isolationssystems etabliert. Wir verglichen diese Methode mit anderen kommerziell erhältlichen Extraktionsprotokollen und konzentrierten uns auf weitere nachgelagerte Analysen. Reinheit und Konzentration der DNA wurden mittels Spektrometrie und Fluorometrie gemessen. Bewertet wurden der Grad der Fragmentierung und die Gesamtqualität.
Die höchste DNA-Quantität und -Qualität wurde mit dem modifizierten Blut-DNA-Protokoll für das automatisierte Extraktionssystem anstelle des kommerziellen FFPE-Protokolls erreicht. Mit diesem Schritt-für-Schritt-Protokoll waren die DNA-Ausbeuten von FFPE-Proben im Durchschnitt viermal höher und weniger Proben bestanden den Extraktionsprozess, was bei Biopsien kleiner Gefäße von entscheidender Bedeutung ist. Amplikongrößen von 200–800 bp konnten mittels PCR nachgewiesen werden. Diese Studie zeigt, dass die aus unserem FFPE-Gewebe gewonnene DNA zwar stark fragmentiert ist, aber dennoch für eine erfolgreiche Amplifikation und Sequenzierung kürzerer Produkte verwendet werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die automatisierte Technologie in unseren Händen das beste System für die DNA-Extraktion zu sein scheint, insbesondere für kleine FFPE-Gewebeproben.
Einleitung
Die Formalinfixierung mit anschließender Paraffineinbettung (FFPE) ist ein Standardverfahren zur Langzeitkonservierung pathologischer Proben im Biobanking1. Diese Proben stellen eine wertvolle Quelle für histologische Studien sowie molekulare Analysen, insbesondere genetische Studien,dar 2. Weitere Vorteile von FFPE-Geweben sind eine bessere Langzeitlagerung, geringere Kosten und einfachere Lagerbedingungen. Unsere Absicht ist es, ein zuverlässiges und einfach zu handhabendes Protokoll für die reproduzierbare Nukleinsäureisolierung aus kleinen Mengen von FFPE-Schnitten bereitzustellen, d....
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Protokoll
Die Erlaubnis zur Entnahme von atherosklerotischen Proben der menschlichen Halsschlagader in unserer Biobank wurde von der örtlichen Ethikkommission des Krankenhauses (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, München, Deutschland) genehmigt. Von allen Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt.
1. Vorbereitung des Gewebes
- Bereiten Sie 5–8 Gewebeschnitte von 10 μm aus der FFPE-Probe mit dem Mikrotom vor und übertragen Sie es i....
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Ergebnisse
Für die Erstellung des Protokolls wurden 5 FFPE-Gewebeblöcke von Patienten mit Arteriosklerose der Halsschlagader verwendet. Die DNA wurde sowohl mit einem optimierten halbautomatischen Protokoll (Kit C) als auch mit zwei kommerziell erhältlichen manuellen säulenbasierten Protokollen (Kit A und Kit B, siehe Materialtabelle) isoliert. Die DNA-Extraktion mit Kit A und B wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die einzige Änderung, die im Protokoll der beiden kommerziell erhältlichen Kits (K.......
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Diskussion
DNA-Extraktionsmethoden für FFPE-Gewebe variieren in Qualität und Quantität der isolierten DNA, was sich zwangsläufig auf die Leistung weiterer nachgelagerter Analysen auswirkt. Daher wird die Automatisierung immer wichtiger, um den Workflow und die Standardisierung sowie das Qualitätsmanagement zu verbessern. Daher wurde in der vorliegenden Studie eine halbautomatische Methode zur DNA-Extraktion aus FFPE-Proben evaluiert, die bessere Ergebnisse als die anderen getesteten manuellen säule.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Die Etablierung des Protokolls für die automatisierte DNA-Extraktion wurde von Dr. Paul Muschler von der Firma Promega unterstützt. Wir danken Paul Muschler für seine Unterstützung und seinen wissenschaftlichen Beitrag. Wir danken auch unserem Kollegen Dr. Moritz von Scheidt (Deutsches Herzzentrum München) für die Bereitstellung des Maxwell-Instruments und die Unterstützung des experimentellen Teils. Alle Experimente wurden in den Laboren des Deutschen Herzzentrums (München, Deutschland) und des Klinikums rechts der Isar (München, Deutschland) durchgeführt. Die Forschung wurde von der DFG gefördert (PE 900/6-1).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml Röhrchen für die Probeninkubation | Eppendorf, Hamburg, Deutschland | 30120086 | |
| 1-Thioglycerol | Promega, Walldorf, Deutschland | A208 | |
| Agilent Tape Station Software 3.2 | Agilent, Waldbronn, Deutschland | ||
| dsDNA HS Kit | ThermoFisher Scientific, Schwerte, Deutschland | Q32851 | |
| FFPE DNA-Aufreinigungskits (Kit A) | Norgene Biotek, Heidelberg, Deutschland | 47400 | |
| FFPE-Gewebeproben n=5 | Munich Vascular Biobank, München, Deutschland | ||
| GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B) | Qiagen, Hilden, Deutschland | 180134 | |
| Heizblöcke, eingestellt auf 80°; C und 65°; C | VWR, Darmstadt, Deutschland | 460-0250 | |
| Hochempfindliche D5000 Reagenzien | Agilent, Waldbronn, Deutschland | 5067-5593 | |
| Hochempfindliche D5000 ScreenTape | Agilent, Waldbronn, Deutschland | 5067-5592 | |
| Inkubationspuffer | Promega, Walldorf, Deutschland | D920 | |
| Maxwell Blood Kit RSC einschließlich: Lysepuffer, Elutionspuffer, Proteinase K | Promega, Walldorf, Deutschland | AS1400 | |
| Maxwell RSC 48 Instrument | Promega, Walldorf, Deutschland | AS8500 | |
| Mikrozentrifuge | Eppendorf, Hamburg, Deutschland | ||
| NanoDrop 2000c Spektrometer | ThermoFisher Scientific, Schwerte, Deutschland | ND-2000C | |
| Optische Kappen | Agilent, Waldbronn, Deutschland | 401425 | |
| Optische Tubusstreifen | Agilent, Waldbronn, Deutschland | 401428 | |
| Pipettierer und Pipettenspitzen | Eppendorf, Hamburg, Deutschland | ||
| Prism 6 für Statistik, Version 6.01 | GraphPad Inc., San Diego, Kalifornien | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher Scientific, Schwerte, Deutschland | Q33216 | |
| TapeStation 4200 | Agilent, Waldbronn, Deutschland | ||
| Tecan Infinite M200 Pro | Tecan, Mä nnedorf, Schweiz | IN-MNANO |
Referenzen
- Pelisek, J., et al. Biobanking: objectives, requirements, and future challenges-experiences from the munich vascular biobank. Journal of Clinical Medicine. 8 (2), 251(2019).
- Goelz, S. E., Hamilton, S. R., Vogelstein, B.
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Nachdrucke und Genehmigungen
