Methodenartikel

Durchflusszytometrischer Ansatz zur Charakterisierung phagozytärer Eigenschaften von akut isolierten adulten Mikroglia und Hirnmakrophagen in vitro

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DOI:

10.3791/61467

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23. Juni 2020

 ,  , 
1Department of Neurology, Emory University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Bewertung der phagozytären Eigenschaften von Mikroglia und Hirnmakrophagen kann eine wertvolle funktionelle Dimension für molekulare Profiling-Studien darstellen. Wir beschreiben ein validiertes Protokoll, das die Durchflusszytometrie verwendet, um die Phagozytose von fluoreszierenden Mikrosphären und Amyloid-Beta-Fibrillen durch akut isolierte Mikroglia und Hirnmakrophagen aus Mausmodellen schnell und zuverlässig zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Mikroglia und das Zentralnervensystem (ZNS)-infiltrierende Makrophagen, die zusammen als mononukleäre ZNS-Phagozyten (ZNS-MPs) bezeichnet werden, spielen eine zentrale Rolle bei neurologischen Erkrankungen wie Neurodegeneration und Schlaganfall. ZNS-MP sind an der phagozytären Clearance von pathologischen Proteinen, Trümmern und neuronalen Synapsen beteiligt, die jeweils unterschiedliche zugrunde liegende molekulare Signalwege aufweisen. Die Charakterisierung dieser phagozytären Eigenschaften kann zu einer funktionellen Auslesung führen, die die molekulare Profilierung von Mikroglia mit Hilfe traditioneller Durchflusszytometrie, Transkriptomik und Proteomik-Ansätze ergänzt. Die phagozytäre Profilierung von Mikroglia stützte sich auf mikroskopische Visualisierung und In-vitro-Kulturen von neonatalen Mikroglia der Maus. Der erste Ansatz leidet unter einer begrenzten Probenahme, während der zweite Ansatz von Natur aus den tatsächlichen In-vivo-Zustand von erwachsenen ZNS-MP schlecht widerspiegelt. In dieser Arbeit werden optimierte Protokolle zur Phänotypisierung phagozytärer Eigenschaften von akut isolierten Maus-ZNS-MP mittels Durchflusszytometrie beschrieben. ZNS-MP werden akut aus adulten Mäusegehirnen mittels mechanischer Dissoziation und anschließender Dichtegradientenzentrifugation isoliert, mit fluoreszierenden Mikrosphären oder fluoreszierenden Aβ-Fibrillen inkubiert, gewaschen und dann mit Antikörpern gegen Oberflächenmarker (CD11b, CD45) markiert. Mit diesem Ansatz ist es möglich, die phagozytären Eigenschaften von hirnresidenten Mikroglia mit ZNS-infiltrierenden Makrophagen zu vergleichen und dann die Auswirkungen des Alterns und der Krankheitspathologie auf diese phagozytären Phänotypen zu bewerten. Diese schnelle Methode birgt auch das Potenzial, akut isolierte humane ZNS-MP aus postmortalen oder chirurgischen Hirnproben funktionell zu phänotypisieren. Darüber hinaus können spezifische Mechanismen der Phagozytose bei ZNS-MP-Subgruppen durch Hemmung ausgewählter phagozytärer Signalwege untersucht werden.

Einleitung

Die angeborenen Immunzellen des Zentralnervensystems (ZNS) bestehen überwiegend aus Mikroglia und infiltrierenden Monozyten/Makrophagen, die zusammen als ZNS-mononukleäre Phagozyten (ZNS-MPs) bezeichnet werden1. ZNS-MP sind an neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer (AD), neuroinflammatorischen Erkrankungen und Schlaganfällen beteiligt 2,3,4. ZNS-MP haben zusammen mit Astrozyten, Perizyten und Ependymzellen phagozytische Funktionen 5,6. In ihrem homöostatischen Zustand sind ZNS-MP an der ständigen Überwachung der lokalen Mikroumgebung beteiligt, zusammen mit der phagozytären Beseitigung von apoptotischen Zelltrümmern und Proteinen und der synaptischen Beschneidung zur Umgestaltung neuronaler Verbindungen 7,8,9,10. Bei neurodegenerativen Erkrankungen wie AD nehmen ZNS-MP unterschiedliche krankheitsassoziierte molekulare und funktionelle Phänotypen an, die eine pathologische Rolle spielen können, einschließlich der Beseitigung von aggregiertem Amyloid-beta (Aβ) und neuronalen Elementen sowie der Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und Faktoren, was zu komplexen entzündungsfördernden, schädlichen sowie entzündungshemmenden, schützenden Rollen führt 11,12,13,14 . Die Phagozytose von Makropartikeln, Zelltrümmern, Proteinen und anderen infektiösen Partikeln durch ZNS-MP wird durch unterschiedliche Rezeptoren vermittelt, die auf ihrer Oberfläche exprimiert werden9. Eine Störung dieser phagozytären Signalwege kann zu einer fehlerhaften Clearance und einer fortschreitenden Akkumulation von Aβ führen, was schließlich zu einer fortschreitenden neuronalen Schädigung imJahr 4,9 n. Chr. führt. Während Fortschritte bei der molekularen Profilierung von ZNS-MP mit Hilfe transkriptomischer und proteomischer Ansätze unschätzbare Einblicke in die molekulare Heterogenität innerhalb von ZNS-MP bei neurologischen Erkrankungen geliefert haben15,16, fehlt derzeit eine funktionelle Charakterisierung der phagozytären Eigenschaften von ZNS-MP und ihren Untergruppen. Die funktionelle Charakterisierung der phagozytären Eigenschaften von ZNS-MP kann molekulare Profiling-Strategien ergänzen, eine bessere funktionelle Phänotypisierung ermöglichen und bei der Bewertung der Wirksamkeit von Therapeutika helfen, die eine defekte Phagozytose in Krankheitsmodellen beheben können17.

Herkömmliche Phagozytose-Assays für ZNS-MP umfassen die Inkubation primärer Mikroglia zusammen mit fluoreszierenden Substraten wie Aβ oder Latex/Polystyrol-Partikeln. Die Phagozytose wird dann als Funktion der Aufnahme des fluoreszierenden Substrats mit Hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht 18,19,20. Es ist allgemein bekannt, dass ZNS-MPs, wenn sie in langen Kulturen gehalten werden, ihre Morphologie und ihr Transkriptionsprofil dramatisch verändern können 21,22. Dies erschwert die Untersuchung der phagozytären Eigenschaften von ZNS-MP in ihrem repräsentativen Zustand im ZNS. Ein funktioneller Durchflusszytometrie-Assay zur Profilierung akut isolierter lebender ZNS-MP kann eine schnelle Beurteilung der phagozytischen Eigenschaften ermöglichen und einen viel größeren Pool von ZNS-MP beproben als die Mikroskopie 9,23. Darüber hinaus macht die Durchflusszytometrie die Aufrechterhaltung des ZNS-MP in Kultur überflüssig und bietet eine Plattform zur Untersuchung phagozytotischer Eigenschaften in verschiedenen Subpopulationen von ZNS-MP. Dieses Manuskript beschreibt optimierte Protokolle zur Phänotypisierung phagozytärer Eigenschaften von akut isolierten Maus-ZNS-MP mittels Durchflusszytometrie. Die Anpassung von Phagozytose-Assays mittels Durchflusszytometrie ermöglicht ein schnelles Multiplexing des phagozytären Phänotyps von ZNS-MP in Verbindung mit einer Immunphänotypisierung, wodurch Einblicke in die Heterogenität der phagozytären Eigenschaften innerhalb von ZNS-MP bei Einzelzellauflösung ermöglicht werden.

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Protokoll

Alle Studien an Mäusen wurden nach Genehmigung durch das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Emory University und in strikter Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt.

1. Vorbereitung am Tag der Isolierung

  1. Bereiten Sie einen Eiskübel vor, um alle Reagenzien, Puffer und Zellsuspensionen während des gesamten Isolierungsvorgangs kalt zu halten.
  2. Stellen Sie die Flasche mit 1× phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (mindestens 1 l) 30 min bis 1 h vor der Perfusion bei 4 °C und bewahren Sie 1× PBS während des Perfusions- und Isolierungsverfahrens auf Eis auf.
  3. Bereiten Sie die Arbeitskonzentration des Dichtegradientenmediums vor (als 35 % SIP bezeichnet, siehe Materialtabelle).
  4. Beschriften Sie alle im Experiment verwendeten konischen und Durchflusszytometrie-Röhrchen vor der Zellisolierung, um Verzögerungen bei den Verarbeitungszeiten zu vermeiden. Besorgen Sie sich außerdem alle anderen für die Isolierung vor der Perfusion erforderlichen Materialien, wie z. B. 40-μm-Zellsiebe, Spritzen und Nadeln.

2. Akute Isolierung adulter Maus-Mikroglia

  1. Betäuben Sie eine erwachsene Maus, indem Sie die Maus in eine gläserne Induktionskammer mit Isofluran (5 ml) legen, bis die Maus aufhört zu atmen und nicht auf das Kneifen der Hinterbeine reagiert.
  2. Verwenden Sie eine 26-g-Nadel und eine 10-ml-Spritze, um eine Herzperfusion mit 30 ml eiskaltem 1× PBS durchzuführen, bis kein visuelles Blut mehr vorhanden ist.
  3. Enthaupte die Maus mit einer chirurgischen Schere. Schneide die Haut mit einer kleinen Schere ab und lege den Schädel frei. Entfernen Sie den Schädel, ohne das Hirngewebe zu beschädigen, wie beschrieben24. Entfernen Sie das Gehirn sofort und geben Sie es in ein steriles 40-μm-Zellsieb, das auf ein konisches 50-ml-Röhrchen gelegt wird.
  4. Verwenden Sie die Rückseite des Kolbens einer 3-ml-Spritze, um das Gehirn durch das Sieb zu drücken und das gesamte Hirngewebe mechanisch zu dissoziieren. Waschen Sie das Zellsieb und den Kolben während der Dissoziation intermittierend mit 2 mL eiskaltem 1× PBS, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe durch das Sieb fließt.
  5. Kratzen Sie mit dem Kolben den Boden des Zellsiebs ab, um die restliche Suspension im Konus aufzufangen. Spülen Sie das Zellsieb gründlich mit eiskaltem 1× PBS und gießen Sie die Suspension in das konische 50-ml-Röhrchen.
    HINWEIS: Wenn Sie mehrere Tiere in Reihe verarbeiten, legen Sie die Zellsuspensionen bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis.
  6. Fügen Sie eiskaltes 1× PBS hinzu, um das Volumen der Zellsuspension auf 30 mL zu bringen, und zentrifugieren Sie bei 800 × g für 5 min bei 4 °C.
  7. Gießen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören, und suspendieren Sie das Pellet in 6 mL mit 35 % SIP mit einer serologischen 10-ml-Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension + 35% SIP-Gemisch in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 800 × g für 25 min bei 15 °C ohne Bremse.
    ACHTUNG: Seien Sie besonders vorsichtig, um das Einbringen von Blasen während der Resuspension zu vermeiden. Übermäßige Blasenbildung können sich nachteilig auf die Zellausbeute auswirken.
  8. Nehmen Sie das konische 15-ml-Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge, ohne die Schichten zu stören, und saugen Sie die obere schwimmende Myelinschicht ab.
  9. Die Zellsuspension + 35%iges SIP-Gemisch mit einer serologischen 10-ml-Pipette in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen mit 30 ml eiskaltem 1× PBS überführen und 5 min lang bei 4 °C bei 800 × g zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab und lassen Sie das Zellpellet zusammen mit 500 bis 800 μl 1× PBS zurück.
  10. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut, indem Sie es vorsichtig mit einer p1000-Pipette auf und ab pipettieren und in ein 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden umfüllen. 2 mL eiskaltes 1× PBS in das Rundbodenröhrchen geben und bei 1.400 × g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand schnell ab, und lassen Sie das Zellpellet, das ZNS-MP enthält, in etwa 100 μl 1× PBS (Abbildung 1).

3. Einrichtung der Phagozytose und durchflusszytometrische Färbung

  1. Übertragen Sie 20 μl (≈200.000 Zellen) des resuspendierten ZNS-MP in ein frisches 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden und fügen Sie 80 μl eiskaltes 1× PBS hinzu. Fügen Sie diesem Röhrchen keine fluoreszierenden Substrate oder Antikörper aus der Durchflusszytometrie hinzu. Diese Zellen dienen als Negativkontrolle zur Bestimmung der Hintergrundfluoreszenz von ZNS-MP für durchflusszytometrische Analysen.
  2. Um die Lebensfähigkeit der isolierten ZNS-MP zu bestimmen, verwenden Sie aminhaltige/tote Farbstoffe (z. B. Fixable Blue UV).
    1. Der Rest des Zellpellets wird in 500 μl 1× PBS resuspendiert und 1 μl des rekonstituierten Farbstoffs in jedes Probenröhrchen mit Ausnahme der Negativkontrolle gegeben.
    2. Vorsichtig vortexen, die Röhrchen mit Folie abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie anschließend 1 ml 1× PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es vorsichtig ein.
    3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.400 × g für 2 min bei 4 °C. Gießen Sie den Überstand schnell ab und suspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl 1× PBS.
      HINWEIS: Farbstoffe auf Aminbasis binden an die extrazellulären Aβ-Fibrillen, was die Ergebnisse der Phagozytose verwirrt. Andere Lebend/Tot-Indikatoren können die Fluoreszenz von Aβ-Fibrillen/Mikrosphären stören. Daher wird empfohlen, den Lebend/Tot-Indikator nur in Vorversuchen zu verwenden, um die Lebensfähigkeit der isolierten ZNS-MP zu ermitteln.
  3. Das Röhrchen mit den PE-Polystyrol-Mikrosphären gründlich vortexen und 2 μl (≈200 Mikrokügelchen/Zelle) zu 100 μl Zellsuspension in Durchflussröhrchen mit Ausnahme der Negativkontrolle hinzufügen. Wirbeln Sie jedes Röhrchen vorsichtig ein, um eine gleichmäßige Verteilung des Substrats mit den Zellen zu gewährleisten, und legen Sie die Röhrchen mit rundem Boden für 30 min bei 37 °C und 5 % CO2 in einen sterilen, befeuchteten Inkubator.
    1. Das negative Kontrollröhrchen vorsichtig vortexen und inkubieren, um gleiche Versuchsbedingungen zwischen positiven und negativen Proben zu gewährleisten.
      HINWEIS: Wenn Sie Aβ-Fibrillen anstelle von PE-Mikrosphären verwenden, bereiten Sie fluoreszierende HiLyte488 Aβ-Fibrillen wie zuvor beschriebenvor 9. Die Endkonzentration der Aβ-Fibrillen beträgt 200 μM, die dann verdünnt werden, um frisches 20 μM-Stammmaterial in PBS aus fluoreszierenden Aβ-Monomeren herzustellen. 12,5 μl der 20 μM Stamm-Aβ-Monomere werden in jedes Röhrchen mit isolierten Zellen gegeben.
  4. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und geben Sie 1 ml 1× PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es vorsichtig ein. Die Zellen bei 1.400 × g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand zügig abgießen. Wiederholen Sie die Wäsche mit 1 mL 1× PBS, zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 1.400 × g , gießen Sie den Überstand ab und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 100 μl 1× PBS.
    HINWEIS: Nach jedem Schleudern ist es wichtig, die Zellen auf Eis zu halten, um die anhaltende phagozytäre Aufnahme zu hemmen.
  5. Die Durchflusszytometrie-Antikörper werden vortexen und in einer Mikrozentrifuge für 10 s zentrifugiert. Zu jedem Zellsuspensionsröhrchen je 1 μl CD11b-APC/Cy7 und CD45-PE/Cy7 für den Aβ-Phagozytose-Assay oder CD45-FITC für die PE-Mikrosphären-Phagozytose geben. Jedes Röhrchen vorsichtig vortexen und 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Der Anwender kann auch ein separates Röhrchen mit potenten phagozytären Zellen wie kultivierten BV2-Mikroglia oder Peritonealmakrophagen als Positivkontrolle einschließen und sie mit PE-Mikrosphären und durchflusszytometrischen Antikörpern behandeln, wie oben beschrieben. Die Daten aus dieser Probe können verwendet werden, um in Vorversuchen die Positivkontrolle zu definieren, die eine echte Phagozytose anzeigt.
  6. Während sich die Zellen in der Inkubation befinden, richten Sie Kompensationsröhrchen mit vier 5-ml-Durchflussröhrchen mit rundem Boden ein. Die Ausgleichsperlen gründlich vortexen und 1 Tropfen in jedes Röhrchen geben. Geben Sie 1 μl CD11b-APC/Cy7 in das erste Röhrchen und CD45-FITC, um das Röhrchen zu zweit. Geben Sie 1 μl PE-Polystyrol in das dritte Röhrchen und bewahren Sie die unverfärbten Ausgleichsperlen im vierten Röhrchen auf. Verwenden Sie dieses vierte Rohr als Negativkontrolle, um eine Kompensationsplatte am Durchflusszytometer einzurichten.
    HINWEIS: Wenn Aβ-Fibrillen zur Untersuchung der Phagozytose verwendet werden, geben Sie CD45-PECy7 anstelle von CD45-FITC in das zweite Röhrchen. 1 μl separater FITC-markierter Durchflusszytometrie-Antikörper oder FITC-Sekundärantikörper (jede Spezies) in das dritte Kompensationsröhrchen geben. Dies ist wichtig, da die Kügelchen nicht an Aβ-Fibrillen binden können und beim Waschen der Ausgleichsröhren weggespült werden.
  7. Lassen Sie die Kompensationskügelchen mit ihren jeweiligen Antikörpern mindestens 10 Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation 1 ml 1× PBS in jedes Röhrchen geben, 2 min bei 4 °C bei 1.400 x g zentrifugieren und den Überstand schnell abgießen. Legen Sie die Ausgleichsröhrchen auf Eis und decken Sie sie mit der Folie bis zur Durchflusszytometrie ab.
  8. Nach der Inkubation mit Durchflusszytometrie-Antikörpern waschen Sie die gefärbten Zellen mit 1 ml 1× PBS. Die Zellen bei 1.400 × g für 2 min bei 4 °C vorsichtig vortexen und zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand schnell ab und wiederholen Sie die Wäsche mit 1 mL 1× PBS. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgegossen und das Zellpellet in 100 μl 1× PBS wieder suspendiert.
  9. Legen Sie die Probenröhrchen auf Eis und decken Sie sie bis zur Durchflusszytometrie mit der Aluminiumfolie ab.
    HINWEIS: Verwenden Sie während des gesamten Experiments 1× PBS (pH 7,0) ohne Ca2+/Mg2+ als Flusspuffer. Stellen Sie sicher, dass fötales Rinderserum (FBS) im Flusspuffer ausgeschlossen wird, um eine mögliche Aktivierung der Mikroglia zu vermeiden.

4. Durchflusszytometrie und -analyse

  1. Einrichtung und Kompensation des Instruments
    HINWEIS: Die Experimente in diesem Manuskript wurden an einem Durchflusszytometer mit ultravioletten, violetten, blauen, gelbgrünen und roten Lasern durchgeführt. Dieses Experiment kann auch an Drei-Laser-Durchflusszytometer angepasst werden, die nur mit blauen, gelb-grünen und roten Lasern ausgestattet sind. Der Benutzer muss eine formelle Schulung absolvieren, bevor er mit dem Instrument umgehen kann.
    1. Füllen Sie den Puffertank der Durchflussschleuse wieder auf und schalten Sie das Zytometer ein. "Entlüften" Sie das Zytometer mit einem 5-ml-Durchflussröhrchen mit rundem Boden, das ddH2O enthält. Melden Sie sich auf dem Computer, der mit dem Durchflusszytometer verbunden ist, in der Analysesoftware an. Erstellen Sie ein "Experiment" und wählen Sie FSC, SSC, FITC, PECy7 und APC-Cy7 als Parameter aus. Wenn Sie PE-Mikrosphären verwenden, wählen Sie PE anstelle von PECy7 in der Parameterleiste.
    2. Erstellen Sie ein entsprechendes Vergütungspanel.
      HINWEIS: In unseren Experimenten liegen die FSC/SSC-Spannungen für Kompensationsperlen typischerweise bei etwa 350/280, während die FSC/SSC-Spannungen für CNS-MPs bei etwa 320/260 liegen. Diese Werte können zwischen zwei verschiedenen Zytometern variieren und müssen vor dem eigentlichen Experiment kalibriert werden.
    3. Jedes Kompensations- und Zellsuspensionsröhrchen mit 500 μl 1× PBS rekonstituieren, kurz vortexen und auf Eis legen. Lassen Sie die Negativkontrolle/das ungefärbte Bead-Rohr laufen, um die entsprechenden Spannungen so einzustellen, dass der Peak in jedem Fluorophor-Histogramm unter 102 liegt. Lassen Sie die anderen einfarbigen Kompensationsröhren laufen, um ihre ausgeprägten positiven Spitzen zu identifizieren.
      HINWEIS: Zwischen den positiven und negativen Peaks jedes Fluorophors sollte eine Differenz von mindestens der Hälfte log (Basis 10) vorhanden sein.
    4. Zeichnen Sie 5000 Ereignisse von jedem Kompensationsrohr auf, damit der Computer die Kompensationseinrichtung automatisch berechnen kann. Verknüpfen Sie den Kompensationsaufbau mit dem aktuellen Experiment25.
    5. Erstellen Sie eine neue "Röhre" unter der Registerkarte "Beispiel". Den negativen Steuerschlauch mit den ungefärbten CNS-MPs vorsichtig vortexen und laufen lassen. Passen Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen an, um die interessierende Population zu erfassen. Zeichnen Sie die Ereignisse und das Sub-Gate auf den Live-CNS-MPs auf, wie unten erwähnt.
    6. Erfassen und Aufzeichnen von Ereignissen aus allen nachfolgenden Röhren als separate Dateien, wobei die Parameter und Spannungen konsistent bleiben. Wirbeln Sie jedes Röhrchen vorsichtig durch, bevor Sie es auf das Durchflusszytometer legen.
  2. Gating-Strategie und Messung der Phagozytose
    1. Zeichne ein erstes mononukleäres Tor, um alle ZNS-MP einzufangen. Diese lebenden mononukleären Zellen müssen in der folgenden Grafik so begrenzt werden, dass sie nur einzelne Zellen enthalten, ohne Couplets und Tripletts.
    2. Projizieren Sie die geschlossene einzelne, lebende ZNS-MP-Population auf ein nachfolgendes Diagramm, das CD11b- und CD45-Fluorophore zeigt.
      HINWEIS: Gehirnresidente Mikroglia sind typischerweise CD11b+CD45-intermediär, während infiltrierende Makrophagen CD11b+CD45-hoch sind. Zusätzliche Marker wie Ly6c können in das Panel aufgenommen werden, um entzündliche Monozyten (Ly6choch und CD45hoch) weiter von Mikroglia (Ly6cniedrig, CD45intermediär) zu trennen.
    3. Wenden Sie geeignete Gates an, um die Phagozytose in den jeweiligen Populationen weiter zu untersuchen, wie in Abbildung 2F gezeigt.
      HINWEIS: Die Phagozytose bei ZNS-MPs wird in Abhängigkeit von ihrer Hilyte488/Alexa488 (Aβ) oder PE (Mikrosphäre) Fluoreszenzaufnahme gemessen. Deutliche positive Peaks in ihren jeweiligen Histogrammen deuten darauf hin, dass die ZNS-MP das Substrat phagozytiert haben. Die Menge des phagozytierten Materials ist direkt proportional zur Intensität der Fluoreszenz. Daher muss das Vorhandensein mehrerer Peaks als höhere Phagozytose interpretiert werden. Diese können anschließend immunhistochemisch bestätigt werden.
    4. Nachdem Sie alle Probenröhrchen auf dem Durchflusszytometer aufgezeichnet haben, exportieren Sie die Datendateien im .fcs-Format für die weitere Analyse.
  3. Statistische Datenanalyse
    1. Verwenden Sie für alle Datenanalysen eine beliebige Durchflusszytometrie-Analysesoftware zusammen mit Tabellenkalkulationen und statistischer Analysesoftware.
    2. Fügen Sie die .fcs-Dateien zur Analysesoftware hinzu und doppelklicken Sie auf die erste Datei. Ein Diagramm, in dem alle aufgezeichneten
      Ereignisse werden angezeigt. Verfolgen Sie eine ähnliche Gating-Strategie wie in Abbildung 2 gezeigt, um einzelne, lebende mononukleäre Zellen anschließend zu gaten und die Phagozytose an einer bestimmten Population zu untersuchen, z. B. CD11b+CD45intermediäre Mikrogliazellen (Abbildung 2H).
      HINWEIS: Der phagozytäre Index wird auf der Grundlage des Anteils der Zellen beurteilt, die fluoreszierende Aβ-Fibrillen oder ≥1-Mikrosphäre(n) internalisieren. Wie zuvor definiert, ist die Phagozytose auf niedrigem Niveau die Aufnahme von mindestens 1 Mikrosphäre und die Phagozytose auf hohem Niveau ist >1 Bead-Aufnahme 8,9. Basierend auf früheren Experimenten hemmt die Hemmung von Aktin-abhängigen Prozessen durch Cytochalasin D die Aufnahme von >1-Kügelchen vollständig und teilweise die Aufnahme von 1 Kügelchen9 sowie die vollständige Hemmung der Aβ-Aufnahme, was eher eine aktinabhängige phagozytäre Aufnahme als eine passive Bindung an die Zelloberfläche bestätigt. Die Immunzytochemie bestätigt auch, dass jeder sequentielle Peak im Mikrosphären-Assay repräsentativ für eine einheitliche Zunahme der Anzahl der phagozytierten Kügelchenist 8,9.

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Ergebnisse

Um typische Ergebnisse der phagozytären Aufnahme von Mikrosphären und Aβ42-Fibrillen durch akut isolierte ZNS-MP zu veranschaulichen, wurden akut isolierte ZNS-MP aus der ipsilateralen Hemisphäre nach einem vorübergehenden mittelzerebralen arteriellen Verschluss (MCAO) gewonnen8. Einzelheiten zu den phagozytären Eigenschaften von ZNS-MP im MCAO-Modell finden Sie in früheren Publikationen8. Kurz gesagt, nach einer 72-stündigen Genesung wurden ZNS-MP akut aus frischem Gehirn ...

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Diskussion

Die Durchflusszytometrie ist eine Technik, mit der die Expression von Proteinen oder Markern von Interesse auf der Zelloberfläche oder in intrazellulären Kompartimenten unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Sonden (typischerweise Antikörpern) nachgewiesen werden kann, um diese interessanten Marker zu markieren. Zelloberflächen- oder intrazelluläre Antikörper werden typischerweise mit lasererregbaren Fluorochromen konjugiert, die einzigartige Emissionsspektren aufweisen. Zellen, die ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Studie wurde durch NIH-Auszeichnungen an Dr. Rangaraju (NINDS K08 NS099474-1 und R01 NS114130-01A1) und Dr. Rayaprolu (NIA F32AG064862) unterstützt. Diese Studie wurde teilweise vom Emory Flow Cytometry Core (EFCC), einer der Emory Integrated Core Facilities (EICF), unterstützt und wird von der Emory University School of Medicine subventioniert. Zusätzliche Unterstützung leistete die Georgia Clinical & Translational Science Alliance der NIH (UL1TR002378). Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIH wider.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10x Hank's ausgewogene Salzlösung (10x HBSS)ThermoFisher14065056Lagerung bei 4 >C. Wird verwendet, um SIP herzustellen, wie im Protokoll beschrieben
1x Hank's balancierte Salzlösung (1x HBSS)ThermoFisher14175095Lagerung bei 4 &/�C. Wird verwendet, um 35% SIP herzustellen, wie im Protokoll beschrieben
1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html 10xPBS bei Raumtemperatur lagern. Bereiten Sie frische 1xPBS zu, indem Sie einen Teil 10xPBS auf neun Teile MilliQ dH20 verdünnen und bei 4 μg lagern. C für eine Stunde vor Gebrauch. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert des 1xPBS vor dem Kühlschrank 7,0 beträgt.
35% SIPUm 20 mL 35% SIP herzustellen, verwenden Sie 7 mL SIP und 13 mL eiskaltes 1&mal; HBSS. Bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis aufbewahren
APC-Cy7 Ratte Anti-CD11bBD Pharmingen557657Bei 4 & Grad lagern; C oder während des Gebrauchs auf Eis legen. Vor dem Licht geschützt. Durchflusszytometrie-Verdünnung - 1:100
FITC Ratte Anti-Maus CD145BD Pharmingen553080Bei 4 & Grad lagern; C oder während des Gebrauchs auf Eis legen. Vor dem Licht geschützt. Durchflusszytometrie-Verdünnung - 1:100
LIVE/DEAD Fixierbares blaues Fleckenset für tote ZellenThermoFisherL34961Bei -20 °C lagern. 50 μl DMSO in ein Röhrchen des Farbstoffs geben, durchwirbeln und 1 Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. L aliquot und lagern Sie sie bei -20 °C. Verwenden Sie für jedes Experiment ein frisches Aliquot und geben Sie es in einer Verdünnung von 1:500 zu den Proben.
OneComp eBeads AusgleichsperlenThermoFisher01-1111-42Bei 4 > lagern; C, das Röhrchen gründlich durchwirbeln, bevor Sie es in das/die Probenröhrchen(n) geben, während des Gebrauchs auf Eis halten.
PE-Cy7 Ratte Anti-Maus CD145BD Pharmingen552848Bei 4 & Grad lagern; C oder während des Gebrauchs auf Eis legen. Vor dem Licht geschützt. Verdünnung der Durchflusszytometrie - 1:100
Percoll pH8,5-9,5SigmaP1644Bei 4 & °C lagern. Zur Herstellung von 10 mL isotonischem Standard-Percoll (SIP): Verwenden Sie 9 mL kaltes Percoll und 1 mL Kälte 10-mal; HBSS.
Phycoerythrin-konjugierte MikrosphärenThermoFisherF13083Bei 4 ° lagern; C oder während des Gebrauchs auf Eis legen.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - markiert, HumanAnaSpecAS-60479-01Die Endkonzentration der Ab-Fibrillen beträgt 200&μm; M, das dann vor der Verwendung verdünnt wird. Bei -20 °C lagern. Bereiten Sie für jedes Experiment eine frische Arbeitslösung vor.

Referenzen

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  2. Heneka, M. T., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. Lancet Neurology. 14 (4), 388-405 (2015).
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  5. Bellesi, M., et al. Sleep Loss Promotes Astrocytic Phagocytosis and Microglial Activation in Mouse Cerebral Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (21), 5263-5273 (2017).
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