Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.
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Methodenartikel
Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die menschliche Implantation, die Apposition und Haftung an der Gebärmutteroberflächenepithelie und die anschließende Invasion der Blastozyste in die mütterliche Dekliste, ist ein kritisches, aber rätselhaftes biologisches Ereignis, das aufgrund technischer und ethischer Einschränkungen historisch schwierig zu untersuchen war. Die Implantation wird durch die Entwicklung des Trophektoderms zu frühen Trophoblasten und die anschließende Differenzierung in unterschiedliche Trophoblasten-Unterlinien eingeleitet. Aberrante frühe Trophoblastendifferenzierung kann zu Implantationsversagen, Plazentapathologien, fetalen Anomalien und Fehlgeburten führen. Kürzlich wurden Methoden entwickelt, die es menschlichen Embryonen ermöglichen, bis zum Tag 13 nach der Befruchtung in vitro in Abwesenheit von mütterlichem Gewebe zu wachsen, eine Zeit, die die Implantationszeit beim Menschen umfasst. Dies hat den Forschern die Möglichkeit gegeben, die menschliche Implantation zu untersuchen und die Dynamik der Trophoblastendifferenzierung während dieser kritischen Periode zu rekapitulieren, ohne mütterliche Einflüsse zu verwirren und inhärente Hindernisse zu vermeiden, um frühe Embryodifferenzierungsereignisse in vivo zu untersuchen. Um verschiedene Trophoblast-Unterlinien während der Implantation zu charakterisieren, haben wir bestehende zweidimensionale (2D) erweiterte Kulturmethoden übernommen und ein Verfahren entwickelt, um verschiedene Arten von Trophoblastenzellen für nachgeschaltete Assays enzymatisch zu verdauen und zu isolieren. Embryonen, die in 2D-Bedingungen kultiviert werden, haben eine relativ abgeflachte Morphologie und können suboptimal bei der Modellierung dreidimensionaler (3D) embryonaler Architekturen in vivo sein. Die Trophoblastendifferenzierung scheint jedoch weniger betroffen zu sein, wie die erwarteten Veränderungen der Morphologie und der Genexpression im Laufe der erweiterten Kultur zeigen. Verschiedene Trophoblast-Unterlinien, einschließlich Cytotrophoblast, Synzytiotrophoblast und migratorischer Trophoblasten, können durch Größe, Position und zeitliche Entstehung getrennt und für weitere Charakterisierungen oder Experimente verwendet werden. Die Untersuchung dieser frühen Trophoblastenzellen kann entscheidend zum Verständnis der menschlichen Implantation, zur Behandlung von häufigen Plazentapathologien und zur Milderung der Inzidenz von Schwangerschaftsverlusten beitragen.
Einleitung
Die menschliche Implantation und die Entstehung der frühen Plazenta sind historisch schwer zu untersuchen und bleiben weitgehend unbekannt, da menschliche Gewebe in diesem Stadium, in dem eine Schwangerschaft klinisch nicht nachweisbar ist, unzugänglich sind. Tiermodelle sind unzureichend, da die menschliche Platierweise ihre eigenen Einzigartigen im Vergleich zu anderen eutherischen Säugetieren hat. Zum Beispiel dringt die menschliche Plazenta tief in die Dezidua ein, wobei einige Trophoblastenzellen mindestens das innere Drittel des Uterusmyometriums erreichen, während andere Zellen die Gebärmutterspiralarterien umgestalten. Selbst unsere nächsten evolutionären Vorf....
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Protokoll
Alle menschlichen Embryonen wurden mit Zustimmung zur Verwendung in der Forschung gespendet. Protokolle für eine erweiterte menschliche Embryokultur wurden vom Western Institutional Review Board (Studie Nr. 1179872) genehmigt und folgen internationalen Richtlinien. Jede Verwendung menschlicher Embryonen muss von den zuständigen Ethik- und Leitungsgremien überprüft werden, die mit der Forschungseinrichtung unter Verwendung dieses Protokolls verbunden sind.
1. Vorbereitung
- Bereiten Sie Medien und Rückgewinnungsplatten einen Tag vor der Embryoerwärmung in einer sterilen laminaren Strömungshaube vor.
- Bereiten Sie 2 ml Blastozy....
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Ergebnisse
Gesunde Embryonen zeigten im Laufe der erweiterten Kultur eine anhaltende Proliferation (Abbildung 2B). Abnorme Embryonen begannen, sich von ihren äußeren Rändern zurückzuziehen und zerfallen (Abbildung 2C). Aus unserer Erfahrung wurden ca. 75% der Embryonen bei 48 h am Boden der fibronectinbeschichteten Schale befestigt und die Anhaftung stieg in der Kultur um ca. 90% um 72 h an. Der Erfolg der Embryo-Anhaftung kann weitgehend durch die anfängliche Qualität der.......
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Diskussion
Die Entwicklung des Protokolls zur Kultur menschlicher Embryonen durch Implantation hat es Wissenschaftlern ermöglicht, eine bisher unbekannte Entwicklungszeit zu erforschen8,9. Hier verwenden wir ein erweitertes Kultursystem, um menschliche Embryonen zu kultivieren und die frühe Trophoblastendifferenzierung vor der Bildung einer villous Plazenta zu untersuchen. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen es uns, verschiedene TB-Unterlinien für die Nachfluss-Einz.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir möchten die vielen Patienten am Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) würdigen, die ihre Embryonen gnädig für die Forschung gespendet haben. Wir danken auch Karen Maruniak und dem klinischen Labor am CCRM für ihre Hilfe bei der Verarbeitung von hCG-Proben sowie Sue McCormick und ihrem klinischen IVF-Embryologie-Team bei CCRM für ihre Hilfe bei der Sammlung, Lagerung, Verfolgung und Spende von Embryonen. Die Finanzierung erfolgte intern durch CCRM.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| NORM JECT Luer-Lock-Sterilspritze | VWR | 53548-019 | Packung mit 100 |
| 3130 oder 3110 Forma Serie II wasserummantelter CO2-Inkubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria Gewebekulturschale | VWR | 62406-038 | Karton mit 500 |
| ml Schnappverschlussröhrchen | VWR | 60819-295 | Packung mit 25 |
| Stück 60 mm Corning Primaria Gewebe Kulturschale | VWR | 25382-687 | Karton mit 200 |
| 6-Well-Schüsseln | Agtech Inc. | D18 | Packung mit 1, 10 oder 50 |
| sauren Tyrodenlösung | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 & micro; L Pipettenspitzen | VWR | 76322-156 | Packung mit 960 |
| Blast, Blastozysten-Nährmedien | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Verdünnungslösung | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Einweg-Borosilikatglas Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5,75 Zoll (146 mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Millipore Sigma | D8537 | |
| Paraffinöl in Embryokultur OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR-Röhrchen 0,2 mL | VWR | 47730-598 | Packung mit 1.000 |
| Eppendorf PCR-Röhrchen 0,5 mL | VWR | 89130-980 | Karton mit 500 |
| Fibronektin aus menschlichem Plasma. Flüssige .1% ige Lösung | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 & Mikro; L |
| Gilson 20 & Mikro; L Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 & micro; L |
| Gilson 200 & Mikro; L Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 & micro; L |
| G-MOPS Handhabungsmedien | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handhabungsmedien | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 gut gekammerte Deckgläser | Ibidi | 80826 | 15 Objektträger pro Schachtel |
| IVC1/IVC2 | Zellführungssysteme | M11-25/ M12-25 | 5-5 ml Aliquote |
| K System T47 Warmhalteplatte | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Spritzenvorsatzfilter mit Durapore PVFD-Membran | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Packung mit 50 |
| Mundstücken | IVF Store | MP-001-Y | 100 Stück |
| Oosafe Center Well Schale | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Etui mit 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Gummilatexschlauch für Mundstücke | IVF-Geschäft | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomikroskop | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripperspitzen | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µ m |
| Auftaulösung | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Mikropipette | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzym (1X), kein Phenolrot | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL Flasche |
| VWR 1-20 µ L Pipettenspitzen | VWR | 76322-134 | Packung à 960 |
| VWR 1-200 & micro; L Pipettenspitzen | VWR | 89174-526 | Packung à 960 |
| Waschlösung | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
Referenzen
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnen....
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Nachdrucke und Genehmigungen
