Methodenartikel

Nachweis von Phytophthora capsici im Bewässerungswasser mit Loop-Mediad Isothermale Amplifikation

DOI:

10.3791/61478

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25. Juni 2020

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1Department of Plant Pathology, Coastal Plain Experiment Station, University of Georgia, 2University of Georgia Cooperative Extension, 3Department of Plant Pathology, Tropical Research & Education Center, University of Florida, 4Department of Agricultural and Environmental Sciences, Otis L. Floyd Nursery Research Center, Tennessee State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir haben eine Methode entwickelt, um Phytophthora capsici zoospores in Wasserquellen mit einer Filterpapier-DNA-Extraktionsmethode in Verbindung mit einem schleifenvermittelten isothermen Amplifikationstest (LAMP) zu detektieren, der im Feld oder im Labor analysiert werden kann.

Zusammenfassung

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Phytophthora capsici ist ein verheerender Oomycete-Erreger, der viele wichtige solanaceous und cucurbit Kulturen betrifft, die erhebliche wirtschaftliche Verluste in der Gemüseproduktion jährlich verursachen. Phytophthora capsici ist bodenbedingt und aufgrund seiner langlebigen Überlebensstrukturen (Oosporen und Chlamydosporen), die Witterung und Degradation widerstehen, ein anhaltendes Problem auf Gemüsefeldern. Die Hauptmethode der Dispersion ist durch die Herstellung von Zoosporen, die einzellig sind, flagellated Sporen, die durch dünne Wasserschichten auf Oberflächen oder in wassergefüllten Bodenporen schwimmen können und in Pfützen und Teichen ansammeln können. Daher können Bewässerungsteiche eine Quelle des Erregers und der Anfangspunkte von Krankheitsausbrüchen sein. Der Nachweis von P. capsici in Bewässerungswasser ist mit traditionellen kulturbasierten Methoden schwierig, da andere Mikroorganismen, die in der Umwelt vorkommen, wie Pythium spp., in der Regel P. capsici überwuchern, was es nicht nachweisbar macht. Um das Vorhandensein von P. capsici-Sporen in Wasserquellen (Bewässerungswasser, Abflusses usw.) zu bestimmen, haben wir ein Handpumpen-basiertes Filterpapier (8-10 m) entwickelt, das die Sporen des Erregers (Zoosporen) erfasst und später verwendet wird, um die DNA des Erregers durch eine neuartige, schleifenvermittelte isotherme isotherme Amplifikation (LAMP) zu verstärken. Diese Methode kann DNA aus einer Konzentration von bis zu 1,2 x 102 Zoosporen/ml verstärken und detektieren, was 40-mal empfindlicher ist als herkömmliche PCR. Bei der Prüfung eng verwandter Arten wurde keine Kreuzverstärkung erreicht. LAMP wurde auch mit einem kolorimetrischen LAMP-Master-Mix-Farbstoff durchgeführt, der Ergebnisse anzeigte, die mit bloßem Auge für die schnelle Erkennung vor Ort gelesen werden konnten. Dieses Protokoll könnte an andere Krankheitserreger angepasst werden, die sich über kontaminierte Bewässerungssysteme aufhalten, ansammeln oder dispergieren.

Einleitung

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Das Recycling von Wasser in landwirtschaftlichen Betrieben und Baumschulen wird aufgrund der steigenden Wasserkosten und der Umweltbedenken hinter der Wassernutzung immer beliebter. Viele Bewässerungsmethoden wurden für Züchter entwickelt, um die Ausbreitung und das Auftreten von Pflanzenkrankheiten zu reduzieren. Unabhängig von der Quelle des Wassers (Bewässerung oder Niederschlag) wird Abflusses erzeugt, und viele Gemüse- und Gärtnereien haben einen Teich, um Abflusses zu sammeln und zu recyceln1. Dadurch entsteht ein Reservoir für eine mögliche Anhäufung von Krankheitserregern, die die Ausbreitung von Krankheitserregern begünstigt, wenn das recycelte Wasser zur Bewässerung von Pflanzen2,3,4verwendet wird. Oomycete Pflanzenpathogene profitieren besonders von dieser Praxis, da Zoosporen sich im Wasser ansammeln und die primäre dispersive Sporen ist selbst-motil, erfordert aber Oberflächenwasser5,6,7. Phytophthora capsici ist ein Oomycete-Erreger, der eine erhebliche Anzahl von solanaceous und Cucurbit Kulturen in verschiedenenWeisen8 betrifft. Oft sind die Symptome Dämpfung von Sämlingen, Wurzel und Krone Fäulnis; Bei Kulturen wie Gurke, Kürbis, Melone, Kürbis, Wassermelone, Auberginen und Pfeffer können jedoch ganze Ernten durch Fruchtfäule verloren gehen9. Obwohl es bekannte Methoden zum Nachweis dieses Pflanzenerregers gibt, benötigen die meisten eine Infektion, die bereits stattgefunden hat, was zu spät ist, damit irgendwelche präventiven Fungizide eine signifikante Wirkung haben10.

Die traditionelle Methode, Bewässerungswasser für den Nachweis und die Diagnose von gezielten Mikroorganismen zu testen, ist ein antiquierter Ansatz, wenn Geschwindigkeit und Empfindlichkeit entscheidend für den Erfolg und profitable Pflanzenproduktion sind11,12. Pflanzengewebe, das für den gezielten Erreger empfänglich ist (z. B. Auberginen für P. capsici), wird an einer modifizierten Falle befestigt, die über einen längeren Zeitraum in einem Bewässerungsteich aufgehängt wird, bevor sie entfernt und auf Infektionen untersucht wird. Proben aus dem Pflanzengewebe werden dann auf semiselektiven Medien (PARPH) plattiert und für das Kulturwachstum inkubiert, dann wird die morphologische Identifizierung mit einem zusammengesetzten Mikroskop13durchgeführt. Es gibt andere ähnliche Nachweismethoden für andere Pflanzenpathogene, die selektive Medien verwenden und kleine Mengen kontaminierten Wassers plattieren, bevorsie 14,15sub-culturing sub-culturing. Diese Methoden erfordern zwischen 2 und 6 Wochen, mehrere Unterkultivierungsrunden, um den Organismus zu isolieren, und Erfahrung mit Phytophthora-Diagnostik, um die wichtigsten morphologischen Charaktere jeder Art erkennen zu können. Diese traditionellen Methoden eignen sich nicht gut für den Nachweis von Bewässerungswasser, das durch P. capsici aufgrund von Faktoren wie Interferenzen durch andere Mikroorganismen kontaminiert ist, die auch in den Wasserquellen vorhanden sind. Einige schnell wachsende Mikroorganismen wie Pythium spp. und wassergetragene Bakterien können auf der Platte überwuchern, so dass P. capsici nicht nachweisbar16,17.

Der Zweck dieser Studie war die Entwicklung einer empfindlichen und spezifischen molekularen Methode, die sowohl in Feld- als auch laboratoriumsspezifischen Umgebungen zum Nachweis von P. capsici Zoosporen im Bewässerungswasser verwendet werden kann. Das Protokoll beinhaltet die Entwicklung eines neuartigen schleifenvermittelten isothermen Amplifikations-Primers (LAMP)-Primers, das in der Lage ist, P. capsicispezifisch zu verstärken, basierend auf einem 1121-Basenpaar (bp) Fragment von P. capsici18,19. Ein zuvor entwickelter LAMP Primer von Dong et al. (2015) wurde im Vergleich zu dem für diese Studie entwickelten Test verwendet20.

Der LAMP-Assay ist eine relativ neue Form der molekularen Detektion, die nachweislich schneller, empfindlicher und spezifischer ist als herkömmliche Polymerase-Kettenreaktion (PCR)21. Im Allgemeinen können herkömmliche PCR-Assays nicht unter 500 Kopien (1,25 pg/l) erkennen; Im Gegensatz dazu haben frühere Studien gezeigt, dass die Empfindlichkeit von LAMP 10 bis 1.000 Mal höher sein kann als herkömmliche PCR und leicht sogar 1 fg/l genomische DNA22,23erkennen kann. Darüber hinaus kann der Test schnell (oft in 30 min) und vor Ort (im Feld) mit einem tragbaren Heizblock für die Verstärkung und einem kolorimetrischen Farbstoff durchgeführt werden, der die Farbe für eine positive Probe ändert (wodurch die Elektrophorese entfällt). In dieser Studie haben wir die Empfindlichkeit von PCR- und LAMP-Assays mit einer Filterextraktionsmethode verglichen. Die vorgeschlagene Nachweismethode ermöglicht es Forschern und Erweiterungsmitteln, das Vorhandensein von P. Capsici-Sporen aus verschiedenen Wasserquellen in weniger als zwei Stunden leicht zu erkennen. Der Test ist nachweislich empfindlicher als herkömmliche PCR und wurde vor Ort durch den Nachweis des Vorhandenseins des Erregers in dem von einem Züchter verwendeten Bewässerungswasser validiert. Diese Nachweismethode wird es den Züchtern ermöglichen, das Vorhandensein und die Populationsdichte des Erregers in verschiedenen Wasserquellen zu schätzen, die für die Bewässerung verwendet werden, wodurch verheerende Ausbrüche und wirtschaftliche Verluste verhindert werden.

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Protokoll

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1. Vor-Ort-Nachweis von Phytophthora capsici aus Bewässerungswasser mittels tragbarer, schleifenvermittelter isothermaler Amplifikation

  1. Einrichten der Pumpe und des Filters
    1. Befestigen Sie einen Filterkolben an einem Rohr, das mit einer Handpumpe verbunden ist, so dass bei Aktivierung der Pumpe Luft durch den Mund des Filterkolbens eingezogen wird.
    2. Den Buchner-Trichter in den Gummistopfen in den Mund des Filterkolbens einbauen und das entsprechend große Stück Filterpapier in den Buchner-Trichter einbauen, so dass Luft durch das Filterpapier gezogen wird. Das Filterpapier sollte eine Retentionsgröße von 15 m haben.
      HINWEIS: Das Filterpapier muss an den Rändern des Buchner-Trichters passen, damit nur wenig Wasser um das Filterpapier fließt.
  2. Wasserprobenahme und -filterung
    1. Nehmen Sie Wasserproben aus der Zielquelle. Wasser kann kleine Mengen an Schutt haben, aber nicht signifikante Sedimente oder Boden.
    2. Gießen Sie bis zu 1.000 ml (1 Liter) Testwasser langsam genug über das im Buchner-Trichter platzierte Filterpapier, um einen Überlauf zu verhindern, während die Handpumpe (oder das Vakuum) verwendet wird, um eine Absaugung zu erzeugen, um das Wasser durchzuziehen.
      HINWEIS: Es gibt keine Mindestmenge an Wasser, die mit dieser Methode getestet werden kann, und obwohl es mindestens 50 ml vorgeschlagen wird, ist 1000 ml das Maximum für diese Methode.
    3. Mit Zangen das Filterpapier aus dem Buchner-Trichter entfernen und mit einer sterilen Schere in kleine Stücke schneiden. Fügen Sie so viele Stücke (8-12) hinzu, wie in die Menge des Extraktionspuffers (400 l für die magnetische Perlenextraktion) eingetaucht werden können, die das Protokoll in ein 1,5 ml-Rohr einfügt. Speichern Sie die verbleibenden Teile des Filterpapiers für die Verarbeitung, nachdem der erste Satz extrahiert wurde.
    4. Wirbel oder anderweitig agitieren die Stücke von Filterpapier und Extraktionspuffer für 10 s pro Minute für 5 min. Entfernen Sie dann mit Zangen das Filterpapier, das so wenig wie möglich vom Extraktionspuffer verliert. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den restlichen Stücken Filterpapier, bis alle Teile gewirbelt/gerührt und im Extraktionspuffer eingeweicht wurden.
  3. Magnetische Perlen-basierte Extraktion von DNA aus Filterpapier
    1. In das 1,5 ml-Rohr (das nun ca. 200-300 l Extraktionspuffer enthält) 20 l Proteinase K und 10 l mit 10 ng/l RNase hinzufügen.
    2. Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren, Wirbel oder schütteln Sie das Rohr alle 3 min.
    3. Fügen Sie der Probe 500 l Magnetperlen mit dem Bindungspuffer hinzu und mischen Sie sie durch Schütteln gut. Dann für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Legen Sie das Rohr 2 min in das Magnetabscheidergestell, bis alle Perlen an den Magneten gezogen wurden. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
    5. Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Separator. Fügen Sie 500 l Waschpuffer 1 hinzu und hängen Sie die Perlen erneut auf, indem Sie das Rohr kräftig schütteln. Warten Sie 30 s und legen Sie das Rohr dann wieder in den magnetischen Separator. Warten Sie 2 min, bis alle Perlen zum Magneten gezogen wurden, bevor Sie den Überstand entfernen und entsorgen.
      HINWEIS: Wenn Sie darauf warten, dass die magnetischen Perlen auf den Separator magnetisieren, empfehlen wir, das Rohr umzukehren, das magnetische Perlen, die an der Kappe und den Seiten des Rohres kleben und dazu führen können, dass eine größere Anzahl von Perlen angebracht wird, auflösen kann.
    6. Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 mit 500 l Waschpuffer 2.
    7. Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 mit 500 l 80% Ethanol.
    8. Das magnetische Perlenpellet 15 min bei Raumtemperatur (18-27 °C) mit geöffnetem Deckel austrocknen. Wenn die Temperaturen es nicht zulassen, in einer handgeliebten Hand mit der Kappe für 15 min geöffnet inkubieren.
    9. Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Separator. Fügen Sie 50 l Elutionspuffer hinzu und hängen Sie die Perlen erneut auf, indem Sie 1 min nach oben und unten pfeifen.
    10. Legen Sie das Rohr wieder in einen magnetischen Separator. Warten Sie 2 min, bevor Sie den Überstand übertragen, ohne die Perlen in eine separate Röhre zur DNA-Speicherung zu stören.
      HINWEIS: Hier kann das Experiment angehalten werden, bevor Es weitergeht. Die extrahierte DNA sollte auf Eis oder in einem Gefrierschrank von -20 °C gelagert werden.
  4. Anwendung des neu entwickelten LAMP-Assays
    1. Bereiten Sie den LAMP-Primer-Mix mit 0,2 m pro F3- und B3-Grundierung, 0,8 m pro Loop-F- und Loop-B-Primer und 1,6 m pro FIP- und BIP-Primer vor (Tabelle 2).
    2. Fügen Sie die folgende LAMP-Lösung zu einem einzelnen PCR-Rohr oder zu jedem einzelnen Rohr in der 8-Rohr-Streifen: 2,5 l Primer-Mix (Schritt 1.4.1), 12,5 l LAVA LAMP-Master-Mix, 1 l extrahierte DNA und 9 l ddH2O. Das Gesamtvolumen beträgt 25 L.
      HINWEIS: Wenn Sie das tragbare Verstärkungsinstrument (z. B. Genie III) mit farbmetrischem Farbstoff (z. B. Warmstart) verwenden, lesen Sie Abschnitt 2.4.2- 2.4.3.
    3. Bezeichnen Sie zwei Röhren als positive und negative Kontrollen. Verwenden Sie für die Positivkontrolle entweder eine Kontrolle des LAVA LAMP-Kits oder eine bekannte positive DNA-Probe. Verwenden Sie für die Negativkontrolle ddH2O. Bei beiden die extrahierte DNA mit 1 l durch 1 l der Positivkontrolle oder ddH2O ersetzen.
    4. Stellen Sie die Proben in einen Wärmeblock (oder ein tragbares Verstärkergerät) ein, das für 45 min auf 64 °C eingestellt ist.
      HINWEIS: Anstelle der magnetischen Perlenextraktion können hier andere Extraktionsmethoden verwendet werden. CTAB und ein kommerzielles DNA-Extraktionskit wurden beide erfolgreich mit den Standardprotokollen getestet und ersetzten die Filterpapierstücke für die Pflanzenprobe24,25. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 2verglichen. Wenn die Konzentration der DNA quantifiziert werden kann, verwenden Sie zwischen 1-10 ng genomische DNA.
  5. Visualisierung der Ergebnisse
    1. Wenn sie in einer Laborumgebung durchgeführt werden, betrachten Sie die Amplifikationsprodukte, indem Sie 5 l jeder Probe in ein 1% Agarose-Gel laden, sie in einer Gelelektrophoresemaschine laufen lassen und sie in einer UV-Bildgebungsmaschine ausbilden.
    2. Wenn ein farbmetrischer Farbstoff (z. B. Warmstart) verwendet wurde, zeigen Sie die Farbänderung an, um die Ergebnisse als positiv oder negativ zu bestimmen.
    3. Wenn ein tragbares Verstärkungsinstrument (z. B. Genie III) verwendet wurde, zeigen Sie das Amplifikationsdiagramm auf dem Bildschirm an, um die Ergebnisse zu bestimmen.
  6. Anwendung von zuvor entwickeltem PCR-Assay
    HINWEIS: Bei Verwendung eines herkömmlichen PCR-Assays bleiben die Schritte 1-3 gleich, und die folgenden Schritte sollten anstelle der Schritte 1.4 und 1.5 angewendet werden.
    1. Fügen Sie einzelnen Röhrchen, die die folgenden Komponenten enthalten, 1 l von jeder DNA-Extraktion hinzu: 12,5 l grünen PCR-Master-Mix, 9,5 l ddH2O und 1 l Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Tabelle 2).
    2. Drehen Sie jede Probe mit einer Mikrozentrifuge aus und legen Sie Dier in einen thermischen Cycler.
    3. Verwenden Sie die folgenden thermischen Cycler-Einstellungen gemäß den vorherigen Veröffentlichungen: 94 °C für 5 min, 30 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 30 s, Glühen bei 54 °C für 30 s, Verlängerung bei 72 °C für 1 min und Endverlängerung bei 72 °C für 10 min.
    4. Führen Sie das Produkt in einem 1% Agarose Gel. Beobachten Sie das Vorhandensein von Bändern unter UV-Licht, wo positive Reaktionen eine Bandgröße von 508 bp haben.
  7. Traditionelle Erkennungsmethode
    HINWEIS: Es gibt mehrere Methoden der selektiven Beschichtung für den Nachweis von Krankheitserregern, und das folgende ist ein allgemeines Protokoll für P. capsici.
    1. Zuerst erhalten Sie eine gesunde Auberginenfrucht (ein anfälliger Wirt für P. capsici)und Oberflächensterilisieren durch Waschen der Fruchtoberfläche mit 70% Isopropylalkohol.
    2. Die Auberginenfrüchte mit einer Flotationsvorrichtung (Polyethylenschaum oder andere) in Milchkisten geben und in Bewässerungsteichen einsetzen. Sichern Sie jede Köderfalle bis zu einem einzigen Punkt und lassen Sie die Fallen im Wasserreservoir (recyceltes Bewässerungswasser) für mindestens 7 Tage oder bis Fruchtfäule Symptome beobachtet werden. Sammeln Sie die Früchte und transportieren Sie sie ins Labor.
    3. Spülen und trocknen Sie die Frucht in einer sterilen Haube, bevor Sie kleine Stücke infizierten Gewebes entfernen, und legen Sie sie auf eine Platte parPH-Medium, die mit 25 mg/L Pentachlornitrobenzol, 0,0005% Pimaricin, 250 mg/L Ampicillin, 10 mg/L Rifampicin und 50 mg/L Hymexazol geändert wurde. Teller 5 Tage lang bei 25 °C inkubieren.
    4. Zeigen Sie Platten unter einem zusammengesetzten Mikroskop zur traditionellen morphologischen Identifizierung 4 Tage nach der Isolierung.

2. Bestimmung der Nachweisgrenze der Zoosporenkonzentration

  1. Zoospore Suspension machen
    1. Inkubieren P. capsici auf V8 Agar (100 ml V8 Saft, 900 ml ddH2O, 1 g CaCO3) Platten für 1 Woche bei 26 °C. Mehrere Platten können verwendet werden, um eine größere Menge an Zoosporensuspension zu erhalten.
    2. Inkubieren Sie die Platten unter kontinuierlichem Licht bei Raumtemperatur für 3 Tage, um die Sporulation zu stimulieren.
    3. Überfluten Sie die Platten, indem Sie 15 ml ddH2O zu jeder Platte hinzufügen und 25 min in einen 4 °C-Kühlschrank stellen. Dann kehren Sie auf Raumtemperatur für 30 min.
    4. Agitieren Sie Platten, um Zoosporen zu vertreiben und pipette die Lösung in einem einzigen 50 ml Rohr von allen Platten.
    5. Um eine genaue Schätzung der Zoosporenkonzentration zu erhalten, fügen Sie 10 l der Sporensuspension auf ein Hämozytometer ein und beobachten Sie unter dem Mikroskop, um Zoosporen zu zählen und die durchschnittliche Konzentration zu schätzen.
  2. Serielle Verdünnung
    1. 1 ml der Sporenaufhängung und 9 ml ddH2O in ein separates Rohr geben. Wiederholen Sie diesen Schritt für so viele 10-fache Verdünnungen wie gewünscht.
    2. Sporenlösungen werden dann zur DNA-Extraktion auf der Grundlage des vorherigen Protokolls mit der Filtrationsmethode eingereicht.
      HINWEIS: Wenn ein größeres Volumen der Suspension gewünscht wird, verdoppeln Sie das Volumen: 2 ml Sporenaufhängung und 18 ml ddH2O.
  3. Nachweis des Konzentrationsgrenzwerts für Zoosporen
    1. Bewerten Sie die Sporendetektionsgrenze, indem Sie jede serielle Verdünnung einzeln durch den Test ausführen, bis eindeutig positive Ergebnisse nicht mehr beobachtet werden. Sobald die endgültige Verdünnung erreicht ist, um den Faktor 2 (4,8 bis 2,4 in diesem Beispiel) verdünnen und den Testvorgang erneut ausführen, um eine genauere Nachweisgrenze zu erhalten.
  4. Entwicklung und Optimierung der LAMP-Methode
    HINWEIS: DIE LAMP-Primer wurden auf der Grundlage eines 1121-Basenpaars (bp) fragmentierter P. capsici (Li et al.19) entworfen, wie in Der Ergänzenden Abbildung 2dargestellt.
    1. Wenn farbmetrischer Farbstoff (z. B. Warmstart) verwendet wird, verwenden Sie die folgende Lösung: 2,5 l Grundierungsmischung, 12,5 l kolorimetrischen Farbstoffs, 0,5 l grünen Fluoreszenzfarbstoff, 1 ,L extrahierte DNA und 8,5 l ddH2O. Das Gesamtvolumen beträgt 25 L.
    2. Wenn Sie das tragbare Verstärkungsinstrument mit LAVALAMP Mastermix verwenden, haben Sie einen ersten Schritt von 95 °C für 3 min, wie vom Hersteller empfohlen, aber dies ist nicht erforderlich. Ein letzter Glühschritt ist nicht erforderlich, um den Farbwechsel oder die Verstärkungsgraphie zu beobachten. Führen Sie keinen Warmstartschritt aus, wenn der kommerzielle farbmetrische Farbstoff verwendet werden soll.
    3. View LAMP Assay ergebnisse in einer der folgenden Methoden: führen Sie Proben auf einem 1% Agarose Gel oder sehen Sie mit einer UV-Bildgebungsmaschine mit dem bloßen Auge oder Blick auf den Genie III Echtzeit-Amplifikationsbildschirm.
    4. Optimieren Sie die Temperatur des LAMP-Assays mit dem tragbaren Verstärkungsinstrument und analysieren Sie mit dem Echtzeit-Amplifikationsdiagramm auf Geschwindigkeit und Empfindlichkeit. Führen Sie Proben mit einzigartigen Temperaturen durch, um die schnellste Verstärkung mit höchster Empfindlichkeit zu bestimmen.
    5. Bestimmen Sie die Nachweisgrenze des entwickelten LAMP-Tests, indem Sie eine serielle Verdünnung der extrahierten DNA (wie bei Sporensuspension in Schritt 2.2.1) und die Aufrechterhaltung der Reaktionsbedingungen, wie zuvor für die LAMP-Reaktion für jede Verdünnung beschrieben, festlegen.
  5. Bestimmung und Vergleich der Nachweisgrenze mit konventioneller PCR-Methode
    1. Verwenden Sie DNA, die in Schritten in Abschnitt 1.3 extrahiert wurde, um den Nachweisgrad konventioneller PCR mit dem des LAMP-Assays zu vergleichen.
    2. Fügen Sie einer PCR-Röhre, die sowohl Vorwärts- als auch Rückwärts-PCR-Primer (Tabelle 2),12,5 l grünen PCR-Mastermix und 9,5 l ddH 2 O für insgesamt 25 L enthalten, 1 l DNA hinzu und 9,5 l ddH2O.
    3. Proben in einem thermischen Cycler unter folgenden Bedingungen verstärken: 94 °C für 5 min, 30 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 30 s, Glühen bei 54 °C für 30 s, Verlängerung bei 72 °C für 1 min und Endverlängerung bei 72 °C für 10 min.
    4. Führen Sie Proben in einer Elektrophoresemaschine auf einem 1% Agarose-Gel und sehen Sie sich eine UV-Bildgebungsmaschine an. Die ausgenommene Bandgröße betrug 508 bp.

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Ergebnisse

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Optimierung der LAMP-Methode
In dieser Studie haben wir das Vorhandensein von Phytophthora capsici im Bewässerungswasser mit einem tragbaren, schleifenvermittelten isothermen Amplifikationstest (LAMP) festgestellt. Zunächst wurde der vorgeschlagene LAMP-Test durch die Prüfung verschiedener LAMP-Primerkonzentrationen optimiert [F3, B3 (jeweils 0,1–0,5 m); LF, LB (je 0,5–1,0 M) und FIP, BIP (je 0,8–2,4 M)], Dauern (30–70 min) und Temperaturen (55–70 °C). Der letzte LAMP-Primer-Mix, der in diese...

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Diskussion

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Die Prüfung von Bewässerungswasser auf Phytopathogene ist ein entscheidender Schritt für Züchter, die Bewässerungsteiche und recyceltes Wasser verwenden27. Bewässerungsteiche bieten ein Reservoir und Brutplatz für eine Reihe von Phytopathogenen, da überschüssiges Bewässerungswasser vom Feld zum Teich geleitet wird, der alle Krankheitserreger mit sich führt, die möglicherweise vorhanden waren16,27. Die traditionelle Methode zum Nachweis von...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten oder Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Diese Arbeit erhielt die finanzielle Unterstützung der Georgia Commodity Commission for Vegetables Projekt ID- FP00016659. Die Autoren danken Dr. Pingsheng Ji, University of Georgia und Dr. Anne Dorrance, Ohio State University für die Bereitstellung reiner Kulturen von Phytophthora spp. Wir danken auch Li Wang und Deloris Veney für ihre technische Unterstützung während der gesamten Studie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agarose-GelpulverThomas ScientificC997J85
Buchner-TrichterSouthern LabwareJBF003
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Centrifuge 5430Eppendorf22620509
ChloroformFischer ScientificC298-500
CTAB-LösungBiowissenschaften786-565
Dneasy ExtraktionskitQiagen69104
FilterflascheUnitedFHFL1000
FilterpapierUnited Scientific SuppliesFPR009
Gel Grün 10000XThomas ScientificB003B68 (1/EA)
Genie IIIOptiGene
HandpumpeThomas Scientific1163B06
Iso-AmylalkoholFischer ScientificBP1150-500
LAVA LAMP MastermixLucigen30086-1
Magnetbead-DNA-ExtraktionGenesiggenesigEASY-EK
PolyvinylpyrrolidonSigma AldrichPVP40-500G
PrimerSigma Aldrich
Prism Mini CentrifugeLabnetC1801
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
UV Gel DocAnalytik Jena849-00502-2
Warmstart Colorimetric DyeLucigenE1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT CellBio-Rad1704489EDU
70% IsopropanolFischer ScientificA451-1
Magnetseparator Genesig genesigEASY-MR

Referenzen

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