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Methodenartikel

Ein Ex-vivo-Assay zur Untersuchung von Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt

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⸱

DOI:

10.3791/61488

⸱

1. Juli 2020

 ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Midwestern University, 2Masters in Biomedical Science Program, College of Graduate Studies, Midwestern University, 3Department of Pathology and Population Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der in dieser Studie beschriebene Ex-vivo-Assay mit Darmhomogenat-Extrakten und Immunfluoreszenzfärbung stellt eine neuartige Methode dar, um die Hypahypomorphogenese von Candida albicans im GI-Trakt zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Umweltsignale zu untersuchen, die den morphogenetischen Übergang im Darm regulieren.

Zusammenfassung

Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt (GI) wird durch verschiedene Umweltsignale streng kontrolliert und spielt eine wichtige Rolle bei der Verbreitung und Pathogenese dieses opportunistischen Pilzerregers. Allerdings sind Methoden zur Visualisierung von Pilzhyphen im GI-Trakt in vivo eine Herausforderung, die das Verständnis von Umweltsignalen bei der Steuerung dieses Morphogenese-Prozesses einschränkt. Das hier beschriebene Protokoll zeigt eine neuartige ex vivo Methode zur Visualisierung der Hyphalmorphogenese in Darmhomogenatextrakten. Anhand eines Ex-vivo-Assays zeigt diese Studie, dass cecal-Gehalte von antibiotikabehandelten Mäusen, aber nicht von unbehandelten Kontrollmäusen, C. albicans Hyphalmorphogenese im Darmgehalt fördern. Darüber hinaus reguliert das Hinzufügen spezifischer Gruppen von Darmmetaboliten zu den Cecal-Inhalten von antibiotikabehandelten Mäusen die Hyphenmorphogenese ex vivo. Zusammengenommen stellt dieses Protokoll eine neuartige Methode dar, um die Umweltsignale zu identifizieren und zu untersuchen, die die Hyphalmorphogenese von C. albicans im GI-Trakt steuern.

Einleitung

Candida albicans ist ein opportunistischer, polymorpher Pilzerreger, der normalerweise commensal ist, aber eine morphologische Veränderung in eine virulente Form durchmachen kann, die lebensbedrohliche Infektionen bei immungeschwächten Individuen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13verursachen kann. C. albicans ist eine der Hauptursachen für systemische nosokomiale Infektionen, mit einer Sterblichkeitsrate von 40-u201260% auch bei antimykogaler Behandlung2,14,15. Obwohl C. albicans in verschiedenen Wirtsnischen einschließlich des weiblichen Fortpflanzungssystems16,17, die Mundhöhle von gesunden Personen18 und der Magen-Darm-Trakt19,20, die Mehrheit der systemischen Infektionen stammen aus dem GI-Trakt und darüber hinaus, die Quelle der systemischen Infektion wird oft bestätigt, um die GI-Trakt21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. Albicans Pathogenität im GI-Trakt wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst; Ein wesentliches Merkmal, das für die Virulenz notwendig ist, ist jedoch der Übergang von einer Hefezellmorphologie zu einer virulenten Hypothekzellmorphologie35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. Albicans Anhaftung und Verbreitung aus dem GI-Trakt während der Infektion ist stark mit seiner Fähigkeit verbunden, von einer kommensalen Hefe in virulenten Hyphen zu übergehen, so dass die Pilze invasive Krankheitverursachen 44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.

Eine Vielzahl von Faktoren im Darm, einschließlich n-Acetylglucosamin, regulieren Hyphalbildung durch C. albicans. Daher ist es entscheidend, die Wissenslücke über die Hyphalmorphogenese dieses Pilzerregers im GI-Trakt54,55,56zu verringern. Jüngste Hinweise deuten darauf hin, dass verschiedene Darmmetaboliten die Hyphalmorphogenese von C. albicans in vitro57,58,59,60differenziell steuern. Jedoch, technische Zwänge stellen Probleme bei dem Versuch, C. albicans Hyphen Bildung in in vivo Darmproben zu studieren, insbesondere Färbung Hefe und Hyphenzellen und quantitative Analyse der Hyphal-Entwicklung. Um die Hyphalmorphogenese von C. albicans im GI-Trakt zu verstehen, wurde eine Ex-vivo-Methode entwickelt, bei der lösliche Extrakte mit homogenisiertem Darmgehalt von Mäusen verwendet wurden, um die Wirkung von Metaboliten auf die Pilzhyptohypomorphogenese zu untersuchen. Mit Hilfe von Darmproben von Mäusen, die resistent und anfällig für C. albicans GI-Infektion sind, wird diese Methode helfen, die Wirkung von Metaboliten, Antibiotika und Xenobiotika auf Pilzhyptohypomorphogenese im GI-Trakt zu identifizieren und zu studieren.

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Protokoll

Alle Tierprotokolle wurden vom Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) wie vor57beschrieben genehmigt. Der Institutional Animal Care and Use Committee der Midwestern University genehmigte diese Studie im Rahmen des MWU IACUC Protocol #2894. Die MWU-Tierpflegerichtlinien folgen der Politik des öffentlichen Gesundheitsdienstes (PHS) zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien des Tierschutzgesetzes (AWA).

1. Mäuse studieren Standardprotokoll

  1. Verwenden Sie männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse, die mindestens sechs Wochen alt sind. Ergänzen Sie sie mit sterilem Wasser mit oder ohne Cefoperazone (0,5 mg/ml).
    1. Co-Haus Mäuse in Gruppen von 5, mit jedem Käfig enthält entweder alle männlichen oder alle weiblichen Mäuse. Stellen Sie die Mäuse Standard Maus Chow und Wasser (über eine 400 ml Flasche) zu jeder Zeit.
    2. Überprüfen Sie täglich Käfige, um sicherzustellen, dass Nahrung und Wasserstände ausreichen, und um Mäuse auf Anzeichen von Not zu untersuchen.
  2. Ersetzen Sie das Wasser alle 48 h durch Cefoperazone, um sicherzustellen, dass frisches Antibiotikum unabhängig vom verbleibenden Wasser in den Käfig-Fütterungsflaschen zur Verfügung gestellt wird.
  3. Nach 5-u20127 Tagen Cefoperazone-Behandlung, einschläfern Mäuse über CO 2-Erstickung unter Einhaltung etablierter IACUC-Protokoll. Bestätigen Sie den Tod durch zervikale Dislokation.
  4. Sezieren Sie Mäuse mit autoklav-sterilisierten scharfen Enden und autoklav-sterilisierten Zangen.
    1. Nach der Euthanasie, sichern Sie das Tier an einer Sezierfläche, indem Sie alle Gliedmaßen so festsetzen, dass der Bauch freigelegt wird.
    2. Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell während der Zerlegung an Zangen, Scheren oder Darmabschnitten klebt.
    3. Verwenden Sie Zangen, um einen Teil der Haut an der Unterbasis des Bauches zu kneifen und zu heben und einen kleinen Schnitt durch die Haut und die darunter liegende Faszie mit einer Schere zu erstellen. Achten Sie bei diesem Schnitt sehr darauf, das Cecum oder die Darmwand nicht zu durchkreuzen.
    4. Erweitern Sie diesen Schnitt auf den Rippenkäfig, wodurch die Peritonealhöhle teilweise freigelegt wird. Machen Sie einen Schnitt, der an der Stelle des anfänglichen Einschnitts auf beiden Seiten beginnt, der sich nach oben und seitlich erstreckt.
    5. Ziehen Sie diese Klappen seitlich und heften Sie sich an die Sezierender Fläche, um die Peritonealhöhle vollständig freizulegen.
  5. Extrahieren Sie den GI-Trakt mit Zangen, während mit Schere, um Schnitte besser als der Magen und an der distalen Bereich des Dickdarms zu machen, um die Sammlung der größten Menge an Darmgehalt aus jedem Abschnitt zu gewährleisten.
  6. Achten Sie beim Entfernen des GI-Trakts darauf, dass die einzelnen Komponenten nicht zerbrechen. Trennen Sie Magen, Dünndarm, Cecum und Dickdarm einzeln mit einer Schere an ihren proximalen und distalen Enden.
  7. Für die Erfassung jedes Darminhalts aus jedem Abschnitt, machen Sie einen einzigen Schnitt am distalen Ende jedes Abschnitts mit einer Schere, gefolgt von manuellen Ausstoß des Darmgehalts in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Zangen.
  8. Gutinhalt bei -80 °C für Ex-vivo-Assays lagern.

2. Herstellung von Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Agarplatten

  1. Zu einer 1 L Glasflasche 25 g Hefeextrakt Pepton-Dextrose-Brühepulver, 10 g Agar und Reinstwasser auf ein Endvolumen von 500 ml geben.
  2. Autoklav bei 121 °C für 30 min auf einem flüssigkeitszyklischen Zyklus, um die Medien zu sterilisieren.
  3. Unter einer laminaren Strömungshaube ca. 20 ml Agarmedien in eine sterile Petriplatte gießen. 500 ml Agarmedien sollten etwa 25 Platten ergeben.
  4. Platten bei 4 °C lagern, bis sie einsatzbereit sind.

3. Ex-vivo-Vorbereitung für Hyphal-Morphogenese-Assay

  1. Eine frische Kultur von C. albicans SC5314 auf eine YPD-Agarplatte geben und über Nacht bei 30 °C brüten.
  2. Wählen Sie zwei bis drei mittelgroße Einzelkolonien aus der über Nacht angebauten C. albicans SC5314 Kultur und setzen Sie in 1 ml Phosphat gepufferter Saline (PBS) wieder aus.
  3. Gefrorenen Darminhalt aus dem Gefrierschrank von -80 °C holen und bei 25 °C auftauen.
  4. Wiegen Sie etwa 150 mg Darminhalt in ein neues 1,5 ml Rohr.
  5. Unterbrechen Sie den Darminhalt mit 150 l PBS (Darmgehalt und PBS bei einem Gewichts-Volumen-Volumen-Verhältnis von 1:1).
  6. Wirbel mit hoher Geschwindigkeit für 30 s, um den Darminhalt zu homogenisieren und bei Raumtemperatur für etwa eine Minute sitzen zu lassen.
  7. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 1000 x g für 3 min.
  8. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 3.7 und 3.8, um alle Trümmer im Überstand zu entfernen.
  10. Fügen Sie 10 L des C. albicans SC5314 inoculum oben zu diesem Überstand vorbereitet
  11. Gut mischen und bei 37 °C für 4 bis 5 h inkubieren.

4. Exogene Zugabe von Metaboliten zu den Darmhomogenat-Extrakten für den Hyphal-Morphogenese-Assay

  1. Erhalten Sie gefrorenen Darminhalt aus dem -80 °C Gefrierschrank und wieder in PBS im Verhältnis 1:1 (Gewicht: Volumen).
  2. Fügen Sie die gewünschte Konzentration von Darmmetaboliten zum Darmgehalt und PBS-Mischung hinzu.
  3. Wirbel mit hoher Geschwindigkeit für 30 s, um den Darminhalt mit Metaboliten zu homogenisieren und bei Raumtemperatur für ca. 10 min sitzen zu lassen.
  4. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 1000 x g für 3 min.
  5. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 und 4.5, um alle Trümmer im Überstand zu entfernen.
  6. Fügen Sie diesem Überstand 10 L des C. albicans SC5314 inoculum hinzu. Gut mischen und bei 37 °C für 4 bis 5 h inkubieren.

5. C. Albicans Morphogenese-Assay (Immunostaining und Imaging)

  1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1000 x g für 2 min und entsorgen Sie den Überstand über Pipettierung.
  2. Fixieren Sie die Proben in 100 l mit 2% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min.
  3. Zentrifugieren bei 1000 x g für 2 min und entsorgen Überstand über Pipettierung.
  4. Waschen Sie die Proben zweimal mit 1 ml PBS. Um Proben zu waschen, setzen Sie das Pellet in PBS wieder auf, indem Sie sanft pfeifen. Wirbeln Sie die Probe nicht, da dies Hyphenstrukturen beschädigen kann. Nach wiederaufhängung bei 1000 x g für 2 min zentrieren und den Überstand über Pipettierung entsorgen.
  5. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur in 100 l PBS, die polyklonale C. Albican-Antikörper (1:100 Verdünnung) für 30 min enthalten.
  6. Waschen Sie die Proben dreimal mit 1 ml PBS.
    HINWEIS: Bei Verwendung eines fluoreszierenden Antikörpers wird empfohlen, alle Verdünnungs- und Waschschritte bei leichtem Licht durchzuführen, um Photobleichungen zu vermeiden und die Lebensdauer der Probe zu verbessern.
  7. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 15 min in 100 l PBS, die Anti-Rabbit IgG Alexafluor 488 Antikörper bei 1:500 Verdünnung enthalten. Führen Sie eine Inkubation in einer dunklen Schublade oder einem Raum durch, um Fotobleichen zu vermeiden.
  8. Waschen Sie die Proben dreimal mit 1 ml PBS.
  9. Setzen Sie die Proben in 100 l PBS wieder auf und übertragen Sie sie zur Bildgebung auf eine 96-Well-Platte.
    HINWEIS: Wenn nicht abgebildet, wird empfohlen, dass die 96-Well-Platte in Aluminiumfolie eingewickelt werden, um Fotobleichungen zu vermeiden.
  10. Bildpilzzellen mit 20x- und 40x-Objektivlinsen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsmikroskop. Verwenden Sie einen grünen Fluoreszenz-Protein-Filter (GFP) (Erregungswellenlänge 470/40 und Emissionswellenlänge 525/50), um Fluoreszenz zu erkennen.

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Ergebnisse

Diese Ergebnisse zusammen mit früheren Erkenntnissen aus dem Thangamani-Labor60 deuten darauf hin, dass, wenn C. albicans ex vivo in Darmhomogenat-Extrakten aus dem Magen, Dünndarm und Dickdarm von unbehandelten Kontroll- und antibiotikabehandelten Mäusen angebaut wird, C. albicans in der Regel mit einer Hefemorphologie entwickelt (Abbildung 1B). Wenn jedoch im Cecal-Extrakt von antibiotikabehandelten Mäusen angebaut, erfährt C. albicans lei...

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Diskussion

Die hier beschriebene Methode stellt eine neue Methode dar, um die Wirkung von antibiotika-, diätetischen, xenobiotischen und therapeutischen Auswirkungen auf die Hypahypomorphese von C. albicans im GI-Trakt zu untersuchen. Da die Mehrheit der systemischen Infektionen aus dem GI-Traktstammen 21,22,23,24,25,26,

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren würdigen Ressourcen und Unterstützung von Midwestern University Cellular and Molecular Core Research Facility.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 - 10 &Mikro; L PipettenspitzenFisher Scientific02-707-454Sonstiges
100 - 1000 & Mikro; L PipettenspitzenFisher Scientific02-707-400Sonstiges
20 - 200 & Mikro; L PipettenspitzenFisher Scientific02-707-451Sonstiges
2-MethylbuttersäureSigma193070-25Ghyphal-inhibitorische Verbindung
488 Anti-Kaninchen-IgGInvitrogen (Fisher)A11008IF Färbung sekundär ab
AgarFisherBP1423-500YPD-Agar-Komponente
Automatisiertes bildgebendes MikroskopKeyenceBZX700
Candida Albicans AntikörperInvitrogen (Fisher)PA1-27158IF Färbung primär ab
CefoperazonCayman16113Antibiotikum
DesoxycholsäureSigma30960hyphalhemmende Verbindung
D-GlucoseFisherD16-500Hyphen-fördernde
Verbindung PinzetteFisher08-885
MilchsäureAlfa AesarAAAL13242-06Hyphenhemmung
LithocholsäureSigmaL6250-10GHyphenhemmung
PalmitinsäureSigmaP5585-10GHyphenhemmung Verbindung
ParaformaldehydAlfa AesarA11313IF Färbefixiermittel
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10xAlfa AesarJ62692PBS-Komponente
p-TolylessigsäureSCBTsc-257959hyphenhemmende Verbindung
SebacinsäureSigma283258-250Ghyphalhemmende Verbindung
scharfem EndeSchere Fisher28301
steriles Milli-Q WasserN/AN/AMisc
YPD BouillonBD Biosciences242810YPD-Agar-Komponente
mit

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