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Methodenartikel

Ein vom Patienten abgeleitetes Xenograft-Modell für Venöse Fehlbildungen

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DOI:

10.3791/61501

⸱

15. Juni 2020

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll, um ein murines Xenograft-Modell der venösen Fehlbildung zu erzeugen. Dieses Modell basiert auf der subkutanen Injektion von vom Patienten abgeleiteten Endothelzellen, die hyperaktivierende TIE2- und/oder PIK3CA-Genmutationen enthalten. Xenograft-Läsionen rekapitulieren die histopathologischen Merkmale des VM-Patientengewebes.

Zusammenfassung

Venöse Fehlbildung (VM) ist eine vaskuläre Anomalie, die durch eine beeinträchtigte Entwicklung des venösen Netzwerks entsteht, was zu erweiterten und oft dysfunktionalen Venen führt. Der Zweck dieses Artikels ist es, sorgfältig die Etablierung eines murinen Xenograft-Modells zu beschreiben, das menschliche VM imitiert und in der Lage ist, die Heterogenität der Patienten widerzuspiegeln. Hyperaktivierende nicht vererbte (somatische) TEK (TIE2) und PIK3CA-Mutationen in Endothelzellen (EC) wurden als Haupttreiber der pathologischen Gefäßvergrößerung in DER VM identifiziert. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung, Reinigung und Erweiterung von patientenabgeleiteten EC-Exzessen mutierten TIE2 und/oder PIK3CA. Diese EC werden subkutan in den Rücken immundefizien athymischer Mäuse injiziert, um ektetische Gefäßkanäle zu erzeugen. Mit TIE2 oder PIK3CA-mutiertem EC erzeugte Läsionen werden innerhalb von 7-u20129 Tagen nach der Injektion sichtbar vaskularisiert und rekapitulieren histopathologische Merkmale des VM-Patientengewebes. Dieses VM-Xenograft-Modell bietet eine zuverlässige Plattform, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die VM-Bildung und -Erweiterung vorantreiben. Darüber hinaus wird dieses Modell für translationale Studien, die die Wirksamkeit neuartiger Wirkstoffkandidaten testen, bei der Verhinderung der abnormalen Gefäßvergrößerung bei menschlichen VMs von entscheidender Bedeutung sein.

Einleitung

Defekte in der Entwicklung der Vaskulatur sind die zugrunde liegende Ursache für viele Krankheiten, einschließlich venöser Fehlbildung (VM). VM ist eine angeborene Krankheit, die durch abnormale Morphogenese und Ausdehnung derVenen1 gekennzeichnet ist. Wichtige Studien an VM-Gewebe und Endothelzellen (EC) haben Funktionsverstärkungsmutationen in zwei Genen identifiziert: TEK, das den Tyrosinkinase-Rezeptor TIE2 kodiert, und PIK3CA, das die isoform p110(katalytische Subunit) der PI3-Kinase (PI3K)2,3,4,5kodiert. Diese somatischen Mutationen führen zu einer ligaandunabhängigen Hyperaktivierung wichtiger angiogener/wachstumssignaler Wege, einschließlich PI3K/AKT, was zu erweiterten ektatischen Venenführt 3. Trotz dieser wichtigen genetischen Entdeckungen sind die nachfolgenden zellulären und molekularen Mechanismen, die eine abnormale Angiogenese auslösen, und die Bildung vergrößerter Gefäßkanäle noch immer nicht vollständig verstanden.

Während der normalen und pathologischen Angiogenese sprießen neue Gefäße aus einem bereits bestehenden Gefäßnetz und EC durchlaufen eine Abfolge wichtiger zellulärer Prozesse, einschließlich Proliferation, Migration, extrazelluläre Matrix (ECM) Remodellierung und Lumenbildung6. Zwei- und dreidimensionale (2D/3D) In-vitro-Kulturen der EG sind wichtige Werkzeuge, um jede dieser zellulären Eigenschaften einzeln zu untersuchen. Dennoch besteht die klare Forderung nach einem Mausmodell, das die pathologische Gefäßvergrößerung innerhalb der Wirtsmikroumgebung rekapituliert und gleichzeitig eine effiziente Plattform für die präklinische Bewertung gezielter Medikamente für die translationale Forschung bietet.

Bis heute wurde kein transgenes murines VM-Modell im Zusammenhang mit TIE2-Funktionsverstärkungsmutationen berichtet. Aktuelle transgene VM-Mausmodelle basieren auf der allgegenwärtigen oder gewebebeschränkten Expression der aktivierenden Mutation PIK3CA p.H1047R3,5. Diese transgenen Tiere geben signifikante Einblicke in die ganzkörper- oder gewebespezifischen Wirkungen dieser Hotspot-PIK3CA-Mutation. Die Einschränkung dieser Modelle ist die Bildung eines hochpathologischen Gefäßnetzes, das zu einer frühen Letalität führt. Daher spiegeln diese Mausmodelle das sporadische Auftreten von Mutationsereignissen und die lokalisierte Natur der VM-Pathologie nicht vollständig wider.

Im Gegenteil, patientenabgeleitete Xenograft-Modelle basieren auf der Transplantation oder Injektion von pathologischem Gewebe oder Zellen, die von Patienten in immundefizienten Mäusen abgeleitet wurden7. Xenograft-Modelle sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Wissen über die Krankheitsentwicklung und die Entdeckung neuer therapeutischer Wirkstoffe zu erweitern8. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Patienten-abgeleiteten Zellen Wissenschaftlern, die Heterogenität der Mutation zu rekapitulieren, um das Spektrum der Phänotypen von Patienten zu untersuchen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, in dem patientenabgeleitete VM EC, die eine mutierte konstitutiv-aktive Form von TIE2 und/oder PIK3CA ausdrücken, subkutan in den Rücken athymischer Nacktmäuse injiziert werden. Injizierte Gefäßzellen werden in einem ECM-Rahmen suspendiert, um die Angiogenese zu fördern, wie in früheren vaskulären Xenograft-Modellen9,10,11beschrieben. Diese VM EC durchlaufen eine signifikante Morphogenese und erzeugen vergrößerte, durchfundierte pathologische Gefäße, wenn keine unterstützenden Zellen zur Unterstützung von Zellen zur Welt kommen. Das beschriebene Xenograft-Modell von VM bietet eine effiziente Plattform für die präklinische Bewertung gezielter Medikamente für ihre Fähigkeit, die unkontrollierte Lumenexpansion zu hemmen.

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Protokoll

Patientengewebeproben wurden von den Teilnehmern nach informierter Zustimmung der Sammlung und des Repositorys von Gewebeproben und Daten von Patienten mit Tumoren und Gefäßanomalien im Rahmen eines zugelassenen Institutional Review Board (IRB) gemäß institutional policies am Cincinnati Children es Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute und mit Genehmigung des Committee on Clinical Investigation erhalten. Alle nachstehend beschriebenen Tierverfahren wurden vom CCHMC Institutional Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt.

1. Herstellung von Materialien und Lagerlösungen

  1. Vorbereitung des kompletten Endothelzellwachstumsmediums (EGM)
    1. Ergänzung endotheliale Basalmedium (EBM) mit den folgenden Wachstumsfaktoren im Kit (siehe Materialtabelle):humanFibroblast Growth Factor-Beta (hFGF--) ), vaskulärer endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF), Long Arg3 Insulin-Like Growth Factor- I (R3-IGF-I), Ascorbinsäure, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Gentamycinsulfat und Ampericin Fügen Sie 1% Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin (PSG) Lösung und 20% fetales Rinderserum (FBS).
      HINWEIS: Wir empfehlen nicht, Hydrocortison hinzuzufügen.
    2. Sterile Filtern Sie die Lösung unter einer laminaren Strömungshaube durch einen 0,2 m-Flaschen-Top-Filter in eine autoklavierte Glasflasche und aliquot-Medien in 50 ml konische Schläuche und lagern sie bei 4 °C bis zu einer Woche oder bei -20 °C bis zu einem Jahr.
  2. Vorbereiten von Kollagennase Eine Stofflösung
    1. 50 mg/ml Kollagenase Eine Stammlösung in 1x Phosphatpuffer-Saline (PBS) vorbereiten.
    2. Sterile Filter die Lösung unter einer laminaren Durchflusshaube mit 0,2 m Filter und Spritze, und lagern Sie 100 L Aliquots bei -20 °C.
  3. Vorbereiten des Gewebesammelmediums (Puffer A)
    1. Bereiten Sie eine Ca2+/Mg2+ Stofflösung vor, indem Sie 0,927 g Calciumchloriddihydrat (CaCl2.2H2O) und 1 g Magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO4.7H2O) zu 500 ml destilliertem Wasser hinzufügen. Sterile Filter der Lösung durch einen 0,2 m Flaschen-Top-Filter in eine autoklavierte Glasflasche und lagern bei Raumtemperatur (RT).
    2. Ergänzen Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% Ca2+/Mg2+ Lösung und 2% FBS.
    3. Sterile Filter die Lösung unter einer laminaren Durchflusshaube mit 0,2 m Filter und Spritze und lagern Aliquots von 5 ml bei -20 °C.
  4. Fibronectin-Beschichtung von Gewebekulturplatten
    1. Bereiten Sie beschichtungspuffer (Puffer B) durch Auflösen von 5,3 g Natriumcarbonat (Na2CO3; 0,1 M) in 500 ml entionisiertem Wasser vor. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers mit 1 M Salzsäure (HCl) auf 9,4 ein. Filtern Sie unter einer laminaren Durchflusshaube durch einen 0,2 m-Flaschen-Top-Filter in eine autoklavierte Glasflasche und lagern Sie bei RT.
    2. Zur Beschichtung, Pipette 2 ml/5 ml/10 ml Puffer B pro 60 mm/100 mm/145 mm Gewebekulturplatte. Fügen Sie 1 g/cm2 der gereinigten Proteinlösung des menschlichen Plasmafibronectins hinzu und verteilen Sie die Flüssigkeit vorsichtig auf die Platte.
    3. Inkubationsplatte bei 37 °C, 5%CO2 für 20 min.
    4. Puffer B ansaugen und die Platte mit PBS waschen, bevor Zellen kultivieren.

2. Isolierung von Endothelzellen aus VM-Patientengewebe

  1. Isolierung der EG aus festem VM-Gewebe
    HINWEIS: VM-Gewebe wird durch Debulking-Operation12,13 im Rahmen eines VonIRB-zugelassenen Protokolls resektiert.
    1. Waschen Sie VM-Gewebe (Gewebeprobengewicht liegt in der Regel zwischen 0,5 g und 1,5 g) in 5% PSG in PBS.
    2. Übertragen Sie Gewebe in eine 100-mm-Zellkulturschale, Zerkleinern Sie Gewebeprobe in kleine Stücke mit sterilen chirurgischen Sezierwerkzeugen, und übertragen Sie in eine 50 ml konische Röhre.
    3. Fügen Sie 100 l Kollagennase Eine Stofflösung zu 5 ml Puffer A für eine Endkonzentration von 1 mg/ml hinzu, fügen Sie diese dann in das Gewebe ein und verdauen Sie das gehackte Gewebe bei 37 °C für 30 min, während der Inhalt alle 5 min schüttelt wird.
    4. Schleifen Sie das verdaute Gewebe bei RT vorsichtig mit einem 6 mm glatten Stößelschleifer innerhalb des 50 ml konischen Rohres.
    5. Weiter sorgfältig mahlen verdautes Gewebe mit einem Stößel, während 5 ml kalte PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2% PSG ergänzt. Wiederholen Sie diesen Schritt viermal.
    6. Filtern Sie die Lösung durch ein 100-m-Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr, um Gewebefragmente zu entfernen.
    7. Zentrifugenzellsuspension für 5 min bei 400 x g bei RT. Fahren Sie mit Schritt 2.3 fort.
  2. Isolierung von VM EC aus Lesionalblut aus Patientensklerotherapie
    1. Besorgen Sie sich menschliches VM-Lesionalblut aus der Sklerotherapie im Rahmen eines von IRB zugelassenen Protokolls.
    2. Verdünnt lesionales Blut (Probenvolumen liegt in der Regel zwischen 0,5 ml und 5 ml) in PBS bis zu einem Endvolumen von 40 ml.
    3. Zentrifugenzellsuspension für 5 min bei 200 x g bei RT.
  3. Anfängliche Zellbeschichtung
    1. Überstand entsorgen und das einzellige Pellet in 1 ml EGM wieder aussetzen.
    2. Fügen Sie 9 ml kompletteE EGM auf Fibronectin-beschichtet (1 g/cm2) 100 mm Platten und Samen 1 ml Zellsuspension.
    3. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten 5%CO2-Atmosphäre.
    4. Entfernen Sie jeden zweiten Tag 2 ml Medien und fügen Sie 2 ml steril gefilterte FBS hinzu.
    5. Sobald die Zellkulturen eine Konfluenz von 40 bis 201250% erreichen, ändern sich das Medium, um EGM zu vollenden. Es dauert in der Regel zwischen 2-u20123 Wochen für die Zellen, um diese Konfluenz zu erreichen.
    6. Beobachten Sie täglich das Aussehen von EG-Kolonien. Sie sind an ihrer typischen "kopfsteinsteinartigen" Morphologie zu erkennen (Abbildung 1A). Zwischen 3-u20125 ERSCHEINEN in jeder Stichprobe EG-Kolonien.
    7. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag für weitere 5-u20127 Tage, bis einzelne EG-Kolonien beginnen, sich gegenseitig zu berühren.
  4. Manuelle Isolierung einzelner EG-Kolonien
    1. Um EC-Kolonien zu ernten, waschen Sie den Teller mit 5 ml PBS und saugen Sie manuell mit einer serologischen Pipette.
    2. Nehmen Sie die Platte zu einem Mikroskop und kreisen Sie die Standorte mehrerer EG-Kolonien mit einem Markierungsstift sowohl auf Deckel als auch auf Boden, bevor Sie sie auf die laminare Strömungshaube zurückführen.
    3. Lösen Sie EC-Kolonien, indem Sie 50 l 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung auf die markierten Flächen pfeifen.
    4. Mit einem kleinen Zellschaber oder einer Pipettenspitze, vorsichtig kratzen Zellen von Platte.
    5. Neigen Sie die Platte auf den nächsten Rand, und spülen Sie sie mit 1 ml EGM pro markierter Fläche ab und sammeln Sie Zellen.
    6. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
    7. Die gesammelten EC-Kolonien mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen/cm2 auf fibronectinbeschichtete (1 g/cm2) Zellkulturgerichte mit frischem EGM.2 Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium, um EGM abzuschließen.
    8. Ändern Sie das Medium, um EGM jeden zweiten Tag für 2-u20123 Wochen zu vervollständigen, bis die Zellen 80% Konfluenz erreichen.
    9. Trypsinize EC mit 2 ml vorgewärmt0 0,05% Trypsin-EDTA pro 100 mm Schale bei 37 °C für 2 min und neutralisieren Trypsin durch Zugabe von 4 ml EGM.
    10. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ml konischen Rohr und Zentrifuge bei 400 x g bei RT für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in 2 ml EGM.
    11. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Typische Zellnummern sind 1 x 106 Zellen pro 60 mm Zellkulturplatte oder 2 x 106 Zellen pro 100 mm Gewebekulturplatte.
    12. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g bei RT für 5 min und aspirieren sie den Überstand. Fahren Sie mit Schritt 3.2.1 fort.

3. Endothelzellauswahl und -erweiterung

  1. Herstellung von Anti-CD31-konjugierten Magnetperlen
    1. Wirbel die Durchstechflasche mit den Anti-CD31-konjugierten Magnetperlen für 30 s. Die Anzahl der benötigten Perlen beträgt 8 x 106 Perlen/2 x 106 Zellen.
    2. Waschen Sie die gewünschte Menge anti-CD31-konjugierter Magnetperlen mit 1 ml Waschlösung, die 0,1% BSA in PBS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr enthält.
    3. Legen Sie das Mikrozentrifugenrohr 1 min in einen Zellisolationsmagneten.
    4. Aspirieren Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschschritt.
  2. Endothelzellreinigung und Beschichtung
    1. Resuspend Zellpellet in 2.4.12 in 500 l Waschlösung mit 0,1% BSA in PBS erhalten.
    2. Fügen Sie eine Zelllösung zu Mikrozentrifugenrohren hinzu, die magnetische Perlen enthalten, und setzen Sie sie gründlich wieder auf.
    3. 20 min bei 4 °C mit sanftem Kippen inkubieren.
    4. Fügen Sie 500 l von 0,1% BSA in PBS hinzu und mischen Sie gut.
    5. Legen Sie das Rohr 1 min auf einen Zellisolationsmagneten.
    6. Saugen Sie vorsichtig die gesamte Flüssigkeit an, die den CD31-negativen Zellanteil enthält, ohne die Perlen zu berühren.
    7. Waschen Sie das Perlenpellet, das die CD31-positive Zellfraktion enthält, mit 1 ml 0,1% BSA in PBS und wiederholen Sie die magnetische Trennung.
    8. Wiederholen Sie den Wasch- und magnetischen Trennschritt für mindestens 3 Mal, um die CD31-positive Zellfraktion zu reinigen.
    9. Gereinigte Endothelzellen in ein 15 ml konisches Rohr aussetzen und bei RT 5 min bei 400 x g nach unten drehen.
    10. Entfernen Sie Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml EGM wieder auf.
    11. Fügen Sie 9 ml kompletteE EGM auf Fibronectin-beschichtet (1 g/cm2) 100 mm Platten und Samen 1 ml Zellsuspension. Beachten Sie, dass einige magnetische Perlen noch an den Zellen in diesem ersten Seeding-Schritt befestigt sind. Die meisten Perlen waschen sich während der Zellexpansion weg, aber eine kleine Anzahl von Perlen kann in frühen Passagen bestehen bleiben.
    12. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten 5%CO2-Atmosphäre.
    13. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Zellen 80 % Konfluenz erreichen (Abbildung 1B).
  3. Endothelzellexpansion
    1. Sobald die Zellen 80 % Koninfluenza erreichen, lösen Sie sich mit 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA pro 100 mm Schale bei 37 °C für 2 min.
    2. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 4 ml EGM hinzufügen und Zellen in einem 15 ml konischen Rohr sammeln.
    3. Zentrifuge bei 400 x g bei RT für 5 min.
    4. Aspirieren Sie den Überstand, setzen Sie Zellen in 2 ml EGM wieder aus und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder durch automatisierte Zellzählung.
    5. Samenzellen mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen/cm2 in 145 mm fibronectinbeschichtete (1 g/cm2) Gewebekulturplatten.
    6. Fahren Sie mit der Durchreise von Zellen fort, bis die gewünschte Zellnummer erfüllt ist. Man bedenke, dass eine konfluente 145 mm Gewebekulturplatte etwa 8-u20129 x 106 Zellen enthält und die Anzahl der benötigten Zellen 2,5 x 106 Zellen pro Injektion beträgt. Für das Xenograft sollten nur Zellen zwischen Durchgang 3 und 8 berücksichtigt werden.

4. VM-Patienten-abgeleitetes Xenograft-Protokoll

HINWEIS: In diesem Protokoll verwenden wir 5-u20126 Woche alte, männliche immundefiziver, athymische nackte Foxn1nu Mäuse.

Alle tierischen Verfahren müssen vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung (IACUC) genehmigt werden.

  1. Herstellung der Materialien am Tag vor der Injektion
    1. Spritzen, Nadeln und Pipettenspitzen im Gefrierschrank von -20 °C über Nacht vorkühlen.
    2. Langsam die Kellermembran extrazelluläre Matrix (BMEM) über Nacht auf Eiskübel bei 4 °C auftauen, um eine erhöhte Viskosität des Gels zu vermeiden.
  2. Vorbereitung der Zellsuspension zur Injektion
    1. Trypsinize EC mit 5 ml vorgewärmt 0,05% Trypsin-EDTA pro 145 mm Schale bei 37 °C für 2 min.
    2. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 5 ml EGM hinzufügen und Zellen in einem 15 ml konischen Rohr sammeln.
    3. Zentrifuge bei 400 x g bei RT für 5 min.
    4. Aspirieren Sie den Überstand, setzen Sie Zellen in 3 ml EGM wieder aus, und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
    5. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen, die für alle geplanten Injektionen benötigt werden.
      HINWEIS: Die empfohlene Anzahl von Zellen beträgt 2,5 x 106 Zellen pro Injektion. Für technische Duplikate werden in der Regel 2 Injektionen in jeder Maus durchgeführt. Es ist notwendig, einen 10% Überschuss der Zellzahl zu berechnen, um den Verlust während der Übertragung in die Spritze zu berücksichtigen.
    6. Übertragen Sie das Volumen mit der berechneten Zellzahl in ein neues 50 ml konisches Rohr und Pelletzellen durch Zentrifugation bei 400 x g bei RT für 5 min.
    7. Aspirieren Sie den Überstand, so dass ein kleines Volumen (ca. 50,201270 L) das Pellet zu lösen.
  3. Spritzenzubereitung
    1. Berechnen Sie ein Übervolumen von 20 l/Injektion, um den Verlust während der Übertragung auf die Spritze zu berücksichtigen. Setzen Sie das Zellpellet mit 220 l BMEM pro Injektion auf Eis wieder auf. Das injizierte Volumen der Zellsuspension beträgt 200 l pro Läsion.
    2. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich auf Eis, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten und Blasen zu vermeiden.
    3. Mit einer 1 ml Pipette und 1 ml Spritze gleichzeitig Pipetten BMEM-Zell-Mischung in die Spritzenöffnung durch Saugkraft beim Ziehen Kolben der Spritze.
    4. Luer verriegeln Sie eine 26G x 5/8 Zoll sterile Nadel an der Spritze und halten vorbereitete Spritzen vor der Injektion flach auf Eis.
  4. Subkutane Injektion in die Maus
    1. Anästhetisieren Sie die Mäuse mit 5% Isofluran/Sauerstoff-Gemisch mit einer Durchflussrate von 1 l/min mit einem Isofluran-Verdampfer. Sicherstellen einer ordnungsgemäßen Sedierung der Tiere (z. B. Nichtreaktion auf Zehenkneifen). Halten Sie die Anästhesie durch kontinuierliche Verabreichung von 1,5% Isofluran/Sauerstoff, der über Nasenkegel zugeführt wird.
    2. Legen Sie Mäuse auf den Magen, setzen Sie den Rückenbereich frei, in dem die Transplantation stattfindet, und desinfizieren Sie die Injektionsregion mit 70 % Ethanol.
    3. Rollen Sie die vorbereitete Spritze vorsichtig, um alle abgesetzten Zellen wieder auszusetzen. Flick Blasen an das Nadelende der Spritze und vertreiben sie ein kleines Volumen der Zellsuspension, um die Entfernung aller Blasen zu gewährleisten.
      HINWEIS: Für jede Maus können zwei Injektionen durchgeführt werden – auf der linken und rechten Seite der Mausrückseite.
    4. Kneifen und erstellen Sie eine "zeltartige" Struktur mit Daumen und Zeigefinger und setzen Sie die Nadel subkutan direkt unter die Haut. Stellen Sie sicher, dass die Nadel nur hauttief ist, indem Sie eingeklemmte Haut loslassen, um eine Injektion in Muskelgewebe zu verhindern.
    5. Halten Sie die Nadel im 45°-Winkel vorsichtig injizieren 200 l der Zellsuspension, um eine kleine kugelförmige Masse zu schaffen (Abbildung 1C).
    6. Zeichnen Sie das Mausgewicht mit einer Skala auf, markieren Sie die Maus, und kehren Sie zum Käfig zurück.
    7. Überwachen Sie Mäuse nach der Sedierung, um sicherzustellen, dass sie wieder normal aktiv werden.
  5. Lesion Wachstumsüberwachung
    1. Messen Sie mit einem Bremssattel die Länge und Breite jedes Steckers (Abbildung 1D).
    2. Dokumentieren Sie Messungen jeden zweiten Tag bis zur Läsionsentnahme.

5. Gewebesammlung und -verarbeitung

  1. Euthanisieren Sie Mäuse 9 Tage nach der Implantation in einerCO2-Kammer und überprüfen Sie Vitalzeichen, um den Tod zu bestätigen. Führen Sie zervikale Dislokation an den Mäusen als sekundäre Methode zur Einschläferung der Maus durch.
  2. Ernten Sie die Xenograft-Läsion/Stecker von der Flanke der Maus durch Sezieren mit chirurgischen Zangen und Schere.
    HINWEIS: Um zu verhindern, dass die blutgefüllten Gefäße innerhalb des Steckers zerbrechen, ist es wichtig, das Berühren des Läsionssteckers mit Sezierwerkzeugen zu vermeiden und übermäßiges umgebendes Gewebe wie die Haut am Stecker zu belassen.
  3. Tauchen Sie die resezierte Läsion in PBS ein, um sie zu waschen.
  4. Richten Sie eine Kamerabühne mit einer Kamera ein. Richten Sie Stecker auf ein Schneidebrett mit einem Lineal aus. Nehmen Sie ein Bild von allen Steckern, um grobe Vaskularität von Läsionen aufzuzeichnen (Abbildung 1E).
  5. Fix Stecker durch Eintauchen in 10% formalin über Nacht bei RT.
  6. Am nächsten Tag Stecker in PBS waschen und in 70% Ethanol umwandeln.
  7. Prozessläsionsstecker zur Paraffineinbettung (Pathologiekern).

6. Läsionsschnitt

  1. Verwenden Sie ein Mikrotome, um 5 'm Abschnitte von den gesammelten murinen Läsionen auf positiv geladene Dias zu schneiden.
    HINWEIS: Für die anschließende Analyse sind Abschnitte in der Mitte des Steckers (ca. 50-u201270 m in das Gewebe) von Bedeutung.
  2. Paraffin bei 60 °C für 1 h vor der Färbung schmelzen.
  3. De-Paraffinisieren und rehydrieren Gewebe sequenziell unter einer chemischen Rauch-Flow-Haube. Daher inkubieren Sie Inkubationsschlitten in Xylol für 10 min, 100% Ethanol (EtOH) für 5 min, 90% EtOH für 3 min und 80% EtOH für 3 min.
  4. Spülen Sie in entionisiertem Wasser für 5 min.

7. Hämatoxylin und Eosin (H&E)

  1. Inkubieren Sie Abschnitte in Hämatoxylin für 2 min.
  2. Dias in ein Färbeglaschen geben und in einem Waschbecken durch einen stetigen Wasserstrom abspülen, bis das Wasser klar ist.
  3. Dehydratrutschen durch Sequenzielle in 70% EtOH für 1 min, 80% EtOH für 1 min, 90% EtOH für 1 min, 100% EtOH für 1 min und frisch 100% EtOH für 1 min.
  4. Fleckenabschnitte in Eosin Y für 30 s.
  5. Spülen Sie in frische 100% EtOH, bis die Lösung klar ist.
  6. Inkubationsrutsche in Xylolen für 2 min. Lassen Sie die Grolle trocken für 5-u201210 min unter der Dunstabzugshaube.
  7. Geben Sie einen Tropfen permanenten, nicht wässrigen Montagemedium über Xenografts Abschnitte und legen Sie Deckelschlappe auf der Oberseite.
  8. Lassen Sie Dias über Nacht trocknen, bevor Sie sich bildgeben.

8. Immunhistochemie

  1. Bereiten Sie den Antigen-Abrufpuffer (Tris-EDTA) vor, indem Sie 0,6 g Tris-Base und 1 ml 0,5 M EDTA bis 500 ml entionisiertes Wasser wiegen. Stellen Sie den pH-Wert auf 9,0 mit 1 M HCl ein. Fügen Sie 250 L Tween-20 hinzu.
  2. Inkubieren Sie deparaffinisierte Gewebedias (wie in Schritt 6.2-u20126.3) in einem Becher mit Antigen-Abrufpuffer, rührend auf einem Heizblock, für 20 min bei 95 °C.
  3. Becher aus Heizblock entfernen, Lösung auf 35 °C abkühlen lassen und dann 3 min in PBS waschen.
  4. Blockgewebeabschnitte in 5% normalem Pferdeserum in PBS für 30 min bei RT.
  5. Bereiten Sie eine biotinylierte Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) Arbeitslösung vor, indem Sie 20 g/ml biotinyliertes UEA-I in 5% normalem Pferdeserum in PBS verdünnen.
  6. Pipet 50-u2012100 l UEA-I Arbeitslösung pro Abschnitt und inkubieren für 1 h bei RT in einer Befeuchtungskammer.
  7. Schlitten zweimal in PBS für 3 min waschen.
  8. Quench-Diaabschnitte in 3% Wasserstoffperoxid für 5 min bei RT.
  9. Schlitten zweimal in PBS für 3 min waschen.
  10. Bereiten Sie 5 g/ml Streptavidin-Meerrettichperoxidase-konjugiert in 5% normalem Pferdeserum in PBS vor.
  11. Pipette 50-u2012100 l auf jedem Gewebeschlitten und inkubieren für 1 h bei RT in einer Befeuchtungskammer.
  12. Schlitten zweimal in PBS für 3 min waschen.
  13. Bereiten Sie die Lösung 3,3'Diaminobenzidin (DAB) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und fügen Sie 50'u2012100 l pro Abschnitt hinzu.
  14. Inkubieren Abschnitte für 10-u201215 min, Überprüfung und Überwachung für die Entwicklung von Flecken alle 2-u20125 min.
  15. Schlitten dreimal in PBS für 3 min waschen.
  16. Fügen Sie einen Tropfen Hämatoxylin hinzu und brüten Sie für 3 min.
  17. Dias in ein Färbeglaschen geben und in einem Waschbecken durch einen stetigen Wasserstrom abspülen, bis das Wasser klar ist.
  18. Sequenziell inkubieren Dia in 80% EtOH für 1 min, 90% EtOH für 1 min, 100% EtOH für 1 min, und Xylol für 2 min.
  19. Lassen Sie die Grolle trocken für 5-u201210 min unter der Dunstabzugshaube.
  20. Geben Sie einen Tropfen permanenten, nicht wässrigen Montagemedium über Xenografts Abschnitte und legen Sie Deckelschlappe auf der Oberseite.
  21. Lassen Sie Dias über Nacht trocknen, bevor Sie sich bildgeben.

9. Analyse von vom Menschen abgeleiteten Gefäßkanälen

HINWEIS: Die Vaskularität von VM-Läsionen wird durch Messung der Gefäßfläche und der Gefäßdichte quantifiziert. Nur UEA-I positive, vom Menschen abgeleitete Gefäßkanäle werden für die Quantifizierung berücksichtigt.

  1. Nehmen Sie vier bis fünf Bilder pro Läsionsabschnitt mit einem hellen Feldmikroskop bei einer 20-fachen Vergrößerung (Hochleistungsfelder [HPF]). Nehmen Sie HPF-Bilder in einem x-Ebenenmuster innerhalb des Läsionsabschnitts auf, um Überlappungen zu vermeiden (Abbildung 1F-H). Fügen Sie den aufgenommenen Bildern eine Maßstabsleiste bei.
  2. Öffnen Sie die HPF-Bilder in Bild J (Datei > Öffnen). Kalibrieren Sie die Pixel der Skalenleiste wie folgt. Verwenden Sie das gerade Linienwerkzeug, und gehen Sie über die Maßstabsleiste. Um die gemessenen Pixel in mm umzuwandeln, klicken Sie auf Analysieren > Maßstab festlegen.
  3. Klicken Sie auf Analysieren > Messungen festlegen und wählen Sie Bereich und Hinzufügen zu Overlay aus.
  4. Messen Sie die gesamte Feldfläche in einem HPF mit Analysieren > Messen. Speichern Sie diese Messung für die Quantifizierung in Schritt 9.8.
  5. Mit dem Freehand-Auswahl-Tool, manuell skizzieren UEA-I+ Vaskuläre Kanäle.
    HINWEIS: Ein Gefäßkanal ist definiert als jeder Bereich, der mit UEA-I+ - EC ausgekleidet ist, der Blutzellen enthalten kann.
  6. Klicken Sie auf Analysieren > Messen, um die umrissene UEA-I+ Gefäßfläche (mm2/HPF) zu quantifizieren.
  7. Wiederholen Sie diese Messung für alle fünf HPF, die innerhalb eines Steckers aufgenommen wurden.
  8. Durchschnittlich die gesamtvaskuläre Fläche aller fünf HPF. Die erhaltene Gefäßfläche pro HPF wird anschließend durch die HPF-Feldfläche (in mm2, Schritt 9.5) dividiert und als Prozent (%) ausgedrückt.
  9. Für die Quantifizierung der Gefäßdichte zählen Sie die Anzahl der UEA-I+ Gefäßkanäle jedes aufgenommenen HPF. Die Gefäßdichte ist die durchschnittliche Anzahl der UEA-I+ Gefäßkanäle, die pro HPF-Bereich gezählt werden (Gefäße/mm2).

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Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung eines murinen Xenograft-Modells von VM basierend auf der subkutanen Injektion von Patienten-abgeleiteten EC in den Rücken von immundefizienten Nacktmäusen. Endothelzellkolonien können innerhalb von 4 Wochen nach anfänglicher Zellisolierung aus VM-Gewebe oder Lesionalblut geerntet werden (Abbildung 1A,B). Am Tag nach der Injektion bedeckt der Xenograft-Läsionsstopfen eine Fläche von ca. 80-u2012100 mm2. In unseren Händen werden Läsionsstecke...

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Diskussion

Hier beschreiben wir eine Methode zum Generieren eines vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modells von VM. Dieses murine Modell stellt ein ausgezeichnetes System dar, das es Forschern ermöglicht, ein tieferes Verständnis der pathologischen Lumenvergrößerung zu gewinnen, und wird bei der Entwicklung wirksamerer und zielgerichteterer Therapien für die Behandlung von VM eine wichtige Rolle spielen. Dies kann leicht angepasst werden, um andere Arten von vaskulären Anomalien wie kapillare lymphatische venöse Fehlbildung

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Nora Lakes für das Korrekturlesen. Die in diesem Manuskript berichteten Forschungsergebnisse wurden vom National Heart, Lung, and Blood Institute unter der Award-Nummer R01 HL117952 (E.B.), einem Teil der National Institutes of Health, unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Athyme Nacktmäuse, (Foxn1-nu); 5-6 Wochen, MännchenEnvigo069(nu)/070(nu/+)Subkutane Injektion
Biotinyliertes Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)Vector LaboratoriesB-1065Histologische Analyse
Flaschenaufsatzfilter (500 ml; 0,2 & Mikro; M)Thermo Fisher974106Zellkultur
Rinderserumalbumin (BSA)BSAA7906-50MGZellkultur; Histologische Analyse
Calciumclorid-Dihydrat (CaCl2.2H2O)SigmaC7902-500G
Messschieber MessschieberElektronenmikroskopie Wissenschaften50996491Messung des Läsionspfropfens
CD31-konjugierte magnetische Kügelchen (Dynabeads)Life Technologies11155DEC-Trennung
Zellsieb (100 μ M)Greiner542000Zellkultur
Kollagenase ARoche10103578001Zellkultur
Konisches Röhrchen; Polypropylen (15 mL)Greiner07 000 241Zellkultur
Konisches Röhrchen; Polypropylen (50 mL)Greiner07 000 239Zellkultur
Coplin FärbeglasTed Pella21029Histologische Anlaysis
Deckglas (50 X 22 mm)Fisher Scientific12545EHistologische Analyse
DAB: 3,3'Diaminobenzidin Reagenz (ImmPACT DAB)Vector LaboratoriesSK-4105Histologische Analyse
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)Corning10-027-CVZellkultur
DynaMag-2Life Technologies12321DEC-Trennung
OhrlocherVWR10806-286Subkutane Injektion
EDTA (0,5 M, pH 8,0)Life Technologies15575-020Histologische Analyse
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (Basalmedium und Nahrungsergänzungsmittel)LonzaCC-3162Zellkultur
Eosin Y (auf Alkoholbasis)Thermo Scientific71211Histologische Analyse
EthanolDecon Labs2716Histologische Anlaysis
Fetales Kälberserum (FBS) , HyCloneGE HealthcareSH30910.03Zellkultur
Filterspitze 1.250 μ LMidSciAV1250-HMehrere Stufen
Filterspitze 20 μ LVWR10017-064Mehrere Stufen
Filterspitze 200 μ LVWR10017-068Mehrstufige
Formalin-gepufferte Lösung (10%)SigmaF04586zur Dissektion von Läsionspfropfen
(INCYTO; SKC FILMSDHCN015Zellkultur
Hämatoxylin-VektorHämatoxylinH-3401Histologische Analysen
Fibronektin-gereinigtes Protein im menschlichen Plasma (1 mg/ml)SigmaFC010-10MG
Wasserstoffperoxidlösung in der Zellkultur (30 % w/w)SigmaH1009Histologische Analyse
ImageJ SoftwareAnalyse
Isofluran, USPAkorn Animal Health59399-106-01Subkutane Injektion
Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4.7H2O)SigmaM1880-500GZellkultur
Basalmembran-Matrix (Phenolrot-frei; Corning356237Subkutane Injektion
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL)VWR87003-294EC Trennung
Objektträger Superfrost (75 mm x 25 mm)Fisher Scientific1255015-CSNadeln für histologische Analysen
, 26 G x 5/8 Zoll Sub-Q sterile NadelnBecton Dickinson (BD)BD305115Subkutane Injektion
Normal PferdeserumVector LaboratoriesS-2000Histologische Anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamin (100X)Corning30-009-CIZellkultur
Permanentes Einbettmedium (VectaMount)Vector LaboratoriesH-5000Histologische Anlaysis
Stößel Größe C, PlainThomas Scientific3431F55EC Isolierung
Phosphat gepuffert Kochsalzlösung (PBS)Fisher ScientificBP3994Zellkulturwaage
VWR65500-202Pipetten zur subkutanen Injektion
(10 ml)VWR89130-898
Serologische Pipetten für Zellkulturen (5 ml)VWR89130-896Zellkultur
Natriumcarbonat (Na2CO3)Sigma223530Zellkultur
Streptavidin, Meerrettichperoxidase, Konzentrat, für IHCVector LaboratoriesSA-5004Zellkulturspritze
(60ml)BD Biosciences309653Celkultur
SPRITZENFILTER (0,2 &Mikro; M)Corning431219Zellkulturspritzen
(1 mL mit Luer-Lock)Becton Dickinson (BD)BD-309628Subkutane Injektion
Mit Gewebekulturen behandelte Platte (100 X 20 mm)Greiner664160Zellkultur
Mit Gewebekulturen behandelte Platte (145X20 mm)Greiner639160Zellkultur
Gewebekulturen behandelte Platten (60 X 15) mmEppendorf30701119Zellkultur
Tris-Base (Trizma-Base)SigmaT6066Histologische Anlaysis
Trypan Blue Lösung (0,4 %)Life Technologies15250061Zellkultur
Trypsin EDTA, 1X (0,05% Trypsin/0,53mM EDTA)Corning25-052-ClZellkultur
Tween-20Biorad170-6531Histologische Anlaysis
Wheaton FlascheVWR16159-798Zellkultur
XyloleFisher ScientificX3P-1GALHistologische Analyse
Hämazytometer Serologische Mit

Referenzen

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